專利名稱：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記玉米赤霉烯酮的合成工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶標(biāo)試劑的合成工藝領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種辣根過(guò)氧化物酶標(biāo) 記玉米赤霉烯酮的合成工藝。
背景技術(shù)：
玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又稱F2毒素，是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種具有 類雌激素作用的真菌二次代謝產(chǎn)物，屬于2，4 一二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物?；瘜W(xué)名為 6-(10-羥基-6氧基-十一-碳烯基)β -雷鎖酸內(nèi)酯，廣泛存在于霉變的玉米、高粱、小麥 等谷類作物和奶中。玉米赤霉烯酮具有很強(qiáng)的雌性激素作用，如果攝入被玉米赤霉烯酮污染的飼料可 引起豬、大鼠、小鼠、家禽等動(dòng)物的雌激素過(guò)多癥和嚴(yán)重的生殖道癥狀和不孕癥。同時(shí)玉米 赤霉烯酮被證明還具有還具有免疫毒性、基因毒性、細(xì)胞毒性等，而且人們懷疑玉米赤霉烯 酮的雌激素作用導(dǎo)致兒童中產(chǎn)生早期青春綜合癥的原因。因玉米赤霉烯酮具有熱穩(wěn)定性 (在100-125°C還可保持穩(wěn)定)且不溶于水，玉米赤霉烯酮的食源性危害受到越來(lái)越多的關(guān) 注。到2003年，全世界已有19個(gè)國(guó)家制訂了食品中玉米赤霉烯酮的限量標(biāo)準(zhǔn)，而且歐盟于 2005年制定了食品中玉米赤霉烯酮統(tǒng)一限量標(biāo)。歐盟中規(guī)定未加工谷物，玉米加工品中玉 米赤霉烯酮含量必須低于100 μ g/kg，而嬰幼兒食品中的含量不得超過(guò)20 μ g/kg，其它食 品中限量在50-400 μ g/kg之間。每天人體攝入玉米赤霉烯酮量不得超過(guò)0. 05 μ g/kg。我 國(guó)尚未建立食品中玉米赤霉烯酮的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，迄今為止也沒(méi)有開(kāi)展過(guò)全國(guó)性的糧 食中玉米赤霉烯酮污染狀況調(diào)查，對(duì)消費(fèi)者健康造成威脅，因此為保護(hù)消費(fèi)者健康及我國(guó) 的糧食貿(mào)易，迫切需要建立測(cè)定一種靈敏的檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法?，F(xiàn)今檢測(cè)玉米赤霉烯酮常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、薄層色譜法、免 疫親和柱-HPLC法、質(zhì)譜技術(shù)、氣相色譜、毛細(xì)管電泳以及其它基于抗體抗原免疫反應(yīng)的方 法。但這幾種檢測(cè)方法均存在一些缺陷，而近年發(fā)展迅速的化學(xué)發(fā)光免疫分析法結(jié)合 了免疫反應(yīng)的高特異性和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏性，儀器簡(jiǎn)單，成本低廉得到了越來(lái)越多 的關(guān)注。但目前國(guó)內(nèi)各檢測(cè)中心均采用的是國(guó)外昂貴的進(jìn)口試劑盒及相應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)，其中 辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮(ZEN-HRP)組分是該化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的關(guān)鍵 組分。但因辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記玉米赤霉烯酮的制備技術(shù)一直為該試劑盒廠家作為技術(shù)秘密 保護(hù)，現(xiàn)國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了彌補(bǔ)化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域中檢測(cè)玉米赤霉烯酮試劑盒的關(guān)鍵組分辣根過(guò) 氧化物酶標(biāo)記物還未有公開(kāi)制備工藝的不足，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便易行、成本低廉的辣 根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記玉米赤霉烯酮的合成工藝。本發(fā)明提供了 一種辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記玉米赤霉烯酮的合成工藝，其中，所述工藝是通過(guò)羧基化玉米赤霉烯酮得到羧基化產(chǎn)物后，再與辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行縮合反應(yīng)得到 所述辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮。優(yōu)選地，所述羧基化玉米赤霉烯酮為玉米赤霉烯酮與鹽酸羧甲基羥胺在極性有機(jī) 溶劑中進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選地，所述極性有機(jī)溶劑為吡啶、二甲基亞砜。優(yōu)選地，所述反應(yīng)中鹽酸羧甲基羥胺是過(guò)量的；所述極性有機(jī)溶劑的用量為每毫 克玉米赤霉烯酮用0. 4 0. 6毫升。優(yōu)選地，所述羧基化玉米赤霉烯酮得到羧基化產(chǎn)物還包括在玉米赤霉烯酮與鹽酸 羧甲基羥胺反應(yīng)后，終止反應(yīng)并分別用苯、乙酸乙酯進(jìn)行萃取的步驟。優(yōu)選地，所述羧基化玉米赤霉烯酮得到羧基化產(chǎn)物的具體過(guò)程為將玉米赤霉烯 酮和鹽酸羧甲基羥胺溶于吡啶中，其中每毫克玉米赤霉烯酮用0.5毫升吡啶，室溫?cái)嚢柽^(guò) 夜，然后加入等反應(yīng)體積的蒸餾水，調(diào)pH至8 9，振蕩使溶液澄清，用苯提取后，調(diào)水層pH 至酸性用乙酸乙酯萃取，干燥得到羧基化產(chǎn)物即羧基化的玉米赤霉烯酮。在得到羧基化產(chǎn)物即羧基化的玉米赤霉烯酮后，可用常規(guī)的薄板層析法進(jìn)行純化 鑒定。優(yōu)選地，所述縮合反應(yīng)為羧基化產(chǎn)物與琥珀酰亞胺、碳二亞胺反應(yīng)后，將其滴加到 辣根過(guò)氧化物酶的堿性溶液中反應(yīng)。本步反應(yīng)中因使用了琥珀酰亞胺，將常規(guī)的一步縮合 反應(yīng)改進(jìn)為兩步，碳二亞胺通過(guò)琥珀酰亞胺與羧基化產(chǎn)物相結(jié)合后，再與辣根過(guò)氧化物酶 反應(yīng)，有效避免了在一步反應(yīng)中酶之間的交聯(lián)反應(yīng)，從而有效提高了辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記 的有效性。優(yōu)選地，所述縮合反應(yīng)在二甲基甲酰胺(DMF)或乙醇中進(jìn)行。該反應(yīng)環(huán)境也可選 擇其他同時(shí)對(duì)水和有機(jī)溶劑均有親和力的極性有機(jī)溶劑。優(yōu)選地，所述羧基化產(chǎn)物與辣根過(guò)氧化物酶的反應(yīng)摩爾比為1.5 3 1。優(yōu)選地，所述縮合反應(yīng)的具體過(guò)程為將羧基化產(chǎn)物、琥珀酰亞胺以及碳二亞胺， 溶于二甲基甲酰胺中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)lh，將反應(yīng)后的液體緩慢滴加到辣根過(guò)氧化物酶的 NaHCO3溶液中，其中羧基化產(chǎn)物與辣根過(guò)氧化物酶的反應(yīng)摩爾比為2 1，室溫?cái)嚢?，透?過(guò)夜，得產(chǎn)物辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記玉米赤霉烯酮。本發(fā)明提供的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記玉米赤霉烯酮的合成工藝，具有以下有益效 果1、解決了化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域中檢測(cè)玉米赤霉烯酮試劑盒的關(guān)鍵組分辣根過(guò) 氧化物酶標(biāo)記物現(xiàn)還未有公開(kāi)制備工藝的問(wèn)題因玉米赤霉烯酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)中缺少如胺基 或羧基等反應(yīng)基，要將其連接到蛋白質(zhì)上，必須通過(guò)化學(xué)方法，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，引入一 個(gè)活性基團(tuán)，本發(fā)明合成工藝對(duì)玉米赤霉烯酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改進(jìn)，在其分子中引入了 一可與蛋白質(zhì)相結(jié)合的羧基，從而有效解決了該難題；2、本發(fā)明辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記玉米赤霉烯酮的合成工藝合成的酶標(biāo)記物效率較 高在該合成工藝進(jìn)行酶標(biāo)記反應(yīng)步驟(即縮合反應(yīng))時(shí)，因使用了琥珀酰亞胺，將常規(guī)的 一步縮合反應(yīng)改進(jìn)為兩步，碳二亞胺通過(guò)琥珀酰亞胺與羧基化產(chǎn)物相結(jié)合后，再與辣根過(guò) 氧化物酶反應(yīng)，有效避免了在一步反應(yīng)中酶自身間的交聯(lián)反應(yīng)，酶活性增高，從而有效提高 了辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的有效性。


圖1是實(shí)施例3合成的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮與Beacom公司購(gòu)買 的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮分別應(yīng)用于玉米赤霉烯酮化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑 盒中的檢測(cè)結(jié)果比較圖。
具體實(shí)施例方式以下所舉實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述為本發(fā)明涉及到的試劑及其來(lái)源玉米赤霉烯酮GEN)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)均購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，美國(guó))；鹽酸羧甲基羥胺(CMO)購(gòu)自Aldrich公司(密爾沃基，威斯康星洲，美國(guó))。N-琥珀酰亞胺(NHS)及碳二亞胺(EDC)則購(gòu)自pierce公司(羅克弗德，美國(guó))。實(shí)施例1辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記玉米赤霉烯酮的制備稱取0. 5mg ZEN和4. Omg鹽酸羧甲基羥胺，溶于0. 2ml吡啶，室溫下攪拌Mh。反 應(yīng)溶液中加入0. 2ml蒸餾水，用0. 2M NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 5，振蕩使溶液澄清。用苯(0. 2ml) 提取3次，水層用2M HCl調(diào)節(jié)pH至3，用乙酸乙酯(0. 5ml)萃取3次，真空抽干，得到的羧 基化產(chǎn)物為羧基化的玉米赤霉烯酮。稱取0. 2mg羧基化的玉米赤霉烯酮，0. 4mg琥珀酰亞胺以及Img碳二亞胺，溶于 0. 7ml DMF,室溫下攪拌反應(yīng)lh。將此反應(yīng)液緩慢滴加到含13. 6mg HRP的0. IM NaHCO3溶液 中，室溫下攪拌2h.用0.02M PBS透析過(guò)夜，所得產(chǎn)物(ZEN-HRP)用等體積甘油保護(hù)，_20°C 以下保存。實(shí)施例2辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記玉米赤霉烯酮的制備稱取0. 5mg ZEN和4. 3mg鹽酸羧甲基羥胺，溶于0.3ml 二甲基亞砜，室溫下攪拌 24h0反應(yīng)溶液中加入0.3ml蒸餾水，用0.2M NaOH調(diào)節(jié)pH至9，振蕩使溶液澄清。用苯 (0. 3ml)提取3次，水層用2M HCl調(diào)節(jié)pH至4，用乙酸乙酯(0. 6ml)萃取3次，真空抽干， 得到的羧基化產(chǎn)物為羧基化的玉米赤霉烯酮。稱取0. 2mg羧基化的玉米赤霉烯酮，0. 4mg琥珀酰亞胺以及Img碳二亞胺，溶于 0. 7ml乙醇，室溫下攪拌反應(yīng)lh。將此反應(yīng)液緩慢滴加到含6. 8mg HRP的0. IM NaHCO3溶液 中，室溫下攪拌2h.用0.02M PBS透析過(guò)夜，所得產(chǎn)物(ZEN-HRP)用等體積甘油保護(hù)，_20°C 以下保存。實(shí)施例3辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記玉米赤霉烯酮的制備稱取0. 4mg ZEN和3. 2mg鹽酸羧甲基羥胺，溶于0. 2ml吡啶，室溫下攪拌Mh。反 應(yīng)溶液中加入0. 2ml蒸餾水，用0. 2M NaOH調(diào)節(jié)pH至8，振蕩使溶液澄清。用苯(0. 2ml)提 取3次，水層用2M HCl調(diào)節(jié)pH至3，用乙酸乙酯(0. 5ml)萃取3次，真空抽干，得到的羧基 化產(chǎn)物為羧基化的玉米赤霉烯酮。稱取0. 2mg羧基化的玉米赤霉烯酮，0. 4mg琥珀酰亞胺以及Img碳二亞胺，溶于 0.7ml DMF，室溫下攪拌反應(yīng)lh。將此反應(yīng)液緩慢滴加到含10. 2mg HRP的0. IM NaHC03溶液 中，室溫下攪拌2h。用0. 02M PBS透析過(guò)夜，所得產(chǎn)物(ZEN-HRP)用等體積甘油保護(hù)，_20°C以下保存。實(shí)施例4辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)-將實(shí)施例3制備得到的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮(ZEN-HRP)與從 Beacom公司購(gòu)買的^N-HRP應(yīng)用于檢測(cè)^N的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié) 果如下1、對(duì)所制備的兩種試劑盒進(jìn)行了方法學(xué)鑒定，結(jié)果如下表1試劑盒的技術(shù)指標(biāo)檢測(cè)對(duì)比結(jié)果檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)口產(chǎn)品試劑盒本發(fā)明檢驗(yàn)結(jié)果檢驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記玉米赤霉烯酮的合成工藝，其特征在于，所述工藝是通過(guò) 羧基化玉米赤霉烯酮得到羧基化產(chǎn)物后，再與辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行縮合反應(yīng)得到所述辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成工藝，其特征在于，所述羧基化玉米赤霉烯酮為玉米赤 霉烯酮與鹽酸羧甲基羥胺在極性有機(jī)溶劑中進(jìn)行反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成工藝，其特征在于，所述極性有機(jī)溶劑為吡啶、二甲基亞砜。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成工藝，其特征在于，所述反應(yīng)中鹽酸羧甲基羥胺是過(guò)量 的；所述極性有機(jī)溶劑的用量為每毫克玉米赤霉烯酮用0. 4 0. 6毫升。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成工藝，其特征在于，所述羧基化玉米赤霉烯酮得到羧基 化產(chǎn)物還包括在玉米赤霉烯酮與鹽酸羧甲基羥胺反應(yīng)后，終止反應(yīng)并分別用苯、乙酸乙酯 進(jìn)行 萃取的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成工藝，其特征在于，所述羧基化玉米赤霉烯酮得到羧基 化產(chǎn)物的具體過(guò)程為將玉米赤霉烯酮和鹽酸羧甲基羥胺溶于吡啶中，其中每毫克玉米赤 霉烯酮用0. 5毫升吡啶，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，然后加入等反應(yīng)體積的蒸餾水，調(diào)PH至8 9，振蕩 使溶液澄清，用苯提取后，調(diào)水層PH至酸性用乙酸乙酯萃取，干燥得到羧基化產(chǎn)物即羧基 化的玉米赤霉烯酮。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的合成工藝，其特征在于，所述縮合反應(yīng)為羧基化產(chǎn) 物與琥珀酰亞胺、碳二亞胺反應(yīng)后，將其滴加到辣根過(guò)氧化物酶的堿性溶液中反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的合成工藝，其特征在于，所述縮合反應(yīng)在二甲基甲酰胺或乙 醇中進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的合成工藝，其特征在于，所述羧基化產(chǎn)物與辣根過(guò)氧化物酶 的反應(yīng)摩爾比為1. 5 3 1。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或8 9任一項(xiàng)所述的合成工藝，其特征在于，所述縮合反應(yīng)的具 體過(guò)程為將羧基化產(chǎn)物、琥珀酰亞胺以及碳二亞胺，溶于二甲基甲酰胺中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) lh，將反應(yīng)后的液體緩慢滴加到辣根過(guò)氧化物酶的NaHCO3溶液中，其中羧基化產(chǎn)物與辣根 過(guò)氧化物酶的反應(yīng)摩爾比為2 1，室溫?cái)嚢?，透析過(guò)夜，得產(chǎn)物辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記玉米 赤霉烯酮。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記玉米赤霉烯酮的合成工藝，所述合成工藝是通過(guò)羧基化玉米赤霉烯酮得到羧基化產(chǎn)物后，再與辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行縮合反應(yīng)得到所述辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮。因化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域中檢測(cè)玉米赤霉烯酮試劑盒的關(guān)鍵組分辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的制備工藝一直是一個(gè)難以攻克的難題，因此本發(fā)明提供的簡(jiǎn)單易行、成本低廉的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物合成工藝有很好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P7/62GK102051389SQ201010536029
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者唐寶軍, 柴淑芳, 胡國(guó)茂 申請(qǐng)人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司