專利名稱：利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)被公認是目前自然界中天然蝦青素含量 最高的生物，其積累量可高達細胞干重的4. 0%，是鮭魚肉中的1000-4000倍，也遠遠高于 紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodoxyma)發(fā)酵所生產(chǎn)的蝦青素(0. 15% -0. 4% ) 0蝦青素分子不 僅同其它類胡蘿卜素一樣具有很長的共軛雙鍵，且在其共軛雙鍵末端還具有不飽和的酮基 和羥基，而羥基和酮基又構(gòu)成α-羥基酮，這種結(jié)構(gòu)賦予了蝦青素比一般類胡蘿卜素更為 突出的生理功能，主要體現(xiàn)在以下兩個方面第一，蝦青素同其它類胡蘿卜素一樣具有抗氧 化活性，在生物體中表現(xiàn)為猝滅單線態(tài)氧，清除自由基，阻止脂質(zhì)過氧化等功能，并且越來 越多的研究顯示蝦青素的抗氧化性顯著強于胡蘿卜素、玉米黃素、角黃質(zhì)、維生素C和 維生素E ；第二，大量研究結(jié)果證明蝦青素能顯著提高動物的免疫能力，并且有預(yù)防癌癥的 作用。因此，天然蝦青素具有廣泛的應(yīng)用價值和巨大的市場潛力。目前，蝦青素主要用作魚 類(鮭魚、鱘魚、虹鱒魚、真鯛等)和蝦、蟹等甲殼類動物及家禽的飼料添加劑。此外，隨著 蝦青素生物功能研究的日益深入和藥理藥效試驗的逐步完善，天然蝦青素已被批準為安全 的人類食品添加劑，以用于食品的著色、保鮮及營養(yǎng)，并有開發(fā)成藥物的趨勢。過去關(guān)于刺激雨生紅球藻積累蝦青素的誘導(dǎo)因子研究大多集中在物理因子和化 學(xué)因子上，很少有研究涉及植物激素。同上述誘導(dǎo)因子相比較，植物激素具有用量小、效益 高、殘毒少等優(yōu)勢。為一種抗逆激素，茉莉酸甲酯(JA)對植物生長發(fā)育和逆境條件下的抗 性起著重要調(diào)節(jié)作用，而雨生紅球藻正是在逆境脅迫條件下才能大量積累蝦青素。外源茉 莉酸甲酯能夠激發(fā)植物防御基因的表達，誘導(dǎo)植物的化學(xué)防御，產(chǎn)生與機械損傷和昆蟲取 食相似的效果。因此茉莉酸甲酯可能會誘導(dǎo)雨生紅球藻大量積累蝦青素。目前，國內(nèi)市場上已經(jīng)有一些生產(chǎn)蝦青素的相關(guān)專利技術(shù)，如中山大學(xué)的“光生物 反應(yīng)器促進雨生紅球藻生長增殖及調(diào)控蝦青素合成和積累的方法”(CN02134387. X)，涉及 幾種可調(diào)控的全天候封閉式大規(guī)模運行系統(tǒng)光生物反應(yīng)器培養(yǎng)和促進雨生紅球藻生長增 殖及提高種群密度和調(diào)控細胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物蝦青素合成和積累的方法。寧波大學(xué)的“大 規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻和轉(zhuǎn)化蝦青素的裝置及其方法”(200610154678.0)公開了一種大規(guī) 模培養(yǎng)雨生紅球藻和轉(zhuǎn)化蝦青素的裝置及方法，整個培養(yǎng)裝置由設(shè)置在固定架上的光生物 反應(yīng)器系統(tǒng)、充氣裝置、培養(yǎng)液灌輸裝置和靜細胞收集裝置組成，固定架上設(shè)置浮沉控制裝 置；“從甲殼質(zhì)、殼聚糖生產(chǎn)廢水中回收蝦青素和蛋白質(zhì)的方法”(CN200510047267. 7)，主 要是從甲殼質(zhì)、殼聚糖生產(chǎn)廢水中回收蝦青素，雖然能變廢為寶，但是蝦青素的提取效率較 低。“一種培養(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法(CN02138827.X)公開了一種培養(yǎng)雨生紅球藻 生產(chǎn)蝦青素的方法，包括培養(yǎng)基配方、一步法生產(chǎn)工藝、培養(yǎng)基的循環(huán)使用和用二氧化碳調(diào) 節(jié)培養(yǎng)液PH值誘導(dǎo)紅球藻孢子的形成及蝦青素積累的方法。“產(chǎn)蝦青素的藻類和酵母混合培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的方法”(CN03105314. 9)，公開了一種產(chǎn)蝦青素的藻類和酵母混合培 養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的方法，屬于生物法生產(chǎn)蝦青素技術(shù)。該方法是在裝有特定培養(yǎng)基的反 應(yīng)器內(nèi)，同時接種包括雨生紅球藻在內(nèi)的藻類和包括紅發(fā)夫酵母在內(nèi)的酵母進行混合培養(yǎng) 發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素。上述相關(guān)專利技術(shù)雖然先進，但均涉及光生物反應(yīng)器等專業(yè)設(shè)施，對設(shè)備 要求比較高，技術(shù)工藝比較復(fù)雜，操作有難度，而且費用很高，這無疑增加了生產(chǎn)成本和技 術(shù)推廣的難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，技術(shù)工藝簡單易行、 廉價高效且能顯著提高雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素效率的利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生 產(chǎn)蝦青素的方法。其具體的技術(shù)方案為一種利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征在于采用如下步 驟(1)制備藻液培養(yǎng)雨生紅球藻細胞到對數(shù)生長期，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；(2)積累蝦青素將質(zhì)量濃度為95%的茉莉酸甲酯原液添加到上述已培養(yǎng)好的 藻液中至茉莉酸甲酯終濃度為4. 95 5. 05mg/L ；然后將上述添加了茉莉酸甲酯的藻液在 25 28°C、光強4500 50001χ、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下進行培 養(yǎng)，直至光學(xué)顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細胞完全變紅，此時蝦青素產(chǎn)量達到最高。所述的利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，步驟(1)中，雨生紅 球藻采用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度19 21 °C，光強1500 18001x，光暗比為 12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至培雨生紅球藻細胞達到對數(shù)生長期，此時細胞濃度 達 IO8 個 /mL。所述的利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，茉莉酸甲酯采用 SIGMA公司生產(chǎn)的茉莉酸甲酯。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點是1、本發(fā)明簡單易行、成本低廉，原材料雨生紅球藻細胞可以按常規(guī)方法自行培養(yǎng)。2、本發(fā)明能大幅提高雨生紅球藻中蝦青素的積累效率，實驗證明，添加4. 95 5. 05mg/L茉莉酸甲酯處理組比空白對照組雨生紅球藻細胞完成蝦青素積累的周期縮短了 45. 5 50. 0%，蝦青素產(chǎn)量比對照提高了 57. 1 58. 9%，達18. 76 18. 97mg/L藻液。
具體實施例方式實施例1 步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度19 °C、 15001x光強、光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細胞達到對數(shù) 生長期，細胞濃度達IO8個/mL，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；步驟2、誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素茉莉酸甲酯采用SIGMA公司生產(chǎn)的茉莉酸甲 酯。將質(zhì)量百分濃度為95%的茉莉酸甲酯原液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至茉莉酸甲酯 濃度為4. 95mg/L ；然后將上述添加了茉莉酸甲酯的藻液與空白對照組藻液同時在25°C、光 強45001x、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下進行培養(yǎng)，24天后雨生紅球藻細胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達到最高。實施例2:步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度20°C、光強 18001x、光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細胞達到對數(shù)生長 期，細胞濃度達IO8個/mL，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；步驟2、誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素茉莉酸甲酯采用SIGMA公司生產(chǎn)的茉莉酸甲 酯。將質(zhì)量百分濃度為95%的茉莉酸甲酯原液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至茉莉酸甲酯 濃度為5. Omg/L ；然后將上述添加了茉莉酸甲酯的藻液與空白對照組藻液同時在26°C、光 強48001x、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下進行培養(yǎng)，23天后雨生紅球藻 細胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達到最高。實施例3 步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度21°C、光強 16001x、光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細胞達到對數(shù)生長 期，細胞濃度達IO8個/mL，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；步驟2、誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素茉莉酸甲酯采用SIGMA公司生產(chǎn)的茉莉酸甲 酯。將質(zhì)量百分濃度為95%的茉莉酸甲酯原液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至茉莉酸甲酯 濃度為5. 05mg/L ；然后將上述添加了茉莉酸甲酯的藻液與空白對照組藻液同時在28°C、光 強50001χ、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下進行培養(yǎng)，22天后雨生紅球藻 細胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達到最高。采用以下方法對本發(fā)明中含有茉莉酸甲酯的藻液及空白對照組藻液定期進行顯 微觀察，具體是每天取少量藻液樣品在光學(xué)顯微鏡下觀察藻細胞的顏色變化以及蝦青素積 累情況；然后按以下步驟對本發(fā)明含有茉莉酸甲酯的藻液及空白對照組藻液中的蝦青素含 量進行測定①每三天各取出3ml上述兩種藻液，5000r/min離心5min，棄上清得到藻細胞 沉淀；②分別向兩種藻細胞沉淀加入5% KOH和30%甲醇破壞葉綠素5min后，5000r/min離 心收集沉淀；③在收集的沉淀中分別加入3ml 二甲亞砜，利用超聲波破壁后(3次15sec破 壁/5sec間歇，輸出功率40W)，于70°C水浴中處理lOmin，抽提至藻體發(fā)白；④然后IOOOOr/ min離心lOmin，分別取上清于490nm下測定OD值；⑤按公式C(mg/L) = (4. 5A X 490 X Va)/ Vb計算兩種上清中的蝦青素含量，其中A表示OD值，Va表示二甲亞砜的體積，Vb表示藻液 體積。結(jié)果表明空白對照組雨生紅球藻細胞完全變紅的時間為44天，此時蝦青素含量 為11. 94mg/L藻液，茉莉酸甲酯處理組的藻細胞比空白對照組完全變紅的周期縮短45. 5 50. 0%，蝦青素產(chǎn)量比對照提高了 57. 1 58. 9%，達18. 76 18. 97mg/L藻液。
權(quán)利要求
一種利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征在于采用如下步驟(1)制備藻液培養(yǎng)雨生紅球藻細胞到對數(shù)生長期，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；(2)積累蝦青素將質(zhì)量濃度為95％的茉莉酸甲酯原液添加到上述已經(jīng)培養(yǎng)好的藻液中至茉莉酸甲酯終濃度為4.95～5.05mg/L；然后將上述添加了茉莉酸甲酯的藻液.在25～28℃、光強4500～5000lx、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下進行培養(yǎng)，直至光學(xué)顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細胞完全變紅，此時蝦青素產(chǎn)量達到最高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，其特 征在于步驟⑴中，雨生紅球藻采用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度19 21°C，光強 1500 18001x，光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至培雨生紅球藻細胞達到 對數(shù)生長期，此時細胞濃度達IO8個/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征 在于茉莉酸甲酯采用SIGMA公司生產(chǎn)的茉莉酸甲酯。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，采用如下步驟(1)培養(yǎng)雨生紅球藻細胞到對數(shù)生長期，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；(2)積累蝦青素將質(zhì)量濃度為95％的茉莉酸甲酯原液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至茉莉酸甲酯終濃度為4.95～5.05mg/L；然后將上述添加了茉莉酸甲酯的藻液在25～28℃、光強4500～5000lx、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下進行培養(yǎng)，直至光學(xué)顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素產(chǎn)量達到最高。本發(fā)明簡單易行，成本低廉，能大幅縮短雨生紅球藻細胞完全變紅的時間，并顯著增加蝦青素產(chǎn)量，從而大大提高雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的效率。
文檔編號C12R1/89GK101974600SQ201010505970
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者葉乃好, 孟春曉, 王依濤, 羅韜, 高政權(quán), 高瑞照 申請人:山東理工大學(xué)