專利名稱：改良染色體制備組織細胞培養(yǎng)方法
改良染色體制備組織細胞培養(yǎng)方法本發(fā)明涉及改良染色體制備組織細胞培養(yǎng)方法，主要用于醫(yī)學領域的細胞遺傳、 出生缺陷或產前診斷實驗室作染色體制備及其核型分析的組織細胞培養(yǎng)。染色體是細胞核中的遺傳物質，人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為決定男女性別的性染色體。染色體上載有遺傳信息的基因，染色體結構或數目的異常，會引起相應的病變或生物學功能的改變。為了研究組織細胞中染色體的結構與功能，需要做以下三步預實驗操作其一是待檢組織塊的培養(yǎng)前處理，目的是使之成為單個細胞或近乎單個細胞的細胞團，以有利于細胞貼壁生長。經典的處理方法是無菌操作取組織塊5 10mg，以無菌生理鹽水洗滌3 次后，剪碎組織塊(盡量達到近單個細胞狀)，以0. 25%胰酶或膠原酶Iml消化，5 10分鐘后，輕輕振搖，待大塊組織自然下沉后，吸取上層單個細胞和較小的組織，置離心管中， 1000r/min離心lOmin，吸棄上層液，用無菌生理鹽水洗3次，沉淀物轉至2個培養(yǎng)瓶中，加 3 5ml細胞培養(yǎng)液。其二是細胞培養(yǎng)，經典的培養(yǎng)方法是將培養(yǎng)瓶置37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中、半開啟瓶蓋、培養(yǎng)M 4 后，顯微鏡下觀察細胞生長情況，見有單個細胞生長時， 換液，此后每隔1 2天觀察、換液一次，當細胞長至60% 80%融合并表現良好的活力時，可收獲細胞作染色體制片。其三是染色體制備，使染色體成形，以供染色體核型分析等 Z用ο經典的組織塊培養(yǎng)前處理方法存在以下的缺點①是需用小剪刀反復剪碎組織塊 20 30分鐘，費時費力。②是需要用胰酶或膠原酶消化5 10分鐘，消化后需用無菌生理鹽水懸浮細胞、離心沉淀、重復洗滌3次以去除殘余的酶，此過程操作繁瑣，酶試劑費用昂貴、易失效，會對細胞造成損傷，此外，長時間的消化會破壞細胞膜表面的整合素，從而影響細胞的粘附力，并造成細胞外基質合成時基因表達的改變，從而影響細胞合成胞外基質、維持表型及增殖的能力，很難實現細胞體外生長和擴增的目的。③操作過程步驟多，易污染而致細胞培養(yǎng)失敗。經典組織細胞培養(yǎng)方法的缺點是因為組織細胞需要在37°C、5% CO2的環(huán)境中生長，在細胞培養(yǎng)的過程中，如果把培養(yǎng)瓶的蓋子擰緊，則培養(yǎng)瓶外(培養(yǎng)箱中)的CO2就難以進入培養(yǎng)瓶內，從而影響細胞生長；反之，如果為了使培養(yǎng)瓶內與培養(yǎng)箱中的CO2含量處于平衡狀態(tài)，則需要以半開啟或全開啟培養(yǎng)瓶蓋的方式培養(yǎng)，特別是在培養(yǎng)時間長的情況下， 培養(yǎng)瓶外(培養(yǎng)箱中)的微生物很容易進入培養(yǎng)瓶內而造成污染，致使細胞培養(yǎng)失敗。本發(fā)明人為了解決上述問題，提出了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是要提供改良染色體制備組織細胞培養(yǎng)方法，它能夠有效地消除經典組織塊培養(yǎng)前處理方法的缺點及經典組織細胞培養(yǎng)方法的缺點。本發(fā)明的目的是這樣實現的用無菌生理鹽水洗滌待檢組織塊，然后置于特制的組織研磨器中，研磨10 30秒鐘，加常規(guī)細胞培養(yǎng)液1 3mL，懸浮細胞，移入防污染的細胞培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋，37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本發(fā)明簡略了經典方法中需要反復剪碎組織塊、膠原酶消化、重復洗滌和離心沉淀的過程，消除了由此產生的實驗影響因素，同時使用了特制的培養(yǎng)瓶，既能有效地預防細胞培養(yǎng)過程的細菌污染，又能確保細胞培養(yǎng)過程中所需的(X)2含量和濕度。本發(fā)明可大大提高工作效率和細胞培養(yǎng)成功率、節(jié)省實驗成本。

圖1是根據本發(fā)明提出的防污染細胞培養(yǎng)瓶的剖面圖。圖2是根據本發(fā)明提出的組織研磨器的剖面圖。下面結合圖1和圖2，對本發(fā)明所提供的改良染色體制備組織細胞培養(yǎng)方法作詳細的描述。如圖1所示，防污染培養(yǎng)瓶1由塑料制成，其中培養(yǎng)瓶壁底2內表面光滑平整，在組織細胞靜置培養(yǎng)的過程中，起初懸浮于液體培養(yǎng)基的組織細胞沉淀并貼壁在培養(yǎng)瓶壁底 2內表面呈細胞集團生長，瓶頸外口呈螺紋狀，與瓶蓋3內螺紋相接，兩者擰緊時呈密封狀態(tài)，蓋頂4為具有目前微生物實驗室通用的普通濾菌器的結構與功能，由石棉板制成，或由硅藻土和石棉混合制成，含有微細小濾孔，孔徑一般不超過0. 15 0. 22 μ m,但不小于44A， 這些小孔能機械性地過濾細菌、真菌等微生物，阻止這類微生物進入培養(yǎng)瓶內，而二氧化碳、水蒸汽等小分子氣體則能自由通過，進入培養(yǎng)瓶內，所以在細胞培養(yǎng)過程中，使用具有濾菌器結構和功能的蓋頂4的組織細胞培養(yǎng)瓶，當擰緊瓶蓋后，既可使組織細胞在規(guī)定的二氧化碳濃度和水份濕度的條件下生長，又可起到防止細菌、真菌等微生物進入培養(yǎng)瓶內而污染作用。蓋頂4的功能可設置在瓶壁、瓶底、瓶頸及瓶蓋的其他部位。如圖2所示，組織研磨器由研棒1和研杯2組成，研杯2的口徑為0. 5 20cm，研杯高為1 20cm，研棒1的大小和長度與研杯2相配套，以方便使用為標準。研棒1和研杯 2以瓷、玻璃、瑪瑙、氧化鋁或鐵為材料制成，也可以玻璃或塑料為材料制成的一次性用品。本發(fā)明具體的實施步驟是用無菌生理鹽水洗凈待檢組織塊，去除組織塊表面的污物或污染的細胞、血跡等，如疑有微生物污染，可用含100U/mL雙抗(青霉素、鏈霉素)的 PBS液浸泡或沖洗3次，對大的組織塊可考慮浸泡于75%灑精中5 10分鐘后再用無菌生理鹽水沖凈，取組織塊中部處理、培養(yǎng)。將已作預處理的組織塊置于本發(fā)明提供的組織研磨器中，研磨10 30秒鐘，加常規(guī)細胞培養(yǎng)液1 3mL，懸浮細胞，移入本發(fā)明提供的防污染細胞培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)M 4 后，顯微鏡下觀察細胞生長情況，見有單個細胞生長時，換液，此后每隔1 2天觀察、換液一次，當細胞長至 60 % 80 %融合并表現良好的活力時，可收獲細胞作常規(guī)染色體制片，使染色體成形，以供染色體核型分析等之用。
權利要求
1.一種用于醫(yī)學領域的改良染色體制備組織細胞培養(yǎng)方法，其主要特征是設計組織研磨器及防污染培養(yǎng)瓶，用于改良經典染色體制備組織細胞培養(yǎng)方法，在待檢組織塊放入組織研磨器后，僅運作10 30秒鐘，就可達到組織培養(yǎng)的細胞分散要求，即可用常規(guī)細胞培養(yǎng)液懸浮細胞，移入防污染細胞培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋，作常規(guī)細胞培養(yǎng)染色體制備，因此簡略了經典方法中需要反復剪碎組織塊、膠原酶消化、重復洗滌、離心沉淀及試劑配制等近2 小時的作業(yè)，而且消除了由經典方法產生的對細胞物理和化學的損傷、實驗污染和感染等影響因素，防污染培養(yǎng)瓶既能有效地預防細胞培養(yǎng)過程的細菌污染，又能確保其所需的CO2 含量和濕度。
2.根據權利要求1所述的改良染色體制備組織細胞培養(yǎng)方法，其特征是防污染培養(yǎng)瓶1的蓋頂4由石棉板、硅藻土制成具有濾菌器結構和功能，濾孔口徑不超過0. 15 0. 22 μ m，不小于44A，濾孔可設置在瓶壁、瓶底、瓶頸及瓶蓋的其他部位。
3.根據權利要求1所述的改良染色體制備組織細胞培養(yǎng)方法，其特征是組織研磨器由研棒1和研杯2組成，研杯2的口徑為0. 5 20cm，研杯高為1 20cm，研棒1的大小和長度與研杯2相配套，制作材料為瓷、玻璃、瑪瑙、氧化鋁或鐵，或以玻璃、塑料制作一次性用PΡΠ O
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于醫(yī)療領域的改良染色體制備組織細胞培養(yǎng)方法，其主要特征是設計并應用由研棒1和研杯2組成的組織研磨器，僅運作10～30秒鐘就可取代經典方法中反復剪碎組織塊、膠原酶消化、重復洗滌、離心沉淀及試劑配制等近2小時的作業(yè)，還消除了由經典方法產生的對細胞物理和化學的損傷、實驗污染和感染等影響因素；同時設計了具有濾菌器結構和功能的防污染培養(yǎng)瓶，既能有效地預防細胞培養(yǎng)過程的細菌污染，又能確保其所需的CO2含量和濕度，從而大大提高工作效率和細胞培養(yǎng)成功率、便于成批操作、節(jié)省實驗成本、優(yōu)化了實驗方法。
文檔編號C12N5/00GK102443563SQ20101051183
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月10日 優(yōu)先權日2010年10月10日
發(fā)明者翁炳煥, 黃荷鳳 申請人:翁炳煥