專利名稱：改腺載體及其在艾滋病預(yù)防和治療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療艾滋病(AIDS)的基因藥物，具體是馮氏載體——一種腺衛(wèi)星病毒 載體。
背景技術(shù)：
艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficency virus, HIV)感染 而引起的傳染性疾病，近20年來艾滋病在全球呈迅速蔓延趨勢。到目前為止，還沒有非常 有效的治療艾滋病的藥物，因而尋找預(yù)防和治療艾滋病藥物的研究顯得日益迫切。中國的 人體免疫缺損病毒HIV/艾滋病AIDS擴(kuò)散傳染已經(jīng)變得嚴(yán)重了。其發(fā)展已經(jīng)歷了兩個(gè)過程 (‘登錄，，1985-88 ‘散布，1989-94)，目前發(fā)展到了第三階段‘?dāng)U張，。據(jù)聯(lián)合國估計(jì)，2010 年大約有1千萬中國人感染艾滋病病毒。據(jù)初步推測，感染艾滋病毒進(jìn)入人體有兩種機(jī)制有些病毒直接融入細(xì)胞膜，有些 病毒則由受體導(dǎo)入細(xì)胞。在1986年所做的一項(xiàng)研究清楚表明，艾滋病病毒感染的發(fā)生是由 于與細(xì)胞表面T4的分子與病毒分子相互作用的直接結(jié)果。T4基因測序后，接著發(fā)現(xiàn)了這個(gè) 現(xiàn)象。HIV病毒進(jìn)入人體常作用于某些靶細(xì)胞，這是因?yàn)樵诩?xì)胞上，病毒殼與細(xì)胞膜邊沿 蛋白質(zhì)之間的結(jié)合功能。在輔助細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，即CD4，是艾滋病毒的受體蛋白質(zhì)。 CD4本身不足以誘發(fā)艾滋病毒的結(jié)合，但已證明艾滋病毒的結(jié)合機(jī)制中，CD4是必不可少 的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CD4，以及人趨化因子受體5(CCR5)或人趨化因子受體4(CXCR4)都是病毒結(jié) 合所必需的物質(zhì)。人體T細(xì)胞是白細(xì)胞之一。最重要的用于抗艾滋病毒的T細(xì)胞叫“CD4T 細(xì)胞”。CCR5蛋白作用于普通HIV感染者以進(jìn)入感染的T細(xì)胞。有些人的T細(xì)胞先天缺乏 CCR5。這些人能抵抗艾滋病感染。一些人的T細(xì)胞只有少量CCR5，他們感染艾滋病后的發(fā) 病狀態(tài)要輕得多。因此，只要去除T細(xì)胞內(nèi)的CCR5，就能治療艾滋病。鋅指核酸酶(ZFN)是一工程化的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的集合體，在基因特定的部位造 成DNA的雙鏈斷裂，以對(duì)其基因作修飾。每個(gè)鋅指核酸酶(ZFN)由兩個(gè)功能區(qū)組成1)DNA 結(jié)合區(qū)，由兩指模塊鏈組成，每個(gè)都是獨(dú)特的六聚體(6bp)DNA序列。兩指模塊連在一起形 成鋅指蛋白，每個(gè)的特化彡24堿基對(duì)(bp)。2) DNA裂解區(qū)，由FokI的核酸區(qū)組成。當(dāng)DNA 結(jié)合區(qū)和DNA裂解區(qū)融合在一起時(shí)，產(chǎn)生一種高度特化的基因剪刀組合。ZEN可用于誘導(dǎo)特 定DBA序列的雙鏈斷裂，從而促進(jìn)特定部位的同源重組和各種不同形式細(xì)胞的基因位點(diǎn)的 靶定操作。雙鏈斷裂對(duì)于特定位置的基因突變非常重要，因其刺激了細(xì)胞的自然DNA修復(fù) 過程，此過程稱為同源重組及非同源末端連接(NHEJ)。經(jīng)過已建立的區(qū)域驗(yàn)證法，此一過程 被用于精確產(chǎn)生靶定的基因編輯，從而產(chǎn)生靶定基因刪除，重組，修飾后的細(xì)胞株。腺衛(wèi)星病毒(AAV2)是相當(dāng)小的DNA病毒，但卻綜合了反轉(zhuǎn)錄病毒會(huì)嵌入宿主染色 體的特性，及腺病毒載體會(huì)感染不分裂的細(xì)胞的特性，而成為目前遺傳性疾病基因療法的 新寵。在使用這個(gè)病毒載體時(shí)，基本上病毒本身的蛋白基因部份均已被剔除，故在宿主內(nèi)也 不會(huì)造成強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，而可維持較長時(shí)段的基因表現(xiàn)。而先前制備該病毒之步驟較繁
5瑣，且病毒力價(jià)偏低，目前也已一一克服，其力價(jià)也可高達(dá)IOltl 1013cfu/mL，故非常適合用 于活體內(nèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種改造過的腺衛(wèi)星病毒載體——馮氏載體，是在腺衛(wèi)星病 毒載體(AAV2病毒載體)的基礎(chǔ)上改造而成，主要用于治療艾滋病。它能表達(dá)兩種鋅指核 酸酶，其中一種能專一性的修改艾滋病毒輔助受體CCR5基因，另一種能專一性的修改艾滋 病毒輔助受體CXCR4基因。它的其它各方面與典型的腺衛(wèi)星病毒載體無異。馮氏載體，由包含以下步驟的方法制備A確定CCR5基因和CXCR4基因的修飾位點(diǎn)；B確定能夠識(shí)別選定的脫氧核糖核酸序列的鋅指核酸酶的氨基酸序列，把這些氨 基酸序列編進(jìn)鋅指核酸酶的編碼筐，得到帶有鋅指核酸酶的離解區(qū)和結(jié)合區(qū)的聚合酶鏈反 應(yīng)的產(chǎn)物；C把帶有鋅指核酸酶的離解區(qū)和結(jié)合區(qū)的聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物克隆到腺衛(wèi)星病毒 II克隆質(zhì)粒中，產(chǎn)生馮氏質(zhì)粒；D用pAAV-RC質(zhì)粒、pHelper質(zhì)粒和馮氏質(zhì)粒來共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，得到新的病 毒載體即馮氏載體；E馮氏載體的純化；F馮氏載體濃縮。我們利用基因工程的技能和軟件篩選有關(guān)的修飾位點(diǎn)(Xiaorong Feng, et al Nature 2002Jul 18 ；418 (6895) 320-3. Morgan L Maeder, et al Nature Protocols 20094，-1471-1501)。CCR5基因和CXCR4基因的序列可以從美國國立衛(wèi)生研究院網(wǎng)站 http//www. ncbi. nlm. nih. gov/ 查到。CCR5 的基因編號(hào)是 NM_001100168。CXCR 的基因編 號(hào)是 ΝΜ_001008540。鋅指聯(lián)盟(http://WWW. zincfingers. org)也發(fā)布了網(wǎng)絡(luò)工具，以幫助設(shè)計(jì)鋅指 核酸酶。下面列出的位點(diǎn)是我們經(jīng)過許多測試選中的最好的修飾位點(diǎn)。CCR5基因修飾位點(diǎn)為263 aCTATGCTGCCGCCCAG TGGGACTTTg 289263 t GATACGAC6 GCGGGTCACCCTGAAAc 289CXCR4基因修飾位點(diǎn)為427 aacagtcagaggccaag gaagctgtt g 453427 t tgtcagtct ccggttccttcgacaac 453。上述黑體表示的是關(guān)鍵的位點(diǎn)。我們應(yīng)用上述的相關(guān)信息，確定能夠識(shí)別選定的脫氧核糖核酸序列的鋅指核酸酶 的安基酸序列。把這些安基酸序列編進(jìn)鋅指核酸酶的編碼筐，我們利用合成長引物的策略 來建造新的鋅指核酸酶的編碼的序列。具體步驟包括下列過程1)選定能夠識(shí)別CCR5基因和CXCR4基因的的鋅指核酸酶的氨基酸序列，把這些序 列插入到相應(yīng)的鋅指核酸酶編碼筐當(dāng)中；2)為鋅指核酸酶的區(qū)段設(shè)計(jì)脫氧核糖核酸編碼序列；
3)合成帶有鋅指核酸酶編碼序列的低聚核苷酸；4)用3)合成的低聚核苷酸作為引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，得到帶有鋅指核酸酶的 離解區(qū)和結(jié)合區(qū)的產(chǎn)物。其中，為鋅指核酸酶的區(qū)段設(shè)計(jì)的脫氧核糖核酸編碼序列為識(shí)別CCR5基因鋅指核酸酶結(jié)合區(qū)編碼序列為CggatccatggagccctatgcttgccctgtcgagtcctgcgatcgccgcttttctacttctMEPYACPVESCDRRFST SggtaatttggttcgtcacatccggatccacacgggccagaagcctttccagtgtcgaataGNL VRHIRIHTGQKPFQCRItgcatgcgtaacttcagtcgcaccgataccttacgcgatcatatacgaacacatacaggtCMRNFSR T D T L RD H I R T H T GgagaagccttttgcctgtgacatttgtgggaggaagttttcccgaaccgatacccttcgaEKPFACDICGRKFSR T D T L RGatcataccaaaatccatttaagacagaagcaaagcttDHTKIHLRQKQS上述黑體表示的是關(guān)鍵的位點(diǎn)。識(shí)別CXCR4基因鋅指核酸酶結(jié)合區(qū)編碼序列為cggatccatggagccctatgcttgccctgtcgagtcctgcgatcgccgcttttctacatcgMEPYACPVESCDRRFSTSggagcactcacacggcacatccggatccacacgggccagaagcctttccagtgtcgaataGALTRHTRIHTGQKPFQCRItgcatgcgtaacttcagtcagagtag tgacctaacaagacatatacgaacacatacaggtCMRNFSQSSDLT RHI RTHTGgagaagccttttgcctgtgacatttgtgggaggaagttttcccaatcaggcaatcttgccEKPFACDICGRKFSQSGNLAcgacataccaaaatcca tttaagacagaagcaaagcttRHTKIHLRQKQS上述黑體表示的是關(guān)鍵的位點(diǎn)。上述的聚合酶鏈反應(yīng)是普通的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，見馮小榮等(Xiaorong Feng, etal)，美國科學(xué)院院報(bào) Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 July 8 ；100(14) 8502-8507. "Single-Nucleotide Polymorphisms&Genome Diversity in Plasmodium viva, χ，，。其中，步驟C包括下列過程1)在一個(gè)干凈的管子消化1微克的腺衛(wèi)星病毒11克隆質(zhì)粒和1微克步驟B所得 的聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物；2)純化所需要的片段，包括大的片段即載體片段和插入片段中的小片段即插入片 段；3)連接把100-200納克載體片段和300-600納克的插入片段放入一個(gè)20微升
的反應(yīng)中，用脫氧核糖核酸連接酶T4在室溫中反應(yīng)2-4個(gè)小時(shí)；
4)用灑精沉淀法純化連接好的脫氧核糖核酸；5)用2微升純化了的連接物轉(zhuǎn)化到大腸感菌細(xì)胞DH5a中，用含有青霉素的培養(yǎng)皿 篩選；6)從培養(yǎng)皿中挑選菌落，放入50毫升含青霉素100微克/毫升的普通培養(yǎng)液LB 中，培養(yǎng)16-18個(gè)小時(shí)；7)從6)得到的大腸感DH5a細(xì)胞中，提取，純化質(zhì)粒，得到腺衛(wèi)星病毒II-鋅指核 酸酶質(zhì)粒，即馮氏質(zhì)粒。本發(fā)明中，步驟D包括下列過程1).使用已傳代2-3次的HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)這些細(xì)胞直到單層已經(jīng)70-80%密度；2).用pAAV-RC質(zhì)粒、pHelper質(zhì)粒和馮氏質(zhì)粒來共同轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞；3).經(jīng)過48-72小時(shí)培養(yǎng)，用錐形管來收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞和其培養(yǎng)液，在2500-3000轉(zhuǎn) /分鐘的條件下分離5-10分鐘，丟棄上清液，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞分離出來，然后用無血清的細(xì)胞培 養(yǎng)液混合；4).將錐形管交替放到干冰乙醇和36 38°C的溫水中，使這些細(xì)胞懸浮液經(jīng)過4 輪冷凍/解凍循環(huán)交替的過程；5).將4)中經(jīng)最后解凍的的錐形管在10，000g離心力的條件下進(jìn)行離心10-15分 鐘來收集上清液；然后，6).在55 57°C的條件下放置30-40分鐘；7).通過一個(gè)0.45微米的低蛋白結(jié)合濾器來過濾，得到所需的病毒清液。這病毒 清液可以貯存在-80°C的溫度下或即時(shí)純化來進(jìn)行儲(chǔ)存。馮氏載體的純化是介紹如何純化和壓縮25毫升病毒清液的。如果樣本少于25毫 升，添加無血清培養(yǎng)液直到25毫升。純化步驟E包括下列過程1).添加0. 25毫升AAV結(jié)合試劑A到25毫升步驟D所得的病毒上清液中，并攪拌 均勻；2).在36 38°C下靜放30-40分鐘；3).在5000g離心力的條件下離心15-20分鐘；4).收集3)的上清液并轉(zhuǎn)移到一個(gè)新試管中；5).將1. 25毫升AAV結(jié)合試劑B加到4)的上清液中，攪拌均勻；6).在36 38°C下靜放30-40分鐘；7).用0. 45微米低蛋白結(jié)合過濾器來過濾6)的上清液，并用干凈試管收集液體；8) ·力Π 3毫升AAV純化基質(zhì)到7)的試管中；9).將試管放到定軌振蕩器中在4 8°C的溫度下，振蕩30分鐘一60分鐘；10).將凈化柱底部的小部件移除，然后將凈化柱放到到一個(gè)空著的50毫升錐形
管中；11).攪拌9)所得試管中的上清液/基質(zhì)懸浮液，并將其倒入凈化柱中，并用試管 收集流出的液體；試管收集的液體再倒回凈化柱中，用10毫升IX PBS緩沖液清洗試管，并 將清洗液也倒入凈化柱中；12).待液體完全流過，凈化柱停止滴液的時(shí)候，再加10毫升凈化緩沖劑到凈化柱 內(nèi)來沖洗收集的基質(zhì)，之后再重復(fù)沖洗一遍；
8
13).將凈化柱轉(zhuǎn)到一個(gè)空著的50毫升的錐形管中；14).將3毫升提洗緩沖液慢慢地加入凈化柱，收集流出的液體；上述AAV結(jié)合試劑A的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是Part No. 314001 ；AAV結(jié)合試劑B的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是Part No. 314002 ；AAV純化基質(zhì)的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是Part No. 314003 ；凈化柱的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是Part No. 314107 ；提洗緩沖液的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是Part No. 314106 ；凈化緩沖劑的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是PartNo. 314105。最后，馮氏載體的濃縮方法，步驟F包括下列過程1).組裝一個(gè)腺衛(wèi)星病毒濃縮裝置；2).將0. 5毫升步驟E最后收集的部分放入到濃縮裝置的樣品貯器中，在2000g離 心力下離心5-8分鐘，濾過的部分可以丟棄；3).繼續(xù)濃縮，直到樣本貯器里達(dá)到100微升為止；4).加300-400微升IX PBS緩沖液，然后繼續(xù)離心，直到100微升；5).用一個(gè)干凈的離心管，通過倒轉(zhuǎn)樣本貯器將濃縮物收集到試管中；6).再離心并收集所有的液體。本發(fā)明還提供所述的馮氏載體治療愛滋病的應(yīng)用。馮氏載體治療艾滋病基本原理馮氏載體是根據(jù)仿生原理，設(shè)計(jì)，應(yīng)用鋅指核酸酶修改CGR5和CXCR4基因，于是打 斷艾滋病毒進(jìn)入人體免疫細(xì)胞的通道。該載體能表達(dá)特殊的鋅指核酸酶。這些鋅指核酸酶能用于編輯或剔除CCR5和/ 或 CCR4。馮氏載體是通過阻斷艾滋病毒進(jìn)入人體的免疫細(xì)胞(⑶4)或它的干細(xì)胞達(dá)到治 療艾滋病。馮氏載體通過移植已經(jīng)修飾的，擴(kuò)增過的免疫細(xì)胞(⑶4)或它的干細(xì)胞到患者體 內(nèi)來治療艾滋病。馮氏載體治療艾滋病基本步驟1)，分離出若干的T細(xì)胞(⑶4)或它的干細(xì)胞。來源可以是A，患者或患者親屬血液細(xì)胞；B，患者或患者親屬臍帶血細(xì)胞；C，患者或患者親屬骨髓細(xì)胞；2)，應(yīng)用馮氏載體修飾T細(xì)胞(⑶4)或它的干細(xì)胞的CCR5和CXCR4基因。3)，擴(kuò)增已經(jīng)修飾的T細(xì)胞或它的干細(xì)胞(10—100億)。4)，移植已經(jīng)修飾的T細(xì)胞或它的干細(xì)胞到患者體內(nèi)。5)，檢測患者血液，每月一次，直至血液里的HIV病毒轉(zhuǎn)陰為止。(三個(gè)月到半年)。為了清除T細(xì)胞里的CCR5，我們將從艾滋病患者體內(nèi)分離出大量的T細(xì)胞，然后使 用我們的特殊系統(tǒng)將馮氏載體從分子水平送入T細(xì)胞。馮氏載體進(jìn)入T細(xì)胞后便開始清除T細(xì)胞里的CCR5蛋白。當(dāng)這些T細(xì)胞再回到患者體內(nèi)，其⑶4T細(xì)胞已經(jīng)沒有CCR5蛋白。
我們的試驗(yàn)已經(jīng)表明，當(dāng)⑶4T細(xì)胞經(jīng)技術(shù)修飾后，可以預(yù)防HIV的感染，治療艾滋病。


圖1馮氏質(zhì)粒1(修飾CCR5基因)；
圖2馮氏質(zhì)粒II (修飾CXCR4基因)；
圖3馮氏質(zhì)粒III (修飾CXCR4和CCR5基因)；
圖4馮氏質(zhì)粒III插入片段設(shè)計(jì)圖5用多聚組氨酸(His)抗體來檢查鋅指核酸酶
圖6切割質(zhì)粒來檢查鋅指核酸酶活力；
圖7動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式馮氏質(zhì)粒設(shè)計(jì)參考馮氏質(zhì)粒示意1、圖2和圖3。馮氏質(zhì)粒是在腺衛(wèi)星病毒II(AAV2)的基 礎(chǔ)上發(fā)展而成；腺衛(wèi)星病毒II(AAV2)克隆質(zhì)粒裝上特別的鋅指核酸酶編碼框之后構(gòu)建成 馮氏質(zhì)粒。修飾CXCR4或CCR5的鋅指核酸酶編碼框由兩個(gè)功能區(qū)組成1)DNA結(jié)合區(qū)，由兩 指模塊鏈組成，每個(gè)都是獨(dú)特的六聚體(6bp)DNA序列。兩指模塊連在一起形成鋅指蛋白， 每個(gè)的特化彡24bp。2)DNA裂解區(qū)，由Fokl的核酸區(qū)組成。當(dāng)DNA結(jié)合區(qū)和DNA裂解區(qū)融 合在一起時(shí)，產(chǎn)生一種高度特化的基因剪刀組合。馮氏載體的制備1、馮氏質(zhì)粒制備1)在一個(gè)干凈的管子消化1微克的腺衛(wèi)星病毒II克隆質(zhì)粒和1微克聚合酶鏈反 應(yīng)的產(chǎn)物；2)純化所需要的片段，包括大的片段即載體片段和插入片段中的小片段即插入片 段；3)連接把100納克載體片段和300納克的插入片段放入一個(gè)20微升的反應(yīng)中， 用脫氧核糖核酸連接酶T4在室溫中反應(yīng)3個(gè)小時(shí)；4)用灑精沉淀法純化連接好的脫氧核糖核酸；5)用2微升純化了的連接物轉(zhuǎn)化到大腸感菌細(xì)胞DH5a中，用含有青霉素的培養(yǎng)皿 篩選；6)從培養(yǎng)皿中挑選菌落，放入50毫升含青霉素100微克/毫升的普通培養(yǎng)液LB 中，培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)；7)從6)得到的大腸感DH5a細(xì)胞中，提取，純化質(zhì)粒，得到腺衛(wèi)星病毒II-鋅指核 酸酶質(zhì)粒，即馮氏質(zhì)粒。2、馮氏質(zhì)粒擴(kuò)增將馮氏質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞DH5中，再將大腸桿菌轉(zhuǎn)移到200毫升的LB細(xì)菌 培養(yǎng)液(含青霉素100微克/毫升)培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)。
3、馮氏質(zhì)粒純化從上述得到的大腸感DH5a細(xì)胞中，提取，純化質(zhì)粒。用Qiagen公司質(zhì)粒純化盒 (見 QIAGEN 公司，QIAGEN Plasmid Purification Handbook，商品號(hào)是 12143)純化質(zhì) 粒，方法參照公司的產(chǎn)品說明書。用兩個(gè)純化柱可以得到150微克的馮氏質(zhì)粒。4、馮氏載體的制備1)培養(yǎng)細(xì)胞。一天前，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿種下2X 105HEK-293細(xì)胞，用10個(gè)直徑15厘米的細(xì)胞培 養(yǎng)皿培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞。2)馮氏載體的產(chǎn)生第二天，細(xì)胞的密度為70%至80%時(shí)，將馮氏質(zhì)粒、pHelper質(zhì)粒和ρAAV-RC質(zhì)粒 一起同時(shí)轉(zhuǎn)化到ΗΕΚ-293細(xì)胞中。每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿共轉(zhuǎn)化25. 2微克質(zhì)粒(馮氏質(zhì)粒8. 4 微克，pHelper8. 4微克，pAAV-RC質(zhì)粒8. 4微克)。到48個(gè)小時(shí)用錐形管收集轉(zhuǎn)化過的 HEK-293細(xì)胞(含馮氏載體)。在3000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下分離10分鐘，丟棄上清液，使轉(zhuǎn) 染細(xì)胞分離出來，然后用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液混合；將錐形管交替放到干冰乙醇和37°C的 溫水中，使這些細(xì)胞懸浮液經(jīng)過4輪冷凍/解凍循環(huán)交替的過程；將經(jīng)最后解凍的的錐形管 在10，OOOg離心力的條件下進(jìn)行離心15分鐘來收集上清液；然后，在56°C的條件下放置30 分種；通過一個(gè)0. 45微米的低蛋白結(jié)合濾器來過濾，得到所需的病毒清液。這病毒清液可 以貯存在-80°C的溫度下或即時(shí)純化來進(jìn)行儲(chǔ)存。3)馮氏載體的純化和濃縮添加0. 25毫升AAV結(jié)合試劑A到25毫升上述所得的病毒上清液中，并攪拌均勻；在37°C下靜放30-40分種；在5000g離心力的條件下離心15分種；收集上清液并轉(zhuǎn)移到一個(gè)新試管中；將1. 25毫升AAV結(jié)合試劑B加到新試管中， 攪拌均勻；在37°C下靜放30分種；用0. 45微米低蛋白結(jié)合過濾器來過濾上清液，并用干凈 試管收集液體；加3毫升AAV純化基質(zhì)到試管中；將試管放到定軌振蕩器中在4°C的溫度下，振蕩45分鐘；另外，將凈化柱底部的小 部件移除，然后將凈化柱放到到一個(gè)空著的50毫升錐形管中；攪拌振蕩后的試管中的上清 液/基質(zhì)懸浮液，并將其倒入凈化柱中，并用試管收集流出的液體；試管收集的液體再倒回 凈化柱中，用10毫升IXPBS緩沖液清洗試管，并將清洗液也倒入凈化柱中；待液體完全流 過，凈化柱停止滴液的時(shí)候，再加10毫升凈化緩沖劑到凈化柱內(nèi)來沖洗收集的基質(zhì)，之后 再重復(fù)沖洗一遍；將凈化柱轉(zhuǎn)到一個(gè)空著的50毫升的錐形管中；將3毫升提洗緩沖液慢慢 地加入凈化柱，收集流出的液體；上述AAV結(jié)合試劑A的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是Part No. 314001 ；AAV結(jié)合試劑B的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是Part No. 314002 ；AAV純化基質(zhì)的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是Part No. 314003 ；凈化柱的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是Part No. 314107 ；提洗緩沖液的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是PartNo. 314106 ；凈化緩沖劑的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是PartNo. 314105。最后，馮氏載體的濃縮方法是組裝一個(gè)腺衛(wèi)星病毒濃縮裝置；將0. 5毫升步驟ECN 102071219 A
說明書
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最后收集的部分放入到濃縮裝置的樣品貯器中，在2000g離心力下離心5分鐘，濾過的部分 可以丟棄；繼續(xù)濃縮，直到樣本貯器里達(dá)到100微升為止；加300微升IXPBS緩沖液，然后繼 續(xù)離心，直到100微升；用一個(gè)干凈的離心管，通過倒轉(zhuǎn)樣本貯器將濃縮物收集到試管中；再離心并收集 所有的液體。10個(gè)直徑15厘米的細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞中提取載體。純化和濃縮后，最后得到 的總體積100微升，馮氏載體的總數(shù)為IX IO12拷貝。應(yīng)用馮氏質(zhì)粒在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)特定的鋅指核酸酶1)為測定鋅指核酸酶的活性，設(shè)計(jì)一個(gè)酶底物。每一個(gè)新的一對(duì)鋅指核酸酶可以 一起測定也可以單獨(dú)測定。為配對(duì)測定設(shè)計(jì)的酶底物可以是擁有理想天然靶序列或合成靶 序列的質(zhì)粒。為單獨(dú)測定設(shè)計(jì)的酶底物是擁有每一個(gè)識(shí)別序列倒置副本的質(zhì)料。各種消極 控制包括一個(gè)與自然靶基或合成靶基孵育的單一鋅指核酸酶，這個(gè)不能被切割。事實(shí)上， 質(zhì)粒中的非靶序列構(gòu)成一套完整的陰性對(duì)照。
-個(gè)質(zhì)粒表達(dá)-2)從大腸感菌(DH5a)細(xì)胞中純化腺衛(wèi)星病毒II (AAV2)質(zhì)粒( 新的鋅指核酸酶，如圖1圖2分別表示的馮氏質(zhì)粒I，II)。3)將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中。在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)鋅指核 酸酶。圖3馮氏質(zhì)粒III表達(dá)二個(gè)新的鋅指核酸酶。4)用 His 標(biāo)記純化試劑盒(HIS-tagged Protein Purification Kit)純化鋅指核 酸酶，見圖4。用多聚組氨酸(His)抗體來檢查鋅指核酸酶。見圖5。圖5中，用多聚組氨酸(His)抗體來檢查鋅指核酸酶，方法是免疫轉(zhuǎn)印技術(shù) western-blot)。線1，2是馮氏質(zhì)粒I (修飾CCR5基因)表達(dá)特定的鋅指核酸酶。線3，4 是馮氏質(zhì)粒II (修飾CXCR4基因)表達(dá)的鋅指核酸酶。線5，6是馮氏質(zhì)粒III (修飾CXCR4 基因和修飾CCR5基因)。檢查鋅指核酸酶活力1)準(zhǔn)備如下反應(yīng)混合物。脫氧核糖核酸(DNA)基板被假定為一個(gè)質(zhì)粒包含一個(gè)可 以為一對(duì)鋅指核酸酶作用的靶基。共50納克，20微升，相當(dāng)于約1納摩爾(nM)的濃度，取 決于質(zhì)粒的大小。每個(gè)鋅指核酸酶的稀釋液應(yīng)當(dāng)進(jìn)行測定，最終濃度大約相當(dāng)于相當(dāng)于脫 氧核糖核酸(DNA)靶基的摩爾濃度。
數(shù)量 9微升 4微升 2微升成份水5倍鋅指核酸酶反應(yīng)緩沖劑0.5摩爾鹽水20毫摩爾二硫代蘇糖醇(DTT)1 微升2毫克/毫升核糖核酸1微升脫氧核糖核酸(50毫克/毫升)1微升鋅指核酸酶1 (各種稀釋) 1微升鋅指核酸酶2 (各種稀釋) 1微升
濃度 1倍
50毫摩爾
1毫摩爾 100微克 50納克
毫升
最后的體積20微升2)加入1微升的0. 2摩爾的氯化鎂，并在室溫下孵育1小時(shí)來開始反應(yīng)。3)用5微升的停止溶液來終止反應(yīng)，并將每個(gè)樣品加到瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分 析。如圖6，4，7，8號(hào)樣品是完全切割，1，5號(hào)對(duì)照組(陰性)，2，3，6號(hào)是不完全切斷。圖6切割質(zhì)粒來檢查鋅指核酸酶活力。4，7，8號(hào)樣品是完全切割；1，5號(hào)對(duì)照組 (陰性)；2，3，6號(hào)是不完全切斷。應(yīng)用實(shí)施例1)方法A.分離約0. 75億個(gè)人的⑶4細(xì)胞。B.在裝有0.25億個(gè)人的⑶4細(xì)胞試管中，加入2. 5X101(I個(gè)馮氏載體。在另一個(gè) 裝有0. 25億個(gè)人的⑶4細(xì)胞試管中，加入2. 5X101(I個(gè)AAV2克隆載體。在第三個(gè)裝有0. 25 億個(gè)人的⑶4細(xì)胞試管中，加入等體積的生理鹽水。C.混均。在37度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中搖4個(gè)小時(shí)。D.給每個(gè)人化的小鼠移植(尾血管注射)500萬個(gè)經(jīng)馮氏載體處理過的⑶4細(xì)胞。F. 二天前，給每只小鼠注射(腹腔注射)200微升的艾滋病病毒。G.在移植CD4細(xì)胞前，取小量血樣，檢測小鼠體內(nèi)艾滋病病毒含量。H.在小鼠移植CD4細(xì)胞30天后，檢測其血樣，確定各個(gè)個(gè)體愛滋病病毒含量。I.共15只人化小鼠，分三組，每組5只。第一組移植經(jīng)馮氏載體處理過的⑶4細(xì) 胞。第二組移植AAV2克隆載體處理過的⑶4細(xì)胞。第三組移植經(jīng)生理鹽水處理過的⑶4 細(xì)胞。2)結(jié)果如圖7所示，柱體1，4是馮氏載體治療的小鼠，柱體2，5是AAV2克隆載體(空載 體)治療的小鼠，柱體3，6是鹽水治療的小鼠。每個(gè)組5只小鼠，治療30天后，經(jīng)馮氏載體 治療過的艾滋病小鼠艾滋病病毒量急劇下降，艾滋病病毒(HIV-I)含量降至0.05%。
1權(quán)利要求
1.馮氏載體，由包含以下步驟的方法制備 A確定CCR5基因和CXCR4基因的修飾位點(diǎn)；B確定能夠識(shí)別選定的脫氧核糖核酸序列的鋅指核酸酶的氨基酸序列，把這些氨基酸 序列編進(jìn)鋅指核酸酶的編碼筐，得到帶有鋅指核酸酶的離解區(qū)和結(jié)合區(qū)的聚合酶鏈反應(yīng)的 產(chǎn)物；C把帶有鋅指核酸酶的離解區(qū)和結(jié)合區(qū)的聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物克隆到腺衛(wèi)星病毒II 克隆質(zhì)粒中，產(chǎn)生馮氏質(zhì)粒；D用pAAV-RC質(zhì)?；騪Helper質(zhì)粒和馮氏質(zhì)粒來共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，得到新的病毒 載體即馮氏載體； E馮氏載體的純化； F馮氏載體濃縮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馮氏載體的制備方法，其特征是 CCR5基因修飾位點(diǎn)為263 aCTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTg 289 263 tGATACGACGGCGGGTCACCCTGAAAc 289 CXCR4基因修飾位點(diǎn)為 427 aacagtcagaggccaaggaagctgttg 453 427 ttgtcagtctccggttccttcgacaac 453。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馮氏載體的制備方法，其特征是步驟B包括下列過程1)選定能夠識(shí)別CCR5基因和CXCR4基因的的鋅指核酸酶的氨基酸序列，把這些序列插 入到相應(yīng)的鋅指核酸酶編碼筐當(dāng)中；2)為鋅指核酸酶的區(qū)段設(shè)計(jì)脫氧核糖核酸編碼序列；3)合成帶有鋅指核酸酶編碼序列的低聚核苷酸；4)用3)合成的低聚核苷酸作為引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，得到帶有鋅指核酸酶的離解 區(qū)和結(jié)合區(qū)的產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的馮氏載體的制備方法，其特征是為鋅指核酸酶的區(qū)段設(shè)計(jì) 的脫氧核糖核酸編碼序列為識(shí)別CCR5基因鋅指核酸酶結(jié)合區(qū)編碼序列為Cggatccatggagccctatgcttgccctgtcgagtcctgcgatcgccgcttttctacttct MEPYACPVESCDRRFSTS ggtaatttggttcgtcacatccggatccacacgggccagaagcctttccagtgtcgaata GNLVRHIRIHTGQKPFQCRI tgcatgcgtaacttcagtcgcaccgataccttacgcgatcatatacgaacacatacaggt CMRNFSRTDTLRDHIRTHTG gagaagccttttgcctgtgacatttgtgggaggaagttttcccgaaccgatacccttcga EKPFACDICGRKFSRTDTLR Gatcataccaaaatccatttaagacagaagcaaagctt DHTKIHLRQKQS ， 識(shí)別CXCR4基因鋅指核酸酶結(jié)合區(qū)編碼序列為cggatccatggagccctatgcttgccctgtcgagtcctgcgatcgccgcttttctacatcgMEPYACPVESCDRRFS TSggagcactcacacggcacatccggatccacacgggccagaagcctttccagtgtcgaataGALTR HIRIHTGQKPFQCRItgcatgcgtaacttcagtcagagtagtgacctaacaagacatatacgaacacatacaggtCMRNFS QSSDLT R H I R T H T GgagaagccttttgcctgtgacatttgtgggaggaagttttcccaatcaggcaatcttgccEKPFACDICGRKFSQSGNLAcgacataccaaaatccatttaagacagaagcaaagcttRHTKIHLRQKQS
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馮氏載體的制備方法，其特征是步驟C包括下列過程1)在一個(gè)干凈的管子消化1微克的腺衛(wèi)星病毒II克隆質(zhì)粒和1微克步驟B所得的聚 合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物；2)純化所需要的片段，包括大的片段即載體片段和插入片段中的小片段即插入片段；3)連接把100-200納克載體片段和300-600納克的插入片段放入一個(gè)20微升的反 應(yīng)中，用脫氧核糖核酸連接酶T4在室溫中反應(yīng)2-4個(gè)小時(shí)；4)用灑精沉淀法純化連接好的脫氧核糖核酸；5)用2微升純化了的連接物轉(zhuǎn)化到大腸感菌Dffia細(xì)胞中，用含有青霉素的培養(yǎng)皿篩選；6)從培養(yǎng)皿中挑選菌落，放入50毫升含青霉素100微克/毫升的普通培養(yǎng)液LB中，培 養(yǎng)16-18個(gè)小時(shí)；7)從6)得到的大腸感胞中，提取，純化質(zhì)粒，得到腺衛(wèi)星病毒II-鋅指核酸酶 質(zhì)粒，即馮氏質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馮氏載體的制備方法，其特征是步驟D包括下列過程1).使用已傳代2-3次的HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)這些細(xì)胞直到單層已經(jīng)70-80%密度；2).用pAAV-RC質(zhì)粒、pHelper質(zhì)粒和馮氏質(zhì)粒來共同轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞；3).經(jīng)過48-72小時(shí)培養(yǎng)，用錐形管來收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞和其培養(yǎng)液，在2500-3000轉(zhuǎn)/分 鐘的條件下分離5-10分鐘，丟棄上清液，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞分離出來，然后用無血清的細(xì)胞培養(yǎng) 液混合；4).將錐形管交替放到干冰乙醇和36 38°C的溫水中，使這些細(xì)胞懸浮液經(jīng)過4次冷 凍/解凍循環(huán)交替的過程；5).將4)中經(jīng)最后解凍的的錐形管在10，OOOg離心力的條件下進(jìn)行離心10-15分鐘來 收集上清液；然后，6).在55 57°C的條件下放置30-40分種；7).通過一個(gè)0.45微米的低蛋白結(jié)合濾器來過濾，得到所需的病毒清液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馮氏載體的制備方法，其特征是步驟E包括下列過程1).添加0.25毫升AAV結(jié)合試劑A到25毫升步驟D所得的病毒上清液中，并攪拌均勻；2).在36 38°C下靜放30-40分種；3).在5000g離心力的條件下離心15-20分種；4).收集幻的上清液并轉(zhuǎn)移到一個(gè)新試管中；5).將1.25毫升AAV結(jié)合試劑B加到4)的上清液中，攪拌均勻；6).在36 38°C下靜放30-40分鐘；7).用0.45微米低蛋白結(jié)合過濾器來過濾6)的上清液，并用干凈試管收集液體；8).加3毫升AAV純化基質(zhì)到7)的試管中；9).將試管放到定軌振蕩器中在4 8°C下振蕩30分鐘一60分鐘；10).將凈化柱底部的小部件移除，然后將凈化柱放到到一個(gè)空著的50毫升錐形管中；11).攪拌9)所得試管中的上清液/基質(zhì)懸浮液，并將其倒入凈化柱中，并用試管收集 流出的液體；試管收集的液體再倒回凈化柱中，用10毫升IX PBS緩沖液清洗試管，并將清 洗液也倒入凈化柱中；12).待液體完全流過，凈化柱停止滴液的時(shí)候，再加10毫升凈化緩沖劑到凈化柱內(nèi)來 沖洗收集的基質(zhì)，之后再重復(fù)沖洗一遍；13).將凈化柱轉(zhuǎn)到一個(gè)空著的50毫升的錐形管中；14).將3毫升提洗緩沖液慢慢地加入凈化柱，收集流出的液體； 上述AAV結(jié)合試劑A的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是I^art No. 314001 ； AAV結(jié)合試劑B的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是Part No. 314002 ； AAV純化基質(zhì)的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是Part No. 314003 ； 凈化柱的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是PartNo. 314107 ； 提洗緩沖液的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是PartNo. 314106 ； 凈化緩沖劑的牌號(hào)是ViraBind ，商品號(hào)是PartNo. 314105。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馮氏載體的濃縮方法，其特征是步驟F包括下列過程1).組裝一個(gè)腺衛(wèi)星病毒濃縮裝置；2).將0.5毫升步驟E最后收集的部分放入到濃縮裝置的樣品貯器中，在2000g離心力 下離心5-8分鐘，濾過的部分可以丟棄；3).繼續(xù)濃縮，直到樣本貯器里達(dá)到100微升為止；4).加300-400微升IXPBS緩沖液，然后繼續(xù)離心，直到100微升；5).用一個(gè)干凈的離心管，通過倒轉(zhuǎn)樣本貯器將濃縮物收集到試管中；6).再離心并收集所有的液體。
9.權(quán)利要求1所述的馮氏載體治療愛滋病的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療艾滋病的基因藥物，具體是改腺載體——一種改造過的能表達(dá)鋅指核酸酶的腺衛(wèi)星病毒載體。該藥物由包含以下步驟的方法制備A確定CCR5基因和CXCR4基因的修飾位點(diǎn)；B確定能夠識(shí)別選定的脫氧核糖核酸序列的鋅指核酸酶的氨基酸序列，把這些氨基酸序列編進(jìn)鋅指核酸酶的編碼筐，得到帶有鋅指核酸酶的離解區(qū)和結(jié)合區(qū)的聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物；C把帶有鋅指核酸酶的離解區(qū)和結(jié)合區(qū)的聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物克隆到腺衛(wèi)星病毒II克隆質(zhì)粒中，產(chǎn)生改腺質(zhì)粒；D用pAAV-RC質(zhì)粒、pHelper質(zhì)粒和改腺質(zhì)粒來共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，得到新的病毒載體即改腺載體；E改腺載體的純化；F改腺載體濃縮。該藥物能在人和動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的鋅指核酸酶能在特定位點(diǎn)修飾CXCR4和CCR5基因，破壞它的功能，因而可以在艾滋病預(yù)防和治療中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N7/01GK102071219SQ201010534229
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者馮小榮, 周江艷, 彭千芮 申請(qǐng)人:馮小榮, 彭千芮