專(zhuān)利名稱(chēng)：含有枯草芽孢桿菌脂肪酶的洗滌劑組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的組合物和方法涉及從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)克隆的脂肪酶、編碼所述脂肪酶的多核苷酸以及其使用方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)前的衣物洗滌劑和/或織物護(hù)理組合物包括諸如表面活性劑、酶(蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纖維素酶)、漂白劑、助洗劑系統(tǒng)(builder system)、抑泡劑、懸污劑、去污齊U、熒光增白劑、軟化劑、分散劑、染料轉(zhuǎn)移抑制化合物、研磨劑、殺細(xì)菌劑和芳香劑之類(lèi)的活性成分的復(fù)雜組合。脂肪分解酶(包括脂肪酶和角質(zhì)酶)已被用于洗滌劑清潔組合物中，以通過(guò)水解甘油三酸酯產(chǎn)生脂肪酸來(lái)去除油潰。然而，清潔組合物中存在的表面活性劑和其它組分常常會(huì)抑制這些酶，干擾其除去油潰的能力。因此，需要可在清潔組合物的苛刻環(huán)境中起作用的脂肪酶和角質(zhì)酶。還需要有效進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)以便制造生物燃料、潤(rùn)滑劑以及其它合成和半合成烴的較為穩(wěn)健且有效的脂肪酶和角質(zhì)酶。優(yōu)選地，這些酶將利用天然存在或常用的原料，而且在合成反應(yīng)中不需要保護(hù)和去保護(hù)步驟，這些保護(hù)和去保護(hù)步驟會(huì)使合成變得復(fù)雜以及導(dǎo)致產(chǎn)生有毒廢產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明組合物和方法涉及從枯草芽孢桿菌克隆的脂肪酶A(LipA)。在一些實(shí)施方案中，LipA與細(xì)菌纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域的羧基末端融合。在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌纖維素酶是源自在位于荷蘭巴倫(Baam, The Netherland)的皇家荷蘭生物科技研究所培養(yǎng)物保藏中心(Central Bureau voor Schimme I cultures)以 CBS 670. 93 (稱(chēng)為 BCE103)保藏的芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株。在一些實(shí)施方案中，LipA通過(guò)可裂解連接物連接至BCE103纖維素酶。因此，在一些實(shí)施方案中，LipA不是融合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了重組枯草芽孢桿菌LipA多肽。在一些實(shí)施方案中，重組LipA多肽與SEQ ID NO :3的氨基酸序列具有80%至99%的同一性(例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的同一性)。在另外的實(shí)施方案中，重組LipA多肽是包含BCE103纖維素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，重組LipA融合蛋白與SEQ ID NO :4的氨基酸序列具有至少80%的同一性(例如80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性)。除非具體說(shuō)明，否則本文使用的術(shù)語(yǔ)LipA多肽涵蓋LipA融合蛋白以及缺少融合搭配物的成熟LipA多肽二者。在一些實(shí)施方案中，LipA多肽是在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。本發(fā)明還提供了表達(dá)載體，其包含以有效方式與啟動(dòng)子組合的編碼LipA多肽的多核苷酸。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，提供了洗滌劑組合物，其包含重組枯草芽孢桿菌LipA多肽。在一些實(shí)施方案中，重組LipA多肽與SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少80%的同一性(例如 80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的同一丨I"生)。在其它實(shí)施方案中，重組LipA多肽是包含BCE103纖維素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，重組LipA融合蛋白與SEQ ID NO :4的氨基酸序列具有至少80%的同一性(例如 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的同一性)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含表面活性劑(離子型或非離子型)。在一些實(shí)施方案中，表面活性劑包含選自如下的一者或多者十二烷基苯磺酸鈉、氫化椰油酸鈉、月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉、C12-14鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚硫酸鈉、C14-15鏈烷醇聚醚-4。在一些實(shí)施方案中，表面活性劑包含離子型表面活性劑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，離子型表面活性劑選自陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑以及它們的組合。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑是在8.0至10.0的pH值下配制。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑選自衣物洗滌劑、餐具洗滌劑和硬質(zhì)表面清洗劑。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑是以選自液體、粉末、顆粒狀固體和小片的形式。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在30°C至40°C的溫度下，LipA多肽在洗滌劑中具有酶活性。在相關(guān)的方面中，提供了洗滌劑組合物，其包含來(lái)自枯草芽孢桿菌的脂肪酶和表面活性劑，其中所述洗滌劑組合物在去除待清潔表面的油潰方面比不含該脂肪酶的洗滌劑組合物更有效。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶是LipA。在一些實(shí)施方案中，LipA多肽是包含BCE103纖維素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶包含與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶包含與SEQ ID NO :3或SEQ IDNO 4具有至少95%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶是重組脂肪酶。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶是在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的重組脂肪酶。在一些實(shí)施方案中，表面活性劑是離子型或非離子型表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，表面活性劑是一種或多種選自陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑以及它們的組合的表面活性劑。在一些實(shí)施方案中,表面活性劑包含一種或多種選自如下的表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉、氫化椰油酸鈉、月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉、C12-14鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚硫酸鈉和C14-15鏈烷醇聚醚-4。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑組合物是在約8. 0至約10. 0的pH值下配制。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑組合物是在約8. 2至約10. 0的pH值下配制。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑組合物選自衣物洗滌劑、餐具洗滌劑和硬質(zhì)表面清洗 齊U。在一些實(shí)施方案中，所述洗滌劑組合物的形式選自液體、粉末、顆粒狀固體和片。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑組合物在約30°C至約40°C的溫度下有效水解脂質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，與包含代替枯草芽孢桿菌脂肪酶的類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)脂肪酶變體M21L (LIP0MAX )的洗漆劑組合物相比較，所述洗滌劑組合物在水解C4到C16底物方面更有效。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑組合物還包含蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑組合物還包含枯草桿菌蛋白酶。在另一個(gè)方面，提供了水解表面上的污垢或污潰中存在的脂質(zhì)的方法，其包括使所述表面與包含重組LipA多肽和表面活性劑的洗滌劑組合物接觸。前一段落具體實(shí)施方式
和實(shí)例中的洗滌劑組合物適用于此目的。在另一個(gè)方面，提供了進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的方法，其包括使供體分子與包含重組LipA多肽的組合物接觸。在一些實(shí)施方案中，供體分子具有C4-16碳鏈。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，供體分子具有CS碳鏈。根據(jù)如下描述LipA組合物和方法的這些及其它方面將顯而易見(jiàn)。
具體實(shí)施例方式I.引言所描述的是涉及涉及從枯草芽孢桿菌克隆的脂肪酶A(LipA)的組合物和方法。這些組合物和方法部分基于以下觀察結(jié)果克隆并表達(dá)的LipA在存在洗滌劑組合物的情況下具有羧酸酯水解酶活性。LipA的這一特征使其特別適用于多種清潔應(yīng)用，在這些應(yīng)用中所述酶可在存在于洗滌劑組合物中的表面活性劑和其它組分的存在下水解脂質(zhì)。盡管LipA對(duì)多種天然和合成底物顯示出活性，但這種酶已顯示出對(duì)C4-C16底物的偏好，對(duì)CS底物具有峰值活性。這種特異性使得LipA特別適于水解短鏈甘油三酸酯以及適于進(jìn)行涉及短鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。II.定義在詳細(xì)描述本發(fā)明組合物和方法之前，為清楚起見(jiàn)定義了以下術(shù)語(yǔ)。未定義的術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)應(yīng)符合其本領(lǐng)域所使用的通常含義如本文所用，“羧酸酯水解酶”(E. C. 3. I. I)是指作用于羧酸酯的酶。如本文所用，“脂肪酶”、“脂酶”、“脂肪分解酶”、“脂肪分解多肽”或“脂肪分解蛋白”是指展現(xiàn)具有降解脂質(zhì)的能力(如降解甘油三酸酯或磷脂的能力)的酶、多肽或蛋白質(zhì)。脂肪分解酶可為例如脂肪酶、磷脂酶、酯酶或角質(zhì)酶。如本文所用，脂肪分解活性可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的任何程序確定(例如參見(jiàn)古樸塔(Gupta)等人，生物技術(shù)與應(yīng)用生物化學(xué)(Biotechnol Appl Biochem)，37 :63-71,2003 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，990，069 ;和國(guó)際公布號(hào)WO96/18729A1)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脂肪酸”是指源自動(dòng)物或植物脂肪或油或含于動(dòng)物或植物脂肪或油中的羧酸。脂肪酸由通常含有4-22個(gè)碳原子的烷基的鏈構(gòu)成，并以末端羧基(-C00H)為特征。脂肪酸可為飽和的或不飽和的，以及為固體、半固體或液體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“甘油三酸酯”是指脂肪酸與甘油形成的任何天然存在的酯。甘油三酸酯是脂肪和油的主要組分。其具有通式CH2 (OOCR1) CH(OOCR2) CH2 (OOCR3)，其中R1' R2和R3可具有不同鏈長(zhǎng)度。如本文所用，“酰基”是有機(jī)酸基團(tuán)(RC0-)的通用名，通常是通過(guò)移除羧酸的-OH基團(tuán)獲得。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“酰化”是指通常在-OH基團(tuán)側(cè)將?；脫Q/添加到分子中的化
學(xué)轉(zhuǎn)化。如本文所用，“?；湹孜铩笔囚人狨ニ?酶(例如角質(zhì)酶、脂肪酶、?；D(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)酯酶等)的供體分子。這種底物可就其碳鏈長(zhǎng)度進(jìn)行描述。例如，C4底物/供體具有4個(gè)碳的鏈長(zhǎng)度，CS底物/供體具有8個(gè)碳的鏈長(zhǎng)度等等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移酶”是指催化分子或基團(tuán)(例如酰基)轉(zhuǎn)移至底物的酶。如本文所用，“離去基團(tuán)”是指通過(guò)另一親核物質(zhì)取代時(shí)從?；w裂解的親核物質(zhì)。如本文所用，短語(yǔ)“洗滌劑穩(wěn)定性”是指洗滌劑組合物混合物中指定洗滌劑組合物組分(如水解酶)的穩(wěn)定性。如本文所用，“過(guò)水解酶”是能夠催化會(huì)導(dǎo)致形成適于諸如清潔、漂白和消毒之類(lèi)的應(yīng)用的過(guò)酸的反應(yīng)的酶。如本文所用，在短語(yǔ)“水性組合物”和“水性環(huán)境”中使用的術(shù)語(yǔ)“水性”是指由至少50 %的水構(gòu)成的組合物。水性組合物可含有至少50 %的水、至少60 %的水、至少70 %的水、至少80%的水、至少90%的水、至少95%的水、至少97%的水、至少99%的水或甚至至少99%的水。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”是指本領(lǐng)域通常認(rèn)識(shí)到的具有表面活性性質(zhì)的任何化合物。表面活性劑一般包括陰離子型、陽(yáng)離子型、非離子型和兩性離子型化合物，本文中將進(jìn)一步進(jìn)行描述。如本文所用，“表面性質(zhì)”用于指靜電荷，以及蛋白質(zhì)表面所展現(xiàn)的諸如疏水性和親水性之類(lèi)的性質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“氧化穩(wěn)定性”是指本發(fā)明脂肪酶在本文中公開(kāi)的脂肪分解、水解、清潔或其它處理期間(例如當(dāng)暴露于漂白劑或氧化劑或者與漂白劑或氧化劑接觸時(shí))常見(jiàn)的條件下，在給定時(shí)間段內(nèi)保留規(guī)定量的酶活性。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶在與漂白劑或氧化劑接觸指定時(shí)間段(例如至少約I分鐘、約3分鐘、約5分鐘、約8分鐘、約12分鐘、約16分鐘、約20分鐘等)后保留至少約50 %、約60 %、約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、約92 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %的脂肪分解活性。術(shù)語(yǔ)“螯合劑穩(wěn)定性”是指本發(fā)明脂肪酶在本文中公開(kāi)的脂肪分解、水解、清潔或其它處理期間(例如當(dāng)暴露于螯合劑或與螯合劑接觸時(shí))常見(jiàn)的條件下，在指定時(shí)間段內(nèi)保留指定量的酶活性。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶在與螯合劑接觸指定時(shí)間段(例如至少約10分鐘、約20分鐘、約40分鐘、約60分鐘、約100分鐘等)后保留至少約50%、約60%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 92%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%或約99%的脂肪分解活性。術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定性”和“熱穩(wěn)定度”是指本發(fā)明脂肪酶在本文中公開(kāi)的脂肪分解、水解、清潔或其它處理期間(例如當(dāng)暴露于改變的溫度時(shí))常見(jiàn)的條件下暴露于標(biāo)識(shí)溫度指定時(shí)間段后保留指定量的酶活性。變化的溫度包括增加或降低的溫度。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶在暴露于改變的溫度指定時(shí)間段(例如至少約60分鐘、約120分鐘、約180分鐘、約240分鐘、約300分鐘等)后保留至少約50 %、約60 %、約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、約92 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %的脂肪分解活性。術(shù)語(yǔ)“清潔活性”是指在本文中公開(kāi)的脂肪水解、水解、清潔或其它處理期間的常見(jiàn)條件下由脂肪酶實(shí)現(xiàn)的清潔性能。在一些實(shí)施方案中，清潔性能是通過(guò)應(yīng)用針對(duì)酶敏感性污潰(例如草、血、奶或蛋蛋白)的多種清潔測(cè)定法，在污潰經(jīng)歷標(biāo)準(zhǔn)洗滌條件后通過(guò)多種色譜法、分光光度法或其它定量方法測(cè)定。示例性的測(cè)定法包括(但不限于)WO99/34011和美國(guó)專(zhuān)利6，605，458 (將二者以引用的方式并入本文)中所述的測(cè)定法，以及實(shí)例中所包括的那些方法。術(shù)語(yǔ)脂肪酶的“清潔有效量”是指特定清潔組合物中實(shí)現(xiàn)所需水平酶活性的前文所述脂肪酶的量。這種有效量易于由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定并且依據(jù)許多因素，如所用的特定脂肪酶、清潔應(yīng)用、清潔組合物的具體組成以及需要液體組合物還是干燥(例如顆粒狀、條狀)組合物等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“清潔輔助材料”意指針對(duì)所需清潔組合物的特定類(lèi)型和產(chǎn)品的形式(例如液體、顆粒、粉末、條、糊狀物、噴霧、片、凝膠；或泡沫組合物)選擇的任何液體、固體或氣體材料，這些材料還優(yōu)選與組合物中使用的脂肪酶相容。在一些實(shí)施方案中，顆粒狀組合物為“緊湊(compact) ”形式，而在其它實(shí)施方案中，液體組合物為“濃縮”形式。如本文所用，“清潔組合物”和“清潔制劑”是指可用于從待清潔物品如織物、器皿、隱形眼鏡、其它固體表面、毛發(fā)、皮膚、牙齒等去除不期望的化合物(例如污垢或污潰)的化學(xué)成分的混合物。所述組合物或配方可視待清潔的表面、物品或織物以及組合物或制劑的所需形式而呈液體、凝膠、顆粒、粉末或噴霧形式。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“洗滌劑組合物”和“洗滌劑制劑”是指擬用于供清潔染污物體的洗滌介質(zhì)中的化學(xué)成分的混合物。洗滌劑組合物/制劑一般包含至少一種表面活性劑，并且可任選包含水解酶、氧化-還原酶、助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、上藍(lán)劑和熒光染料、抗結(jié)塊劑、掩蔽劑、酶活化劑、抗氧化劑和增溶劑。如本文所用，“餐具洗滌組合物”是指用于清潔餐具(包括刀叉餐具)的組合物的所有形式，包括(但不限于)顆粒和液體形式。在一些實(shí)施方案中，餐具洗滌組合物是可用于自動(dòng)洗碗碟機(jī)中的“自動(dòng)餐具洗滌”組合物。無(wú)意于使本發(fā)明局限于任何特定類(lèi)型或餐具 洗滌組合物。實(shí)際上，本發(fā)明可用于清潔任何材料(包括(但不限于)陶瓷、塑料、金屬、瓷器、玻璃、丙烯酸樹(shù)脂等)的餐具(例如器皿，包括(但不限于)盤(pán)子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀具(例如刀叉餐具，包括(但不限于)匙、刀、叉、服務(wù)用具等)。術(shù)語(yǔ)“餐具”在本文中用于指器皿和刀叉餐具二者。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“漂白”是指在適宜的pH和溫度條件下處理材料(例如織物、衣物、漿料等)或表面足夠長(zhǎng)的時(shí)間以實(shí)現(xiàn)材料變亮(即，變白)和/或清潔。適于漂白的化學(xué)品的實(shí)例包括(但不限于)C102、H2O2、過(guò)酸、NO2等。如本文所用，變體脂肪酶的“洗滌性能”是指變體脂肪酶對(duì)洗滌的貢獻(xiàn)，其為組合物中未添加變體脂肪酶的洗滌劑提供附加的清潔性能。洗滌性能是在相關(guān)的洗滌條件下比較。術(shù)語(yǔ)“相關(guān)的洗滌條件”在本文中用于指在家居中實(shí)際用于器皿或衣物洗滌劑市場(chǎng)部分中的條件，尤其是洗滌溫度、時(shí)間、洗滌力學(xué)、泡沫濃度、洗滌劑類(lèi)型和水硬度。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“消毒”是指去除表面的污染物以及抑制或殺死物品表面上的微生物。無(wú)意于本發(fā)明局限于任何特定的表面、物品或待去除的污染物或微生物。本文的清潔組合物的“緊湊”形式最佳由密度反映，就組成來(lái)說(shuō)，由無(wú)機(jī)填料鹽的量反映。無(wú)機(jī)填料鹽是呈粉末形式的洗滌劑組合物的常規(guī)成分。在常規(guī)洗滌劑組合物中，填料鹽是大量存在，通常為總組合物的約17重量％到約35重量％。相比之下，在緊湊組合物中，填料鹽以不超過(guò)總組合物的約15%的量存在。在一些實(shí)施方案中，填料鹽以不超過(guò)所述組合物的約10重量％，或更優(yōu)選不超過(guò)約5重量％的量存在。在一些實(shí)施方案中，無(wú)機(jī)填料鹽選自堿金屬和堿土金屬硫酸鹽和氯化物。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選填料鹽為硫酸鈉。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“紡織物”或“紡織材料”是指織造物，以及適于轉(zhuǎn)變成或用作紗線、機(jī)織材料、針織材料和非織造物的人造短纖維和細(xì)絲。該術(shù)語(yǔ)涵蓋由天然以及合成(例如制造的)纖維制成的紗線。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“純化”和“分離”是指以物理方式使對(duì)象分子(如LipA多肽)與其它分子(如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、培養(yǎng)基組分等)分離。一旦純化或分離，對(duì)象分子可占樣 品中材料總量的至少50 %，且甚至至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%或更高(重量比)。如本文所用，“多肽”是指包含多個(gè)通過(guò)肽鍵連接的氨基酸的分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用。蛋白質(zhì)可任選經(jīng)過(guò)修飾(例如糖基化、磷酸化、酰化、法尼基化、異戊烯化、磺酸化等)以增加功能性。當(dāng)這些氨基酸序列展現(xiàn)活性時(shí)，其可稱(chēng)為“酶”。使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母或三字母代碼，其中氨基酸序列是以標(biāo)準(zhǔn)的氨基至羧基末端取向(即N — C)給出。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”涵蓋DNA、RNA、異源雙鏈體和能編碼多肽的合成分子。核酸可為單鏈或雙鏈的，而且可為化學(xué)修飾物。術(shù)語(yǔ)“核酸”與“多核苷酸”可互換使用。由于遺傳密碼具有簡(jiǎn)并性，故可以使用不止一個(gè)密碼子來(lái)編碼特定氨基酸，并且本發(fā)明組合物和方法涵蓋編碼特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作說(shuō)明，否則核酸序列是以5'至3'取向提供。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“野生型”和“天然的”是指自然界中存在的多肽或多核苷酸。關(guān)于多肽的術(shù)語(yǔ)“野生型”、“親本”或“參考”是指不在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處包括人為制造的置換、插入或缺失的天然存在的多肽。類(lèi)似地，關(guān)于多核苷酸的術(shù)語(yǔ)“野生型”、“親本”或“參考”是指不包括人為制造的核苷改變的天然存在的多核苷酸。然而，應(yīng)注意，編碼野生型多肽、親本多肽或參考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵蓋編碼野生型多肽、親本多肽或參考多肽的任何多核苷酸。如本文所用，“變體多肽”是指通常利用重組DNA技術(shù)，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、添加或缺失而源于親本(或參考)多肽的多肽。變體多肽與親本多肽可能有少數(shù)氨基酸殘基不同，并且可通過(guò)其與親本多肽一級(jí)氨基酸序列的同源性/同一性水平來(lái)限定。優(yōu)選地，變體多肽與親本多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。序列同一性可使用諸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之類(lèi)的已知程序，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)測(cè)定。(參見(jiàn)例如沃茲查(Altschul)等人，(1990)分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol. 215 403-410);赫尼科夫(Henikoff)等人，(1989)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad.Sci.USA)89 :10915 ;卡林(Karin)等人，(1993)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，90 :5873 ;和海金斯(Higgins)等人(1988)基因(Gene) 73 :237-244)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過(guò)美國(guó)生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開(kāi)可用。還可使用FASTA(皮爾森(Pearson)等人(1988)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，85 =2444-2448)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)。兩個(gè)多肽實(shí)質(zhì)上一致的一個(gè)指示是第一多肽與第二多肽在免疫上交叉反應(yīng)。通常，因保守氨基酸置換而不同的多肽具有免疫交叉反應(yīng)性。因此，一種多肽與第二多肽實(shí)質(zhì)上一致，例如，在此情況下兩個(gè)多肽僅因保守置換而不同。如本文所用，“變體多核苷酸”編碼變體多肽；與親本多核苷酸具有指定程度的同源性/同一性；或在嚴(yán)格條件下與親本多核苷酸或其互補(bǔ)序列雜交。優(yōu)選地，變體多核苷酸與親本多核苷酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或甚至至少99 %的核苷酸序列同一性。測(cè)定同一性百分比的方法是本領(lǐng)域已知的并且上文剛進(jìn)行描述。術(shù)語(yǔ)“源自”涵蓋術(shù)語(yǔ)“來(lái)源于”、“從獲得”、“可由獲得”、 “分離自”和“由產(chǎn)生”，并且通常是指一種指定材料來(lái)源于另一指定材料或者具有可參照另一指定材料描述的特征。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜交”是指用于使一條核酸鏈通過(guò)本領(lǐng)域已知的堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈接合的方法。如本文所用，短語(yǔ)“雜交條件”是指進(jìn)行雜交反應(yīng)的條件。這些條件通常根據(jù)測(cè)量雜交的條件的“嚴(yán)格性”程度來(lái)分類(lèi)。嚴(yán)格性程度可例如基于核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)。例如，“最高嚴(yán)格性”通常在約Tm-5°C (比探針的Tm低5°C )下發(fā)生；“高嚴(yán)格性”通常在比Tm低約5至10°下發(fā)生；“中等嚴(yán)格性”通常在比探針Tm低約10到20°下發(fā)生；且“低嚴(yán)格性”通常在比Tm低約20到25°下發(fā)生。作為另一種選擇，或除此之外，雜交條件可基于雜交和/或一次或多次嚴(yán)格性洗滌的鹽或離子強(qiáng)度條件，例如6XSSC =極低嚴(yán)格性；3XSSC =低至中等嚴(yán)格性；1XSSC =中等嚴(yán)格性；且0. 5XSSC =高嚴(yán)格性。在功能上，可以使用最高嚴(yán)格性條件來(lái)鑒別與雜交探針具有嚴(yán)格的同一性或接近嚴(yán)格的同一性的核酸序列；而高嚴(yán)格性條件用于鑒別與探針具有約80%或更高序列同一性的核酸序列。對(duì)于需要高選擇性的應(yīng)用，通常需要使用相對(duì)嚴(yán)格的條件來(lái)形成雜交物(例如，使用相對(duì)較低的鹽和/或高溫條件)。如本文所用，嚴(yán)格條件定義為50°C和0. 2 X SSC (I X SSC =0. 15M NaCUO. 015M 檸檬酸鈉，pH7. 0)。在關(guān)于至少兩條核酸或多肽的上下文中，短語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上相似和實(shí)質(zhì)上相同”意指，多核苷酸或多肽包含與親本或參考序列具有至少約90%、至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或甚至至少約99%的同一性，或者不包括在不增加功能性的情況下僅為避開(kāi)本描述所作的氨基酸置換、插入、缺失或修飾的序列。如本文所用，“表達(dá)載體”是指DNA構(gòu)建體，其含有編碼指定多肽且有效連接至能夠?qū)崿F(xiàn)該多肽在合適的宿主中表達(dá)的合適控制序列的DNA序列。這種控制序列包括實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、控制這種轉(zhuǎn)錄的任選的操縱子序列、編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆粒或僅僅是潛在基因組插入物。一旦轉(zhuǎn)化進(jìn)適合宿主中，載體就可獨(dú)立于宿主基因組復(fù)制和發(fā)揮作用，或者在一些情況下可整合進(jìn)基因組本身中。
術(shù)語(yǔ)“重組”是指例如通過(guò)使編碼序列突變以產(chǎn)生該變的多肽、將編碼序列與另一基因的編碼序列融合、使基因處于不同啟動(dòng)子控制下、在異源生物體中表達(dá)基因、以降低或升高的水平表達(dá)基因、以不同于基因的天然表達(dá)譜的方式有條件地或組成地表達(dá)基因等，對(duì)遺傳物質(zhì)(即，核酸、核酸編碼的多肽以及包含這些多核苷酸的載體和細(xì)胞)進(jìn)行修飾以改變其序列或表達(dá)特征。一般說(shuō)來(lái)，重組核酸、多肽和基于它們的細(xì)胞已通過(guò)人進(jìn)行操縱使得其與自然界中存在的相關(guān)核酸、多肽和細(xì)胞不相同?！靶盘?hào)序列”是指結(jié)合至多肽的N端部分，并且促進(jìn)成熟形式的蛋白質(zhì)從細(xì)胞分泌的氨基酸序列。細(xì)胞外蛋白質(zhì)的成熟形式?jīng)]有信號(hào)序列，其在分泌過(guò)程期間被切除。術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記”或“可選標(biāo)記”是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)使得易于選擇含有所引入的核酸或載體的宿主的基因?？蛇x標(biāo)記的實(shí)例包括(但不限于)抗微生物物質(zhì)(例如潮霉素、博來(lái)霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細(xì)胞代謝益處(如營(yíng)養(yǎng)益處)的基因。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“調(diào)控元件”是指控制核酸序列表達(dá)的某一方面的遺傳元件。舉例來(lái)說(shuō)，啟動(dòng)子是促進(jìn)有效連接的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控元件。另外的調(diào)控元件包括剪 接信號(hào)、聚腺苷酸化信號(hào)和終止信號(hào)。如本文所用，“宿主細(xì)胞”一般為以使用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞能夠復(fù)制編碼蛋白質(zhì)變體的載體或者表達(dá)所需的蛋白質(zhì)變體。在載體編碼蛋白質(zhì)變體的前體蛋白或前原蛋白形式的情況下，這些變體在表達(dá)時(shí)通常由宿主細(xì)胞分泌到宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中。在將核酸序列插入細(xì)胞的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“引入”意指轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化的手段包括本領(lǐng)域已知的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、氯化鈣沉淀法、電穿孔法、裸DNA法等等。(參見(jiàn)常(Chang)和克汗(Cohen) (1979)分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)(Mol. Gen. Genet.), 168 111-115 ;史密斯(Smith)等人(1986)應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl. Env. Microbiol. )，51 634 ;和法拉利(Ferrari)等人所著的綜述文章,載于Harwood, Bacillus,派拉蒙出版公司(Plenum Publishing Corporation)，第 57-72 頁(yè)，1989)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可選標(biāo)記”或“可選擇基因產(chǎn)物”是指編碼酶活性的基因的使用，該酶活性給表達(dá)該可選標(biāo)記的細(xì)胞賦予抗生素或藥物抗性。其它科技術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同(例如參見(jiàn)辛格立頓(Singleton)和薩斯布雷(Sainsbury),微生物學(xué)與分子生物學(xué)詞典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology),第 2 版，約翰威立出版公司(John Wiley and Sons),紐約(1994);以及哈利(Hale)和馬哈姆(Marham),哈普柯林斯生物學(xué)詞典(The Harper Collins Dictionary of Biology),哈普派尼爾(HarperPerennial),紐約(1991))。除非文中另外明確說(shuō)明，否則單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括多個(gè)指示物。提供的小標(biāo)題是出于便利的目的，不應(yīng)解釋為限制。在一個(gè)小標(biāo)題下包括的描述可適用于本說(shuō)明書(shū)整體。III. LiDA多肽和多核苷酸A. LipA 多肽在一個(gè)方面，本發(fā)明組合物和方法提供了重組LipA多肽或其變體。示例性的LipA多肽是從枯草芽孢桿菌168分離的(GENBANK登錄號(hào)P37957)。成熟LipA多肽具有SEQ IDNO 3的氨基酸序列。類(lèi)似地，實(shí)質(zhì)上一致的LipA多肽可存在于自然界中，例如存在于枯草芽孢桿菌的其它菌株或分離株中。所公開(kāi)的LipA多肽也可與細(xì)菌纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域的羧基末端融合。例如，細(xì)菌纖維素酶可源自在位于荷蘭巴倫的皇家荷蘭生物科技研究所培養(yǎng)物保藏中心以CBS 670.93(稱(chēng)作此￡103)保藏的芽孢桿菌屬菌株。LipA多肽還可通過(guò)可裂解的連接物連接至BCE103纖維素酶。本發(fā)明組合物和方法涵蓋這些和其它重組LipA多肽。在一些實(shí)施方案中，重組LipA多肽是與實(shí)例性LipA多肽具有指定程度的氨基酸序列同源性，例如與SEQ ID NO :3的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同源性的變體LipA多肽。同源性可例如使用諸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之類(lèi)的程序(如本文中所述)，通過(guò)氨基酸序列比對(duì)來(lái)測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，重組LipA多肽包括不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響多肽的結(jié)構(gòu)和/或功能的置換。示例性的置換是保守置換，如表I中所概述的。
_5] 表I.氨基酸置換
初始?xì)埢山邮艿闹脫Q碼
丙氨酸 A D-Ala, Giy, P-AlaTL-Cys, D-Cys
權(quán)利要求
1.一種洗滌劑組合物，其包含 來(lái)自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的脂肪酶,和 表面活性劑， 其中所述洗滌劑組合物在去除待清潔表面的油潰方面比不存在所述脂肪酶的洗滌劑組合物更有效。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶為L(zhǎng)ipA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的洗滌劑組合物，其中所述LipA多肽是包含BCE103纖維素酶氨基末端片段的融合蛋白。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶包含與SEQIDNO :3或SEQ ID NO :4具有至少90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶包含與SEQIDNO :3或SEQID NO :4具有至少95%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶是重組脂肪酶。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶是在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的重組脂肪酶。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述表面活性劑是離子型或非離子型表面活性劑。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述表面活性劑是一種或多種選自陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑以及它們的組合的表面活性劑。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述表面活性劑包含一種或多種選自如下的表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉、氫化椰油酸鈉、月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉、C12-14鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚-7、C12-15鏈烷醇聚醚硫酸鈉和C14-15鏈烷醇聚醚-4。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其是在約8.0至約10. 0的pH下配制。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其是在約8.2至約10. 0的pH下配制。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑組合物選自衣物洗滌劑、餐具洗滌劑和硬質(zhì)表面清洗劑。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述組合物的形式選自液體、粉末、顆粒狀固體和片。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑組合物在約30°C至約40°C的溫度下有效水解脂質(zhì)。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑組合物在水解C4至C16底物方面比包含代替枯草芽孢桿菌脂肪酶的類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)脂肪酶變體M21L (LIP0MAX )的等同洗滌劑組合物更有效。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其還包含蛋白酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的洗滌劑組合物，其還包含枯草桿菌蛋白酶。
19.一種用于水解表面上的污垢或污潰中存在的脂質(zhì)的方法，其包括使所述表面與根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物接觸。
20.一種用于進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的方法，其包括使供體分子與根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的洗漆劑組合物接觸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述供體分子包含C4-C16碳鏈。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述供體分子包含CS碳鏈。
全文摘要
本發(fā)明的組合物和方法涉及從枯草芽孢桿菌克隆的脂肪酶、編碼所述脂肪酶的多核苷酸以及其使用方法。所述組合物和方法特別適用于洗滌劑清潔組合物和方法中。
文檔編號(hào)C11D3/386GK102712878SQ201080058419
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者B·施密特, C·亞當(dāng)斯 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司