專利名稱：一種基于組織芯片的腫瘤特異性靶點及靶向配體篩選方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于組織芯片的腫瘤特異性靶點和靶向配體的篩選方法。
背景技術：
腫瘤已成為嚴重威脅人類健康的疑難病癥之一，正在超越心血管疾病成為人類第一死亡原因。腫瘤的傳統(tǒng)治療手段主要是手術、放療和化療。這些治療手段除了切除和破壞腫瘤組織外，由于其無靶向性，對正常的組織、細胞也產(chǎn)生較大破壞。靶向治療是現(xiàn)代腫瘤治療領域的重要進展，其在腫瘤分子細胞生物學的基礎上， 將腫瘤組織或細胞所具有的特異性結構分子作為靶點，使用某些能與這些靶分子特異結合的抗體、配體等，達到直接治療或靶向治療目的。靶向治療涉及到兩個方面，即靶點及靶向載體。靶向治療的靶點通常是細胞癌變后所表達的不同于正常細胞的生物分子，主要是各類蛋白。腫瘤細胞既含有正常細胞所表達的蛋白，同時還會含有某些正常細胞沒有的蛋白或者缺失某些正常細胞表達的蛋白，這些腫瘤細胞特異性表達的蛋白的變化就為腫瘤的靶向治療提供了基礎。靶向治療的載體是具有一定特異性的，能將生物活性物質選擇性地運送到腫瘤部位，把治療藥物的作用盡量限定在特定的靶細胞、組織或器官內，而不影響正常細胞、組織或器官功能的一類載體。小分子配體是靶向治療的理想載體。小分子配體與目前使用的抗體載體相比有著很大優(yōu)勢可以快速穿透組織及細胞；血液清除速率高；體外合成簡單，質控容易。常用的小分子配體篩選系統(tǒng)有(1)固相或液相純化抗原的篩選；(2)建系細胞篩選；(3)荷瘤裸鼠篩選；(4)組織切片篩選。其中固相或液相純化抗原的篩選系統(tǒng)只能用于篩選和已知抗原相結合的配體，具有局限性。建系細胞篩選系統(tǒng)篩選到的配體只能針對某一特定的細胞亞型，無法克服腫瘤的異質性帶來的篩選到的配體通用性不高的缺點。荷瘤裸鼠篩選系統(tǒng)雖然最大的保持了靶蛋白的原始狀態(tài)，但是篩選到的配體通用性不高。而組織切片篩選系統(tǒng)由于同一腫瘤內的異質性和不同病人間的差異也存在所篩選到的配體通用性不高的缺陷。因此，現(xiàn)有的篩選技術中急需一種可以篩選到高特異性、高通量、可針對某一類型腫瘤的配體并可同時確定腫瘤標志物的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中藥物或靶向治療通用性不高、篩選系統(tǒng)與腫瘤在體生存環(huán)境差距大、篩選通量小、費時費力的缺點，提供一種基于組織芯片的腫瘤特異性靶點和靶向配體的篩選方法。本發(fā)明的基于組織芯片的腫瘤特異性靶點和靶向配體的篩選方法包括如下步驟(a).將正常組織芯片進行抗原修復的預處理后，進行內源性酶封閉處理，然后加入配體庫，使配體與正常組織上表達的抗原結合；(b).洗滌正常組織芯片，從而得到大量未與正常組織結合的配體混合物；(c).將步驟(b)中得到的配體混合物加入到經(jīng)過抗原修復且封閉了內源性酶的腫瘤組織芯片上，使配體與腫瘤組織上表達的特異性抗原結合；(d).除去步驟(C)中未與腫瘤組織芯片結合的配體后，用洗脫液洗滌腫瘤組織芯片從而得到大量與腫瘤組織結合的噬菌體混合物；(e).將步驟(d)中得到的噬菌體混合物進行擴增，然后純化，再重復步驟 (a) - (d) 3次以上，且逐輪提高洗脫強度，以增加生物淘選力度，得到不與正常組織結合，但特異性結合腫瘤組織的配體混合物；(f).將步驟(e)中得到的特異性結合腫瘤組織的配體混合物進行序列分析，選出共有序列高的特異性配體；(g).將步驟(f)中篩選到的共有序列高的特異性配體返回到淘選時所用的腫瘤組織芯片上進行驗證，然后對所得到的配體進行特異性和通量分析；(h).利用特異性配體來鑒定其所結合的抗原。所述步驟(a)中的預處理為常規(guī)芯片處理，即石蠟組織芯片進行二甲苯脫蠟/冰凍組織芯片進行冰丙酮固定后，分別浸泡在無水乙醇-90%乙醇-80%乙醇-蒸餾水中進行逐級水化。所述步驟(a)中的進行封閉、消除內源性酶目的在于降低非特異性結合。其中封閉液可采用血清、BSA等常規(guī)封閉液。所述步驟(a)中的抗原修復包括目前使用的任何方法。如真空負壓抗原修復法、 微波輻射抗原修復法、高壓抗原修復法、隔水熱抗原修復法、電爐加熱抗原修復法、胃蛋白酶消化法和胰蛋白酶消化法。但是不限于上述抗原修復方法。所述步驟(a)中的配體庫包括目前使用的任何配體庫，如噬菌體隨機肽庫、噬菌體抗體庫、mRNA展示肽庫、核糖體展示肽庫、RNA隨機庫、PNA等，但不限于以上所述配體庫。所述步驟(b)中的正常組織芯片與步驟(C)中的腫瘤組織芯片的供體種屬來源包括人、猴、大鼠、小鼠、豬、兔及豚鼠，不同的組織來源包括肺、肝、胃、食道、舌、十二指腸、小腸、結腸、直腸、甲狀腺、甲狀旁腺、腎、腎上腺、胰腺、前列腺、大腦、小腦、骨骼肌、心肌、平滑肌、血管、垂體、睪丸、卵巢、表皮、視網(wǎng)膜、骨、軟骨、眼、胎盤、脾臟、腮腺、下頌腺、胸腺等，細胞來源包括ifep-2細胞、粒細胞、血小板等，但不限于上述所述細胞或組織來源。上述組織芯片的基質包括石蠟組織、冰凍組織和/或培養(yǎng)細胞。所述步驟(f)中的驗證方法包括免疫組織化學、免疫熒光、原位雜交等，但不限于以上所述檢測方法。所述步驟(h)中所述鑒定抗原的方法包括但不限于免疫沉淀、雙向電泳、親和層析等方法。所述(a)-(h)步驟中可使用任何適當?shù)南疵撘?。洗脫液可含?% -2% (w/v)的表面活性劑，洗脫可持續(xù)適當?shù)臅r間，如5-30分鐘。所述(a)-(h)步驟中的配體庫與組織芯片的結合可以在任何適當?shù)臏囟认逻M行，如4°C -70°C。結合時間可控制在至過夜。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是1.篩選到的靶向配體有較高的特異性，可穿越腫瘤細胞，不會引起免疫反應；同時通用性高，可以針對多數(shù)病人某一類型的腫瘤。2.由于組織芯片技術已經(jīng)成熟，本發(fā)明有了很廣泛的引用，與純抗原和建系細胞的篩選系統(tǒng)相比，本篩選系統(tǒng)保持了腫瘤在體生長時原始狀態(tài)；與荷瘤小鼠篩選系統(tǒng)相比， 由于不需要進行動物的飼養(yǎng)，本發(fā)明省時，省力，節(jié)約成本，且實驗結果可比性強。3.與傳統(tǒng)篩選系統(tǒng)相比，本發(fā)明可同時進行腫瘤特異性靶點分析和靶向配體的研4.本發(fā)明的驗證方法簡單，只要進行免疫組化、免疫熒光或原位雜交即可對篩選到的配體在腫瘤組織中的特異性和定位進行分析，操作簡單。


圖1是篩選出的噬菌體克隆返回肺鱗狀細胞癌組織芯片進行特異性結合驗證的結果2是篩選出的噬菌體克隆返回肺正常組織芯片進行特異性結合驗證的結果圖 (其中未見明顯的棕黃色染色)A 染為棕黃色的特異性結合肺鱗狀細胞癌組織的配體
具體實施例方式I.材料Ph. D. -7 Phage Display Peptide Library Kit 購自 New England Biolabs(Beijing)Co. Ltd ；肺鱗狀細胞癌(中分化)組織芯片CS04-03-001、肺正常組織 (多個部位)組織芯片NC04-01-001及驗證試驗中用到的CS04-03-002，均購自陜西超英生物科技有限公司。IPTG為Merck分裝，Χ-gal為BDX分裝，PEG-8000為Amersco分裝。噬菌體隨機序列的測定由上海生工技術公司完成；免疫組化中使用到的 HRP-Anti-M13單克隆抗體購自GE，封閉血清，DAB顯色試劑盒，蘇木素復染液均購自中杉金橋公司。其他使用的一些常規(guī)試劑和材料可參考《分子克隆實驗室指南》中所列舉的，在此不做詳細描述。II.具體實施例1.噬菌體肽庫的擴增、純化及其滴度測定A.噬菌體肽庫的擴增與純化(I)Ph. D. -7 Phage Display Peptide Library Kit 中的 ER2738 菌在 LB-Tet 平板上接種劃線，倒置平板，37°C培養(yǎng)過夜。(2)挑取ER2738單克隆菌接種于20ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期。(3)從 Ph. D.-7 Phage Display Peptide Library Kit 中取 2ul 噬菌體，加入到 (2)的培養(yǎng)物中繼續(xù)培養(yǎng)4. ^！。(4)培養(yǎng)物在4°C條件下，IOOOOrpm離心lOmin，上清液繼續(xù)進行同樣離心操作。
(5)將上清液的80%轉移，在其中加入1/6體積的PEG/NaCl，讓噬菌體4°C沉淀過夜。(6)過夜培養(yǎng)物在4°C條件下，IOOOOrpm離心15min，棄掉上清液，然后重復此操作一次。(7)沉淀物重懸于Iml TBS中，在4°C條件下，IOOOOrpm離心5min，使殘余細胞沉淀。 (8)上清液用1/6體積的PEG/NaCl再沉淀，并在冰上孵育30min。(9)在4°C條件下，IOOOOrpm離心lOmin，棄上清液，重復此操作一次。(10)沉淀物重懸于200ul TBS，0. 02% NaN3中，離心lmin，沉淀任何殘余的不溶物，上清液轉入新鮮管中，此即擴增后的洗脫物。B.噬菌體肽庫滴度測定(1)接種ER2738單菌落于5-10ml LB培養(yǎng)基中，搖動培養(yǎng)至對數(shù)中期(0D_ 0. 5)。(2)細胞生長時，微波爐融化上層瓊脂，分成3ml等份于滅菌試管中，保存于45°C 水浴中備用。(3) 37°C預溫LB/IPTG/Xgal平板，每個噬菌體稀釋度取一個平板備用。(4)將擴增、純化后的噬菌體進行梯度稀釋。(5)當菌體培養(yǎng)物達對數(shù)中期，分成每份200 μ 1等份于微量離心管中，每個噬菌
體稀釋度一管。(6)每管加入10 μ 1不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫溫育5min。(7)將感染細胞加入45°C預溫的上層瓊脂培養(yǎng)管中，每次一管，快速混勻，立即傾注于37°C預溫的LB/IPTG/Xgal平板上。適當傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開。(8)待平板冷卻5min后，倒置，于37°C條件下培養(yǎng)過夜。(9)檢查平板，計算有約IO2個噬菌斑的平板上的斑數(shù)。然后用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10 μ 1噬菌體的空斑形成單位(Pfu)，即滴度。2.噬菌體淘選Α.組織芯片預處理將組織芯片于恒溫烘箱中加熱，后進行二甲苯脫蠟，分別用無水乙醇、95%乙醇、 85%乙醇、70%乙醇及去離子水進行逐級水化；將處理好的組織芯片進行內源化酶的消除， 即用3%的H2O2浸泡lOmin，以降低非特異性染色。組織芯片用檸檬酸緩沖液進行微波熱修復后即可進行后續(xù)淘選過程。應理解的是，本具體實施例中才用微波熱修復并不限制本發(fā)明的使用范圍，高壓熱修復、酶修復法可根據(jù)具體實驗需要選擇。B.淘選(1)用免疫組化筆在組織芯片上劃定反應區(qū)域，加封阻液，4°C過夜。(2)甩掉組織芯片上的封阻液，用0.05%TBST緩沖液洗6次。每次均旋轉以使各個部位均被洗到，甩去TBST緩沖液。(3)用0. 05% TBST緩沖液稀釋擴增后的噬菌體至合適滴度，然后取150ul加到組織芯片NC04-01-001上，室溫溫和搖動60min。
(4)將組織芯片NC04-01-001上的噬菌體溶液的大部分轉移到組織芯片 CS04-03-001上，室溫溫和搖動60min。剩余少量(約1 μ 1)用于測定滴度。(5)留下組織芯片CS04-03-001上的噬菌體溶液做滴度測定用。然后用0. 05% TBST緩沖液洗10次組織芯片CS04-03-001，取第十次的洗液做滴度檢測，用于初步判斷 0. 05% TBST洗板效果，即每一輪淘選的特異性，該操作同樣適用于組織芯片NC04-01-001。(6)用 150ul 非特異性緩沖液 0. 2M Glycine-HCl (ρΗ2· 2)，lmg/ml BSA 來分離已結合的噬菌體，溫和搖動lOmin，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中。然后再用22. 5μ 1 IM Tris-HCl (ρΗ9. 1)中和上述洗脫液。此方法適用于同一輪淘選中的組織芯片NC04-01-001 和組織芯片CS04-03-001。(7)按上述常規(guī)噬菌體滴度測定方法測定少量(約1 μ 1)洗脫物的滴度。(8)將剩余洗脫物加入到20ml ER2738培養(yǎng)物中(菌體應當處于對數(shù)前期)，37°C 劇烈搖動培養(yǎng)4.證。(9)將培養(yǎng)物轉入一離心管中，然后4°C IOOOOrpm離心lOmin。上清液轉入另一
離心管中，再離心。(10)將上清的上部80%轉入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl。讓噬菌體 4 °C沉淀過夜。(11)在4°C條件下IOOOOrpm離心PEG沉淀15min。倒掉上清液，再短暫離心，吸去
殘留上清液。(12)沉淀物重懸于Iml TBS中，懸液轉入微量離心管中，在4°C條件下離心5min 使殘余細胞沉淀。(13)上清液轉入另一新鮮微量離心管，用1/6體積的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育 30min。在4°C條件下離心lOmin，棄上清液，再短暫離心，用微量移液器吸去殘余上清液。(14)沉淀物重懸于200 μ 1 TBS, 0. 02% NaN3中。離心lmin，沉淀任何殘余的不溶物。上清轉入新鮮管中。此即為擴增后的洗脫物。(15)根據(jù)上述常規(guī)方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定擴增后的洗脫物滴度。剩余洗脫物在4°C條件下貯存。(16)根據(jù)計數(shù)板上藍斑數(shù)來確定滴度。用這個值來計算相應于初始的噬菌體加入量。(17)進行第二輪淘選用第一輪淘選擴增的洗脫物中相當于第一輪初始加入量的噬菌體量重復步驟(1)-(16)，在清洗步驟中將Tween的濃度增至0. 1% (w/v)。(18)在LB/IPTG/Xgal平板上測定第二輪淘選所得洗脫物擴增后的滴度。(19)進行第三輪淘選用第二輪淘選擴增的洗脫物中相當于第一輪初始加入量的噬菌體量重復步驟(1)-(16)，清洗步驟中用0.5% (w/v)的Tween。(20)在LB/IPTG/Xgal平板上測定第三輪淘選所得洗脫物未擴增時的滴度。第三輪洗脫物不必再擴增，滴度測定時得到的噬菌斑可做測序用，只要注意平板培養(yǎng)時間不要超過18小時，培養(yǎng)時間過長容易出現(xiàn)缺失。其余洗脫物在4°C條件下貯存。整個淘選過程采用扣除淘選法，即先用正常組織結合噬菌體溶液，未結合的溶液再用肺鱗癌組織去結合，便能獲得肺鱗癌特異性的噬菌體多肽，并采用逐步提高TBST中 Tween-20濃度的方法來除去非特異性結合的噬菌體。為了初步判斷三輪淘選后所得噬菌體對肺鱗癌是否有特異性結合，我們設置了不同的檢測點，檢測結果見表1。表 權利要求
1.一種基于組織芯片篩選腫瘤特異性靶點和靶向配體的方法，包括組織芯片預處理、 噬菌體擴增與純化、噬菌體序列分析、抗原鑒定，其特征在于(a).將正常組織芯片進行抗原修復的預處理后，進行內源性酶封閉處理，然后加入配體庫，使配體與正常組織上表達的抗原結合；(b).洗滌正常組織芯片，從而得到大量未與正常組織結合的配體混合物；(c).將步驟(b)中得到的配體混合物加入到經(jīng)過抗原修復且封閉了內源性酶的腫瘤組織芯片上，使配體與腫瘤組織上表達的特異性抗原結合；(d).除去步驟(c)中未與腫瘤組織芯片結合的配體后，用洗脫液洗滌腫瘤組織芯片從而得到大量與腫瘤組織結合的噬菌體混合物；(e).將步驟(d)中得到的噬菌體混合物進行擴增，然后純化，再重復步驟(a)_(d)3次以上，且逐輪提高洗脫強度，得到不與正常組織結合，但特異性結合腫瘤組織的配體混合物；(f).將步驟(e)中得到的特異性結合腫瘤組織的配體混合物進行序列分析，選出共有序列高的特異性配體；(g).將步驟(f)中篩選到的共有序列高的特異性配體返回到淘選時所用的腫瘤組織芯片上進行驗證，然后對所得到的配體進行特異性和通量分析；(h).利用特異性配體來鑒定其所結合的抗原。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于組織芯片篩選腫瘤特異性靶點和靶向配體的方法，其特征在于所述步驟(a)中的預處理為常規(guī)芯片處理，即石蠟組織芯片進行二甲苯脫蠟/冰凍組織芯片進行冰丙酮固定后，逐級水化。
3.根據(jù)權利要求1所述的基于組織芯片篩選腫瘤特異性靶點和靶向配體的方法，其特征在于所述步驟(a)中的封閉液包括血清、BSA。
4.根據(jù)權利要求1所述的基于組織芯片篩選腫瘤特異性靶點和靶向配體的方法，其特征在于所述步驟(a)中的抗原修復方法包括真空負壓抗原修復法、微波輻射抗原修復法、 高壓抗原修復法、隔水熱抗原修復法、電爐加熱抗原修復法、胃蛋白酶消化法和胰蛋白酶消化法。
5.根據(jù)權利要求1所述的基于組織芯片篩選腫瘤特異性靶點和靶向配體的方法，其特征在于所述步驟(a)中的配體庫包括噬菌體隨機肽庫、噬菌體抗體庫、mRNA展示肽庫、核糖體展示肽庫、RNA隨機庫、PNA。
6.根據(jù)權利要求1所述的基于組織芯片篩選腫瘤特異性靶點和靶向配體的方法，其特征在于所述步驟(b)中的正常組織芯片與步驟(c)中的腫瘤組織芯片的供體的種屬來源包括人、猴、大鼠、小鼠、豬、兔及豚鼠，不同的組織來源包括肺、肝、胃、食道、舌、十二指腸、 小腸、結腸、直腸、甲狀腺、甲狀旁腺、腎、腎上腺、胰腺、前列腺、大腦、小腦、骨骼肌、心肌、平滑肌、血管、垂體、睪丸、卵巢、表皮、視網(wǎng)膜、骨、軟骨、眼、胎盤、脾臟、腮腺、下頌腺、胸腺，細胞來源包括ifep-2細胞、粒細胞、血小板。
7.根據(jù)權利要求1所述的基于組織芯片篩選腫瘤特異性靶點和靶向配體的方法，其特征在于所述組織芯片的基質包括石蠟組織、冰凍組織和/或培養(yǎng)細胞。
8.根據(jù)權利要求1所述的基于組織芯片篩選腫瘤特異性靶點和靶向配體的方法，其特征在于所述步驟(f)中的驗證方法包括免疫組織化學、免疫熒光、原位雜交。
9.根據(jù)權利要求1所述的基于組織芯片篩選腫瘤特異性靶點和靶向配體的方法，其特征在于所述步驟(h)中鑒定抗原的方法包括免疫沉淀、雙向電泳、親和層析。
10.根據(jù)權利要求1所述的基于組織芯片篩選腫瘤特異性靶點和靶向配體的方法，其特征在于所述洗脫液含有0%-2% (w/v)的表面活性劑，洗脫時間持續(xù)5-30分鐘。
11.根據(jù)權利要求1所述的基于組織芯片篩選腫瘤特異性靶點和靶向配體的方法，其特征在于所述配體庫與組織芯片的結合溫度為4°C -70°C，結合時間為池至過夜。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于組織芯片的腫瘤特異性靶點及靶向配體篩選方法。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中藥物或靶向治療通用性不高、篩選系統(tǒng)與腫瘤在體生存環(huán)境差距大、篩選通量小、費時費力的缺點，提供一種利用組織芯片篩選腫瘤特異性靶點及靶向配體的方法。利用本發(fā)明篩選到的靶向配體有較高的特異性，可穿越腫瘤細胞，不會引起免疫反應，通用性高。本篩選方法保持了腫瘤在體生長時原始狀態(tài)，與荷瘤小鼠篩選系統(tǒng)相比，省去了動物飼養(yǎng)步驟，省時、省力、節(jié)約成本，且實驗結果可比性強。與傳統(tǒng)篩選系統(tǒng)相比，本發(fā)明可同時進行腫瘤特異性靶點分析和靶向配體的研究，且驗證方法簡單。
文檔編號C12Q1/68GK102466729SQ201010533738
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月5日 優(yōu)先權日2010年11月5日
發(fā)明者馮娟, 張記軍, 趙嶺, 鐘儒剛, 馬雪梅 申請人:北京工業(yè)大學