一種制備固定化腺苷甲硫氨酸合成酶和腺苷甲硫氨酸的方法

專利名稱：一種制備固定化腺苷甲硫氨酸合成酶和腺苷甲硫氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的方法，以及采用制備的固定化 腺苷甲硫氨酸合成酶制備腺苷甲硫氨酸的方法，涉及酶固定化以及利用固定化酶催化合成 高價值化合物的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種重 要代謝中間體，1952年首先由Cantoni發(fā)現(xiàn)，相對分子質(zhì)量399。SAM是雙手性物質(zhì)，具有2 種異構(gòu)體(R，S)-SAM和(S，S)-SAM，只有(S，S)-SAM具有生物活性。在生物體內(nèi)，SAM是 由L-甲硫氨酸(L-Met)和三磷酸腺苷(ATP)經(jīng)腺苷甲硫氨酸合成酶催化合成。由于SAM 含有一個高能锍原子能激活相鄰碳原子的親核攻擊反應(yīng)，從而具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫基、轉(zhuǎn)氨丙 基等作用。SAM參與了體內(nèi)40多種生化反應(yīng)，與蛋白質(zhì)、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、磷脂質(zhì)和維生素的 合成密切相關(guān)，并連接多胺和谷胱甘肽的轉(zhuǎn)化。在歐洲，SAM已作為處方藥廣泛用于肝病、 抑郁癥、關(guān)節(jié)炎等疾病的治療；在美國，1999年FDA批準SAM作為保健品上市，在美國已成 為最暢銷的營養(yǎng)品之一；2000年我國開始進口，每年有1億多元的銷售，市場前景看好。目 前國內(nèi)使用的SAM主要是德國基諾(Knoll)和意大利RADIUM FARMAS. R. L. (IT)兩個外資 公司的產(chǎn)品，其價格昂貴，不能普及使用。我國人口眾多，有相當數(shù)量的肝病和關(guān)節(jié)炎患者， 且隨著城市生活節(jié)奏加快和工作壓力加大，抑郁癥患者明顯增多。同時SAM具有副作用小， 療效顯著等特點，在我國必將有著巨大的應(yīng)用前景。我國SAM的開發(fā)尚處于起步階段，市場 需求在不斷增長，但SAM售價昂貴。因此，建立廉價有效的生產(chǎn)工藝是SAM大規(guī)模推廣應(yīng)用 的關(guān)鍵。目前SAM制備方法主要有化學合成法、發(fā)酵法和酶促轉(zhuǎn)化法三種。1化學合成法目前，化學合成法制備SAM主要有三條途徑①利用5’ -甲硫腺苷和DL-2-氨 基-4-溴丁基酸化學合成消旋的SAM，合成的SAM 50%具有生物活性；②通過S-腺苷同型 半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)和甲基供體CH3I或CH3) 3SI催化合成。但反應(yīng) 底物SAH價格昂貴，而且產(chǎn)物中也含有20-30%沒有生物活性的(R，S)-SAM異構(gòu)體；③以價 格低廉的腺苷(adenosine)為底物和亞硫酰氯(thionyl chloride)進行反應(yīng)制備5_(氯 甲基)腺苷鹽酸鹽(5' -chloromethyl adenosine hydrochloride)；以 L-甲硫氨酸為底 物在_30°C至_40°C的條件下生成L-同型半胱氨酸(L-homocysteine)；以5-(氯甲基)腺 苷鹽酸鹽和L-同型半胱氨酸為底物在70°C至80°C的條件下進行縮合反應(yīng)得到S-腺苷同 型半胱氨酸(SAH)；以三甲基氧鐺四氟硼酸鹽(trimethyloxonium tetrafluoroborate)為 甲基供體對SAH進行甲基化得到終產(chǎn)物SAM。盡管該方法原料價格低廉，但是反應(yīng)過程復 雜，反應(yīng)溫度極端，反應(yīng)周期長，并且反應(yīng)產(chǎn)物僅有60% 65%具有生物活性。由于化學法 合成SAM存在產(chǎn)率低、反應(yīng)條件苛刻、反應(yīng)產(chǎn)物異構(gòu)體多、分離純化困難以及環(huán)境污染等不 足，現(xiàn)已很少使用。
2微生物發(fā)酵法微生物發(fā)酵法是20世紀60年代至今工業(yè)化生產(chǎn)SAM的主要途徑。一些微生物尤 其是酵母屬(Saccharomyces)的一些菌株，在含有L-甲硫氨酸的培養(yǎng)基中生長時，可以在 細胞內(nèi)積累較高濃度的SAM。通過這些微生物的大規(guī)模發(fā)酵，然后提取精制，獲得有生物活 性的SAM。但發(fā)酵法的缺點是終產(chǎn)物積累量低、原料轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)周期長以及純化工藝復 雜等，從而導致了其價格居高不下，限制了 SAM的廣泛生產(chǎn)及應(yīng)用。發(fā)酵法主要是采用在酵 母菌培養(yǎng)基中添加L-甲硫氨酸發(fā)酵生產(chǎn)SAM，是60年代至80年代生產(chǎn)SAM的主要方法。釀 酒酵母屬(Saccharomyces)的一些自然菌種在相對大量的L-甲硫氨酸存在條件下，便能夠 在細胞內(nèi)催化ATP與L-甲硫氨酸反應(yīng)合成SAM。Shiozaki等通過篩選300多株不同的菌株， 分離到一株清酒酵母(Saccharomycessake k_6)，在IOml培養(yǎng)基小量發(fā)酵產(chǎn)出1. 55g/L的 SAM。進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，該菌在IOL發(fā)酵罐中培養(yǎng)7d后SAM產(chǎn)量高達10. 8g/L (Shiozaki S，Shimizu S, Yamada H. JBiotechnol，2006，24 (6) :345_354·)。He 等向畢赤酵母中插入 外源的腺苷甲硫氨酸合成酶基因SAM2，同時敲除SAM分解代謝途徑中的β -胱硫醚合成酶 基因，通過超表達SAM2和切斷SAM的代謝途徑，使SAM產(chǎn)量比起始菌株提高了 56倍。優(yōu)化 發(fā)酵條件，最終搖瓶中SAM的最高產(chǎn)量達3. 6g/L，5L發(fā)酵罐中SAM產(chǎn)量達13. 5g/L(He J， Deng J, Zheng Y, etal. Journal of Biotechnology,2006,126(4) :519_527)。Appling 等 構(gòu)建了由亞甲基四氫葉酸還原酶和腺苷甲硫氨酸合成酶組成的嵌合基因，轉(zhuǎn)化釀酒酵母表 達 SAM，使 L-甲硫氨酸的轉(zhuǎn)化率提高到 40% (Appling ；Dean R. United States Patent 7，033，815)；盡管發(fā)酵法生產(chǎn)SAM的技術(shù)在不斷改進，但是發(fā)酵法存在以下幾個固有和難 以解決的問題(1).底物L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化率低；(2).發(fā)酵產(chǎn)物為(-)SAM和(+)SAM的混 合物，而具有生物活性的㈠SAM僅占70%左右，并且(-)SAM和⑴SAM難以分離；(3).酵 母菌發(fā)酵周期長(3-5天)，需要消耗大量的能源；(4).酵母菌破碎后的SAM溶液成分復雜， SAM提取純化工藝繁多，所以導致SAM回收率較低。3酶促轉(zhuǎn)化法酶促轉(zhuǎn)化法與化學合成法和發(fā)酵法相比，具有底物轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)物積累量高、分離 提純?nèi)菀?、反?yīng)周期短及環(huán)境友好等優(yōu)點，因而是較為有效的工業(yè)化生產(chǎn)方法。酶促轉(zhuǎn)化法 主要利用腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L-甲硫氨酸和ATP生成(-)SAM，酶促反應(yīng)如下式所 示L-Methionine+ATP+H20+E — [Ε · SAM · PPPi] — E+SAM+Pi+PP然而腺苷甲硫氨酸合成酶在動物、植物和微生物中含量少、酶活低、且分離純化困 難，因此通過酶促轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)SAM受到腺苷甲硫氨酸合成酶活力的限制，因此酶促轉(zhuǎn)化法 生產(chǎn)SAM的關(guān)鍵問題就是要得到大量高活性的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶?；蚬こ痰陌l(fā) 展使獲得大量高活性的腺苷甲硫氨酸合成酶成為可能，我們課題組構(gòu)建了高效表達腺苷甲 硫氨酸合成酶的重組大腸桿菌，重組菌的酶活性比原始菌提高了 157倍(牛衛(wèi)寧；左曉佳； 丁焰等，精細化工 2009,26 288-292)。目前，文獻報道的酶促轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)SAM所使用的腺苷甲硫氨酸合成酶均為游離 酶，Park等研究發(fā)現(xiàn)在800mmol/L pTsONa存在的條件下，大腸桿菌腺苷甲硫氨酸合成酶可 以將 30mmol/L 的 L-甲硫氨酸在 8h 內(nèi)完全轉(zhuǎn)化(Park JjJunzhe Tai, Roessner C A，et al Bioorg Med Chem，1995，5 (19) :2203 2206)；關(guān)晶華等在450L的生物反應(yīng)罐中使用大腸桿菌腺苷甲硫氨酸合成酶游離酶催化合成SAM，反應(yīng)8h后SAM的收率達到87%左右(關(guān)晶 華；許曉；陳新玲等，中國醫(yī)藥導報2009，6 28-30)；席玥在畢赤酵母中表達了 SAM2，在50L 發(fā)酵罐中誘導表達5d后，SAM2表達量達到2. 49g/L，占到菌體總可溶性蛋白的20%左右， 破碎細胞提取粗酶液催化合成SAM，反應(yīng)8h可以將約20mmol/L的L-甲硫氨酸幾乎完全轉(zhuǎn) 化(席玥.酶法生產(chǎn)S-腺苷甲硫氨酸的研究[D].吉林吉林大學，2005)。未見使用固定 化腺苷甲硫氨酸合成酶催化合成SAM的報道。與游離酶催化相比，固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不穩(wěn)定 性，具有可反復或連續(xù)使用、易與反應(yīng)產(chǎn)物分離等顯著優(yōu)點，酶的利用效率高、可連續(xù)操作 及自動化控制、工藝簡便、生產(chǎn)成本低等一系列優(yōu)點。在工業(yè)化生產(chǎn)中，固定化酶載體通常 采用強度較高的氨基樹脂載體或者環(huán)氧載體。這兩種樹脂載體性質(zhì)非常穩(wěn)定，適宜長期運 輸、儲存及酶與載體長時間反應(yīng)，載體均表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性。但是我們在研究中發(fā)現(xiàn)使用 環(huán)氧樹脂固定化的腺苷甲硫氨酸合成酶沒有催化活性，可能是因為樹脂的環(huán)氧基團和酶催 化中心的氨基酸發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而導致酶失活。而氨基樹脂固定化腺苷甲硫氨酸合成酶 的蛋白固定率以及酶活性回收率均較高，是固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的理想載體。

發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術(shù)問題為了避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提出一種制備固定化腺苷甲硫氨酸合成酶 的方法，以及采用制備的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶制備腺苷甲硫氨酸的方法。本發(fā)明的思想在于首先，對重組腺苷甲硫氨酸合成酶進行固定化，然后通過固定 化酶催化底物DL-甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸。固定化酶作為催化 劑，便于酶的回收和重復使用、提高酶的穩(wěn)定性、可連續(xù)操作及自動化控制、工藝簡便，從而 大幅度降低腺苷甲硫氨酸的生產(chǎn)成本，涉及酶固定化以及利用固定化酶催化合成高價值化 合物的技術(shù)領(lǐng)域。技術(shù)方案一種固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的制備方法，其特征在于步驟如下步驟1 將氨基樹脂載體S印lite LX-1000HA與1 5%的戊二醛溶液交聯(lián)2 IOh ；步驟2 將步驟1經(jīng)過戊二醛交聯(lián)的氨基樹脂載體與重組腺苷甲硫氨酸合成酶溶 液在20 35°C下反應(yīng)10 25h，得到固定化腺苷甲硫氨酸合成酶；所述重組腺苷甲硫氨酸 合成酶與氨基樹脂載體S印lite LX-1000HA的比例為5 40mg/g樹脂。所述重組腺苷甲硫氨酸合成酶是將來源于大腸桿菌的腺苷甲硫氨酸合成酶基因 經(jīng)大腸桿菌表達得到的腺苷甲硫氨酸合成酶。所述重組腺苷甲硫氨酸合成酶與氨基樹脂載體S印lite LX-1000HA的比例為 20mg/g 樹脂。一種利用上述任一種固定化腺苷甲硫氨酸合成酶生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的方法，其特 征在于步驟如下步驟1 配制固定化腺苷甲硫氨酸合成酶催化生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的反應(yīng)液，反應(yīng) 液組成如下:Tris 1 OOmmo 1. L_l、三磷酸腺苷10 30mmol. L-UDL-甲硫氨酸25 75mmol.L-I、氯化鉀IOOmmol. L-1、硫酸鎂20 60mmol. L-1和對甲基苯磺酸鈉400 800mmol. L-I, 溶解后調(diào)pH值至6. 0 8. 0 ；步驟2 固定化腺苷甲硫氨酸合成酶裝柱，在35°C下將反應(yīng)液以1. 0 4. 0倍柱床 體積/小時的流速過柱，收集流出液，得到腺苷甲硫氨酸溶液。有益效果本發(fā)明提出的制備固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的方法，以及采用制備的固定化腺 苷甲硫氨酸合成酶制備腺苷甲硫氨酸的方法，有益效果如下本發(fā)明使用氨基樹脂制備固 定化腺苷甲硫氨酸合成酶，固定化酶的酶活力回收率較高，穩(wěn)定性和裝柱后連續(xù)操作性能 優(yōu)良，便于連續(xù)化生產(chǎn)，且反應(yīng)產(chǎn)物組成簡單穩(wěn)定易于控制，降低了 SAM的后續(xù)純化成本; 與游離重組腺苷甲硫氨酸合成酶相比，本發(fā)明制備的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的穩(wěn)定性 得到較大幅度的提高，并具有良好的操作穩(wěn)定性，固定化酶的連續(xù)化操作可以節(jié)約酶的用 量，還可實現(xiàn)酶與反應(yīng)液的分離，大幅度降低生產(chǎn)成本并提高生產(chǎn)效率。另外，本發(fā)明解決了目前酵母菌發(fā)酵法生產(chǎn)SAM中存在的生產(chǎn)周期長、能源消耗 大、底物轉(zhuǎn)化率低、酵母菌破碎后成分復雜、提取方法繁瑣以及產(chǎn)品回收率低等問題；同時 也解決了游離腺苷甲硫氨酸合成酶催化合成SAM中存在的游離酶穩(wěn)定性差、活性損失大、 不適合連續(xù)化操作以及酶與反應(yīng)液分離難度大等問題，固定化腺苷甲硫氨酸合成酶應(yīng)用于 SAM的生產(chǎn)不僅節(jié)約了酶制劑，而且簡化了后續(xù)分離過程。因此，本發(fā)明為SAM的工業(yè)化生 產(chǎn)提供了 一條新的途徑，具有巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。
具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例的材料和方法1、細胞和試劑大腸桿菌K12、大腸桿菌JM109、大腸桿菌表達質(zhì)粒pBR322均為本室保存，也可以 購買得到；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自北京博大泰克公司。T4DNA連接酶、 Taq DNA聚合酶和各種限制性內(nèi)切酶、Protein Marker購自Takara公司。Phenyl-S印harose Fast Flow預裝柱購自GE公司，腺苷甲硫氨酸標準品購于Sigma公司，用于固定化酶的氨基 樹脂載體Seplite LX-1000HA購自西安藍曉科技有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析 純。大腸桿菌工程菌，攜帶有編碼野生型大腸桿菌K12腺苷甲硫氨酸合成酶基因。使 用PCR方法以大腸桿菌K12基因組DNA為摸板擴增得到腺苷甲硫氨酸合成酶基因，將該基 因連接到表達載體PBR322中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中進行表達，腺苷甲硫氨酸合成酶基 因的表達受到其自身啟動子的調(diào)控。所用T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶均購自Takara公司。質(zhì)粒DNA 抽提試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自北京博大泰克公司。其它所有 試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。2、培養(yǎng)基液體LB/Tet培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨；5g/L酵母粉；10g/L NaCl ；15 μ g/ml四環(huán)素 鹽酸鹽)。將蛋白胨、酵母粉和NaCl用去離子水溶解后調(diào)節(jié)pH = 7. 0，在121°C滅菌20分鐘，然后在接種時加入四環(huán)素鹽酸鹽，使其終濃度為15μ g/ml。固體LB/Tet培養(yǎng)基在液體LB/Tet培養(yǎng)基中加入1. 5%的瓊脂，即制成固體瓊脂
平板培養(yǎng)基。3、常規(guī)分子生物學操作大腸桿菌基因組DNA的提取、腺苷甲硫氨酸合成酶基因的PCR擴增、基因表達等技 術(shù)參照精編分子生物學實驗指南(奧斯伯等.1995)進行。高效表達腺苷甲硫氨酸合成酶的重組大腸桿菌的發(fā)酵構(gòu)建高效表達腺苷甲硫氨酸合成酶的重組大腸桿菌已經(jīng)在我們課題組發(fā)表的論 文中公開(牛衛(wèi)寧；左曉佳；丁焰等，精細化工2009，26 288-292)。在固體LB/Tet平板上挑取單克隆，然后接入5ml液體LB/Tet培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng) 16小時(220轉(zhuǎn)/分鐘)。將上述菌液轉(zhuǎn)接到2L液體LB/Tet培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)16小時 (280轉(zhuǎn)/分鐘)，使菌體生長達到穩(wěn)定期。該重組大腸桿菌也可以在15-38°C的條件下進行培養(yǎng)表達腺苷甲硫氨酸合成酶。 當在15°C條件下進行培養(yǎng)，細胞生長到穩(wěn)定期需要超過30小時，而且腺苷甲硫氨酸合成酶 的表達量較低，酶活性為野生大腸桿菌的8倍左右；當在38°C條件下進行培養(yǎng)，細胞生長到 穩(wěn)定期僅需要8小時左右，但是表達的重組腺苷甲硫氨酸合成酶形成的包涵體較多，酶活 性為野生大腸桿菌的58倍左右；當在30°C條件下進行培養(yǎng)時，經(jīng)過16小時左右細胞就能 生長達到穩(wěn)定期，并且表達的腺苷甲硫氨酸合成酶活性最高，經(jīng)測定為大腸桿菌K12腺苷 甲硫氨酸合成酶活性的150多倍。所以重組大腸桿菌表達腺苷甲硫氨酸合成酶在30°C條件 下為最佳。將培養(yǎng)后的菌液進行離心，轉(zhuǎn)速為6000rpm，離心10分鐘，棄去上清液，收集沉淀 的菌體用于后續(xù)試驗。重組腺苷甲硫氨酸合成酶的純化(1)粗提取1L培養(yǎng)液通過離心收集細胞，清洗后用IOOmL裂解液(IOOmmol/ LTris-HCl, pH 8. 0)在冰水浴中超聲波(300W，超聲3s，間隔5s)處理12min破碎細胞，破 碎液在4°C下lOOOOr/min，離心30min，上清液即為粗酶液。(2)硫酸銨分級鹽析粗酶液中加入終濃度為40%的硫酸銨進行鹽析。鹽析時 緩慢加入硫酸銨并充分攪拌溶解，10000r/min離心20min分離沉淀和可溶組分，沉淀用 IOOmmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解并加入(NH4) 2S04 至終濃度為 0. 75mol/L，0. 22um 的濾 膜過濾溶液備用。(3)Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水層析將上述(NH4)2S04沉淀的蛋白溶液加 入到經(jīng) Buffer A (Tris-HCl 50mmol/L, EDTA_Na2 2mmol/L, (NH4) 2S04 0. 75mol/L, pH8. 0) 預平衡的Phenyl-S印harose Fast Flow柱，流速lml/min洗脫至基線。然后使用Buffer B (Tris-HCl 50mmol/L, EDTA-Na2 2mmol/L, pH 8.0)直接洗脫得到腺苷甲硫氨酸合成酶溶 液，收集備用。純化的腺苷甲硫氨酸合成酶的酶活為32 μ /mg,純化倍數(shù)3. 3倍，酶活總得率 73%。氨基樹脂S印lite LX-1000HA固定化腺苷甲硫氨酸合成酶取氨基樹脂Ig于三角瓶中，加入pH = 3. 0的lmol/L乳酸-乳酸鈉緩沖液浸泡2h 活化載體。后傾去緩沖液，除去懸浮于液體中的樹脂碎渣等雜志。加入50%戊二醛l.OmL，
7加入去離子水至體積為25mL，使終濃度為2%，室溫下放置5h，期間每隔20min輕輕震蕩數(shù) 次，然后用去離子水洗3次，再用緩沖液淋洗2次，后加入IOmL pH = 7的2mg/mL腺苷甲硫 氨酸合成酶液，使m(腺苷甲硫氨酸合成酶)m(氨基樹脂)為1 50。輕輕搖晃數(shù)次， 置于室溫中(20-35°C )，每隔Ih取出輕輕震蕩數(shù)次，持續(xù)15h，棄去上清液，去離子水淋洗3 次，得到固定化腺苷甲硫氨酸合成酶。在制備固定化腺苷甲硫氨酸合成酶過程中，氨基樹脂載體和戊二醛的交聯(lián)時間隨 著戊二醛的濃度改變而改變。在氨基樹脂載體S印lite LX-1000HA與1 5%的戊二醛溶液的組分配中進行選 擇，反應(yīng)時間在2 IOh選擇；以上述實施例為基準，戊二醛濃度升高5%，交聯(lián)反應(yīng)時間就 可以縮短為2h ；戊二醛濃度反應(yīng)時間需要延長至10h，隨著戊二醛濃度的增高，樹脂上 的氨基能夠更快地被醛基交聯(lián)飽和。腺苷甲硫氨酸合成酶被戊二醛交聯(lián)的氨基載體固定化 的反應(yīng)溫度為20-35°C，反應(yīng)時間為15h，在20-35°C的溫度范圍內(nèi)腺苷甲硫氨酸合成酶的 蛋白固定率、酶活回收率以及固定化酶活性差別不大。溫度低于20°C反應(yīng)速度過慢，溫度高 于35°C會加速腺苷甲硫氨酸合成酶的失活。重組腺苷甲硫氨酸合成酶與氨基樹脂載體S印lite LX-1000HA的比例為5_40mg/ g樹脂，優(yōu)選為20mg/g樹脂。當與氨基樹脂載體反應(yīng)的腺苷甲硫氨酸合成酶的量較低時， 樹脂表面的醛基不能被酶分子所飽和，隨著酶濃度的增加樹脂表面基團逐漸被飽和，固定 化酶的單位酶活在逐漸提高，當氨基載體與酶的比例超過20mg/g時，固定化酶的單位酶活 趨于穩(wěn)定，上升緩慢，而總酶活回收率下降較快，表明樹脂已經(jīng)基本被酶分子所飽和。當氨 基載體與酶的比例為5mg/g時，蛋白固定率為95.7%，酶活回收率為85.3%，固定化酶的單 位酶活為130. 6U/g樹脂；當氨基載體與酶的比例為20mg/g時，蛋白固定率為85. 2%，酶活 回收率為76. 4%，固定化酶的單位酶活為416. 6U/g樹脂；當氨基載體與酶的比例為30mg/ g時，蛋白固定率為73. 7%，酶活回收率為57. 1%，固定化酶的單位酶活為404. OU/g樹脂。 當氨基載體與酶的比例為40mg/g時，蛋白固定率為61. 3%，酶活回收率為47. 6%，固定化 酶的單位酶活為373. 5U/g樹脂。因此，優(yōu)選氨基載體與酶的比例為20mg/g。固定化腺苷甲硫氨酸合成酶活性的測定在3ml 的反應(yīng)體系(100mmol/L TrisU00mmol/L KCl、2mmol/L MgSO4Ummol/ LL-MetUmmol/L ΑΤΡ、0. 5%的β-巰基乙醇，pH 8.5)中加入適量固定化腺苷甲硫氨酸合 成酶進行反應(yīng)，37°C下溫育Ih后，離心去除固定化酶，然后加入ω (三氯乙酸)=10%的 水溶液終止反應(yīng)，離心除去沉淀。以不加酶液的反應(yīng)液做空白對照。反應(yīng)上清液用高效液 相色譜(HPLC)進行分析，色譜條件為色譜柱Kromasil C18 (5 μ m,4. 6X250mm)；檢測波長 260nm ；流動相(在900mL純水中加入40mmol乙酸鈉和50mL甲醇，使用乙酸溶液調(diào)pH 4. 6， 定容至1L)；流速0.6mL/min。產(chǎn)物腺苷甲硫氨酸(SAM)的保留時間約為8min，底物ATP的 保留時間約為5. 5min。使用SAM標準品制作色譜峰峰面積和SAM質(zhì)量濃度之間的標準曲 線，計算樣品中SAM的質(zhì)量濃度。酶活力單位定義為在上述反應(yīng)條件下，37°C，lh催化形 成Ιμπιο SAM所需要的酶量為1個活力單位(Iu)。游離腺苷甲硫氨酸合成酶活性測定和 固定化酶活性測定方法一致，將固定化酶換成游離酶即可。固定化酶酶活性回收率=固定化酶酶活/被固定化的游離酶酶活Χ100%。固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的酶學性質(zhì)
研究了固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的酶學特性，包括固定化酶的最適反應(yīng)溫度以 及溫度穩(wěn)定性、固定化酶的最適PH以及PH穩(wěn)定性、固定化酶的米氏常數(shù)等性質(zhì)，同時比較 了固定化酶與游離酶的酶學性質(zhì)。(1)固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性取一定量固定化酶和游離酶分別在不同溫度(20 55°C)下催化反應(yīng)5h，測定酶 活性，研究溫度對酶催化反應(yīng)的影響，固定化酶活性測定方法同實施例4。研究發(fā)現(xiàn)固定化 酶的最適溫度為45°C，當溫度升高至55°C時固定化酶活性為最大酶活性的58% ；而游離酶 的最適反應(yīng)溫度為40°C，當溫度升高至55°C時游離酶的活性已經(jīng)檢測不到。固定化腺苷甲 硫氨酸合成酶的最適反應(yīng)溫度提高了 5°C，固定化酶活力隨溫度的變化曲線較游離酶平緩， 說明固定化酶對溫度的適應(yīng)性增強，擴大了固定化酶的應(yīng)用范圍。取一定量的固定化酶和游離酶分別在20 55°C下保溫10h，測定酶的殘余活性。 結(jié)果表明固定化酶的熱穩(wěn)定性較好，在45°C保溫IOh還殘余63%的活性，在55°C保溫IOh 還殘余58. 8%的活性；而游離酶在45°C保溫IOh僅殘余19%的酶活性，在50°C保溫IOh檢 測不到活性。固定化酶的溫度耐受性得到了大幅度的提高。(2)固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的最適pH和pH穩(wěn)定性取一定量固定化酶和游離酶分別在pH5 10條件下反應(yīng)lh，測定產(chǎn)物SAM的生成 量，計算酶活性。結(jié)果表明固定化酶的最適PH為9，而游離酶的最適pH為8. 5 ；固定化酶在 PH = 6的條件下酶活性為最高酶活性的62. 1%，游離酶在pH = 6的條件下酶活性僅為最 高酶活性的23. 6% ；固定化酶在pH = 10的條件下酶活性為最高酶活性的85. 4%，游離酶 在PH = 10的條件下酶活性為最高酶活性的54. 7% ；因此，固定化酶的最適pH為游離酶有 所提高，固定化酶對反應(yīng)液PH變化的適應(yīng)性增強。取一定量固定化酶和游離酶分別在pH5 10條件下保溫10h，結(jié)果表明，固定化酶 的PH穩(wěn)定性得到了大幅度的提高，固定化酶在pH = 6的條件下保存10h，酶活性為最高酶 活性的76. 8%，而游離酶僅為4. 7% ；固定化酶在pH = 9的條件下保存10h，酶活性為最高 酶活性的87. 8%，而游離酶僅為41.3%。固定化酶在pH5 10的保存條件下穩(wěn)定性比游 離酶得到了大幅度的提高。(3)固定化腺苷甲硫氨酸合成酶動力學常數(shù)的測定以不同濃度的L-Met和ATP分別與一定量的固定化酶或者游離酶反應(yīng)，利用HPLC 測定產(chǎn)物SAM的量，并計算其反應(yīng)速度。采用雙倒數(shù)作圖法確定Km及Vmax值。研究結(jié)果表明固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的Knfit為0. 28mmol/L, VmaxL-Met為 0. 48mmol/(L h)，KmATP 為 0. 14mmol/L, VmaxATP 為 0. 55mmol/(L h)；而游離酶的 Κι "^ 為 0. 22mmol/L，VmaxLit 為 L 07mmol/(L h)，KmATP 為 0. 52mmol/L, VmaxATP 為 1. 05mmol/(L h)。 結(jié)果表明固定化腺苷甲硫氨酸合成酶對底物L-甲硫氨酸的親和力略低于游離酶，這可能 是因為腺苷甲硫氨酸合成酶被固定化后產(chǎn)生了空間立體障礙和擴散阻力，導致固定化酶的 KmL-Met有所增大；而固定化酶對底物ATP的親和力大于游離酶，導致固定化酶的KmATP減小， 這可能是因為氨基樹脂載體帶正電荷，而底物ATP帶有負電荷，氨基樹脂對底物ATP有吸附 作用，從而使載體周圍微環(huán)境內(nèi)底物ATP的濃度高于整個反應(yīng)體系平均的底物ATP濃度。(4)固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的儲存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性將固定化酶在4°C冰箱中保存，每10天檢測一次其活性，測定其相對酶活力，得到固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的儲存穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明，固定化腺苷甲硫氨酸合成酶連 續(xù)儲存30天后酶活性沒有明顯下降，連續(xù)儲存50天后酶活性還殘留86 %，而游離酶連續(xù)儲 存10天后，酶活性僅殘留28%，連續(xù)儲存20天后檢測不到酶活性。腺苷甲硫氨酸合成酶經(jīng) 固定化后儲存穩(wěn)定性大大提高。將固定化酶裝填于內(nèi)徑15mm的不銹鋼夾套層析柱中，酶床高度為300mm，連接衡 流泵將反應(yīng)液以1. 5倍柱床體積/h連續(xù)反應(yīng)，使不銹鋼夾套的溫度保持在35°C，收集流出 液，通過HPLC檢測流出液中反應(yīng)產(chǎn)物腺苷甲硫氨酸的含量測定酶的相對活力，每天測定一 次。結(jié)果表明隨著固定化酶反應(yīng)器連續(xù)催化天數(shù)的遞增，在開始階段酶活力下降不明顯，在 第5天酶活力下降為86.3%，在第17天酶活力下降為53. 1 %，由此可以判斷出固定化腺苷 甲硫氨酸合成酶的半衰期在17天左右。利用固定化腺苷甲硫氨酸合成酶連續(xù)催化生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸將制備的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶裝填于內(nèi)徑15mm的不銹鋼夾套層析柱中， 酶床高度為300mm，連接衡流泵將反應(yīng)液以1. 5倍柱床體積/h連續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)液組成為 Tris IOOmmol. L-1、三磷酸腺苷 10 30mmol. L-UDL-甲硫氨酸 25 75mmol. L-1、氯化鉀 IOOmmol. L-I、硫酸鎂20 60mmol. L-I和對甲基苯磺酸鈉400-800mmol. L-I，溶解后調(diào)pH 值至7. 0。使不銹鋼夾套的溫度保持在35°C，收集流出液，通過HPLC檢測流出液中反應(yīng)產(chǎn) 物腺苷甲硫氨酸的含量。合并流出液即可用于腺苷甲硫氨酸的后續(xù)純化精制。固定化腺苷甲硫氨酸合成酶連續(xù)催化生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的反應(yīng)底物DL-甲硫氨 酸的濃度可以達到75mmol.L-l，相對應(yīng)ATP的濃度可以達到30mmol. L-1，添加的用于避 免催化反應(yīng)中酶產(chǎn)物抑制作用的對甲基苯磺酸鈉濃度為SOOmmol. L-I ；同時，固定化腺苷 甲硫氨酸合成酶連續(xù)催化生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的反應(yīng)底物DL-甲硫氨酸的濃度也可以為 25mmol. L_l，相對應(yīng)ATP的濃度為lOmmol. L-1，添加的用于避免催化反應(yīng)中酶產(chǎn)物抑制作 用的對甲基苯磺酸鈉濃度為400mmol. L_l。在以上的優(yōu)化條件下，固定化酶催化的底物三磷 酸腺苷轉(zhuǎn)化率可以達到95 %以上。
權(quán)利要求
一種固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的制備方法，其特征在于步驟如下步驟1將氨基樹脂載體Seplite LX 1000HA與1～5％的戊二醛溶液交聯(lián)2～10h；步驟2將步驟1經(jīng)過戊二醛交聯(lián)的氨基樹脂載體與重組腺苷甲硫氨酸合成酶溶液在20～35℃下反應(yīng)10～25h，得到固定化腺苷甲硫氨酸合成酶；所述重組腺苷甲硫氨酸合成酶與氨基樹脂載體Seplite LX 1000HA的比例為5～40mg/g樹脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的制備方法，其特征在于所述 重組腺苷甲硫氨酸合成酶是將來源于大腸桿菌的腺苷甲硫氨酸合成酶基因經(jīng)大腸桿菌表 達得到的腺苷甲硫氨酸合成酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的制備方法，其特征在于所述 重組腺苷甲硫氨酸合成酶與氨基樹脂載體S印lite LX-1000HA的比例為20mg/g樹脂。
4.一種利用權(quán)利要求1 3所述的任一種固定化腺苷甲硫氨酸合成酶生產(chǎn)腺苷甲硫氨 酸的方法，其特征在于步驟如下步驟1 配制固定化腺苷甲硫氨酸合成酶催化生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的反應(yīng)液，反應(yīng)液組 成如下:Tris 1 OOmmo 1. L_l、三磷酸腺苷 10 30mmol. L-UDL-甲硫氨酸 25 75mmol. L-1、 氯化鉀IOOmmol. L-I、硫酸鎂20 60mmol. L-I和對甲基苯磺酸鈉400 800mmol. L-I，溶 解后調(diào)pH值至6. 0 8. 0 ；步驟2 固定化腺苷甲硫氨酸合成酶裝柱，在35°C下將反應(yīng)液以1. 0 4. 0倍柱床體積 /小時的流速過柱，收集流出液，得到腺苷甲硫氨酸溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備固定化腺苷甲硫氨酸合成酶和腺苷甲硫氨酸的方法，技術(shù)特征在于將氨基樹脂載體Seplite LX-1000HA與戊二醛溶液交聯(lián)，再經(jīng)過戊二醛交聯(lián)的氨基樹脂載體與重組腺苷甲硫氨酸合成酶溶液反應(yīng)，得到固定化腺苷甲硫氨酸合成酶；本發(fā)明使用的氨基樹脂載體蛋白固定率高，固定化腺苷甲硫氨酸合成酶的酶活力回收率高，穩(wěn)定性和連續(xù)操作性能優(yōu)良。利用該固定化腺苷甲硫氨酸合成酶生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸，反應(yīng)操作簡單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)物純化容易，而且固定化酶可以重復利用，大幅度降低生產(chǎn)成本并提高生產(chǎn)效率，為腺苷甲硫氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一條新的途徑。
文檔編號C12N11/02GK101985616SQ20101054520
公開日2011年3月16日 申請日期2010年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月11日
發(fā)明者尚曉婭, 徐春蘭, 徐洪杰, 曹珊珊, 牛衛(wèi)寧, 欽傳光 申請人:西北工業(yè)大學