專利名稱：一種雨生紅球藻粉及提取物蝦青素含量測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蝦青素含量的測定方法，具體涉及采用分光光度計和/或高效 液相色譜法測定雨生紅球藻、雨生紅球藻提取物或其制劑中蝦青素含量的方法。
背景技術：
雨生紅球藻(Haematococcus)是一種單細胞綠藻，在逆境條件下可積累大量的蝦 青素，被公認為自然界天然蝦青素的主要來源。采用超臨界流體CO2技術的雨生紅球藻 提取物除富含有天然抗氧化劑蝦青素外，還含有維生素Bi、B2、B6、B12、單不飽和脂 肪酸、多不飽和脂肪酸等人體必需的營養(yǎng)成分。蝦青素(astaxanthin)是一種紅色的天然類胡蘿卜素，具有清除氧自由基的強 大能力，其抗氧化活性是維生素的550倍、類胡蘿卜素的10倍，被譽為“超級抗氧化 齊[J” (1、 Nakagawa K, Kang S， Park D, et al.Inhibition bybeta carotene and astaxanthin of NADPH dependent mi crosomal phospholipidperoxidation[J],Nutrit Sci Vitam in, 1997, 43, 3: 345 ； 2、 Naguib YMAAntioxidant activities of astaxanthinand related carotenoids[J], Agric FoodChem, 2000，48，1150.)，對人體絕對安全(1、Nishikawa Y, Minenaka Y, Ichimura Μ.Physiological and biochemical effects of carotenoid beta caroteneand astaxanthin on rat J Kashien Daigku Kiya 1997, 25: 19; 2、Aquasearch IncTechnical Report TR.3005.001. Haematococcus pluvialis and astaxanthinsafety for human consumption, 1999.)。 動物禾口臨 床試驗研究證明，蝦青素有增強免疫功能、抑制腫瘤發(fā)生、預防心血管疾病、防止皮膚 衰老、維護眼睛及中樞神經(jīng)系統(tǒng)健康等多種生物功能(Tanaka T，Morishita Y，SuzuiM, et al.Chemoprevention of mouse urinary bladder carcinogenesisgy naturallyoccurring caroteniod astaxanthin[J],Carcing Enesis, 1994, 15(1) 15-19; Jyonouchi, et al.2000.)。維生素Bl能促進血液循環(huán)、輔助鹽酸制造、血流形成及糖類代謝；有助于人體 感知，并使腦功能發(fā)揮最佳狀態(tài)；對能量代謝、生長、食欲、學習能力均起著積極的作 用；幫助人體抵抗衰老及煙酒對人體的不利影響。維生素B2是紅細胞形成、抗體制造及 細胞呼吸作用及生長必須的。維生素B6有利于鹽酸合成及脂肪、蛋白質的吸收，協(xié)助維 持體內鈉鉀平衡，促進紅細胞的形成；另外還有利于解決體內水分滯留帶來的不便，幫助腦和免疫系統(tǒng)發(fā)揮正常的生理機能；控制細胞增長和分裂的DNA、RNA等遺傳物質的 合成也離不開B6。B6還可以活化體內的許多種酶，并有助于B12的吸收。維生素B12 是抗貧血所需的，它可協(xié)助葉酸調節(jié)紅細胞的生成并有利于鐵的利用；而且消化機能的 正常，食物的消化和蛋白質的合成，脂肪和糖類的代謝均需要維生素B12。此外B12還 有助于防止神經(jīng)損傷，維持生育能力，促進正常的生長發(fā)育及防止神經(jīng)脫髓鞘的作用。單不飽和脂肪酸具有降血糖作用(施萬英，徐甲芬，藺淑賢.單不飽和脂肪酸腸 內營養(yǎng)制劑(Clucema)用于2型糖尿病[J].中國臨床營養(yǎng)雜志，2004，12(1) 39-42.)； 調節(jié)血脂作用(王軍波，肖穎，梁學軍，等.膳食脂質對中老年膽固醇血癥患者血清膽 固醇的影響[J].衛(wèi)生研究，2000，29(3))及降低膽固醇作用等。多不飽和脂肪酸對動脈血栓形成和血小板功能有明顯影響，防止血栓形成(鐘耀光.功能食品[M].北京化學工業(yè)出版社，2004，8 121-128.)。大量實驗表明，多不飽和脂肪酸具有較好的抗癌作 用，其能通過降低膽固醇水平，抑制癌細胞生長；并參與細胞基因表達調控，提高機體 免疫能力，減少腫瘤壞死因子；多不飽和脂肪酸還能大大增加細胞膜的流動性，有利于 細胞代謝和修復，阻止腫瘤細胞的異常增生(1、鐘耀光.功能食品[M].北京化學工業(yè) 出版社，2004，8 121-128.2、劉冀紅，曹偉新.ω-3多不飽和脂肪酸在腫瘤防治中的意 義[J].腸外與腸內營養(yǎng)，2004，11(1) 54-56.)。由此可見，雨生紅球藻提取物中含有大量對人體有益和人體必需的功能成分， 其用于保健品原料，應用前景十分廣闊。文獻報道的紅球藻提取方法有溶劑法、超臨界法、微波法、超聲法等，而微波 法、超聲法很少用于規(guī)模生產(chǎn)。由于蝦青素油是雨生紅球藻中主要的功效性成分，具有 較強抗氧化性，對光、熱、氧、濕敏感不穩(wěn)定，因此采用通常溶劑的提取工藝極易造成 氧化變質，若改成低溫浸出法，化學試劑耗用量較大，油中類脂物及伴隨物多給精煉帶 來困難且有溶劑殘留。國外利用以蝦青素為主要功效成分的紅球藻提取物制備保健食品及化妝品，其 產(chǎn)品定位主要是眼睛、免疫系統(tǒng)、皮膚保護、降低密度脂蛋白等方面。目前開發(fā)上市 的產(chǎn)品主要有口服制劑(軟膠囊、硬膠囊)、化妝品(唇膏、面部護理霜、防曬霜、防 皺霜)，其功能定位主要是抗氧化(延緩衰老)、營養(yǎng)皮膚、緩解運動疲勞、降低密度 脂蛋白、防止皮膚免受紫外線損傷等。產(chǎn)品主要以美國Twinlab公司保健膠囊、美國 Cyanotech 公司的 Bioastin> 美國 Aquasearch 公司的 Astafactor Sport Formula> 日本Natureal 公司的Astacure系列化妝品為代表。現(xiàn)有的蝦青素含量測定方法主要采用湖北荊州市天然蝦青素有限責任公司企業(yè) 質量標準制定的方法。具體操作如下精確稱取紅球藻粉提取物0.5mg，置于帶有刻度 的IOmL離心管中，向離心管中加入約5mL含有5%NaOH、30%甲醇的水溶液，將離心 管放入溫度調控為70°C的恒溫水浴中保溫5分鐘，保溫過程中要經(jīng)常搖動離心管，3500 轉/min離心3min，去上清液，藻渣備用；向離心管中加入約2mL含有少量醋酸(1滴/ mL)的DMSO(二甲基亞砜)，搖勻，70°C保溫5分鐘，保溫過程中要不斷搖動離心管； 3500轉/min離心3min，將上清液移入IOmL容量瓶中。剩余在離心管底部的藻渣應無色 或僅有很淺的顏色，如發(fā)現(xiàn)藻渣帶有紅色，再重復上述操作步驟，直到藻渣無色或僅有 很淺的顏色；將幾次收集的上清液用DMSO精確定容至IOmL,取ImL放入另一個IOmL 的容量瓶中，用DMSO精確定容至IOmL,此溶液待測；將待測溶液放入Icm光徑比色 杯中，在492nm波長下測定吸光值A;用下式計算所測溶液中蝦青素的濃度C1=A492XlOOO/Al%cmXlOO式中C1——被測溶液中蝦青素的濃度/(mg/mL)A492——492nm波長被測溶液吸光值A1%lcm——消光系數(shù)/(2220)用下式計算蝦青素的含量
權利要求
1.一種蝦青素含量的測定方法，所述方法采用分光光度計和/或高效液相色譜來測定蝦青素的含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用分光光度計測定蝦青素的含量 包括以下步驟1)將樣品溶于丙酮中；2)于474nm處讀取樣品溶液吸光值；3)按下式計算蝦青素質量百分比
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用高效液相色譜測定蝦青素的含 量包括以下步驟1)將樣品溶于丙酮，并加入膽留醇酯酶溶液水解，使溶液中的蝦青素酯水解為游離 蝦青素；2)測定蝦青素的色譜條件如下C18柱，流動相為丙酮、水和乙酸乙酯，流速為 1.2mL/min,梯度洗脫條件為O 20分鐘(82%丙酮+8%水+10%乙酸乙酯)，20 24 分鐘(29%丙酮+1%水+70%乙酸乙酯)，24 30分鐘(82%丙酮+8%水+10%乙酸乙 酯)，檢測波長為474nm;3)按下式計算蝦青素含量RF-蝦青素=[P (trans-asta)標+1.2P(9-cis)+1.6P(13_cis)]/C 標C 樣=[P (trans-asta)樣+1.2P(9-cis)+1.6P(13_cis)]/RF-蝦青素其中，RF-蝦青素=蝦青素響應因子；C標(μ g/mL)為蝦青素標準品濃度，該值可 由下式計算出(其中92%為蝦青素比例系數(shù)，V(mL)為總稀釋體積)
4.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述蝦青素為雨生紅球 藻、雨生紅球藻提取物或雨生紅球藻提取物制劑中包含的蝦青素。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述雨生紅球藻提取物是通過以CO2為 萃取介質的超臨界流體萃取方法制備的，具體的萃取條件如下溫度為60 80°C，壓力 為35 45MPa，CO2流速為15 25L/h，時間為2 4小時。
全文摘要
本發(fā)明提供一種測定蝦青素含量的方法。本發(fā)明提供的測定蝦青素含量的方法，采用分光光度計與高效液相色譜測定雨生紅球藻、雨生紅球藻提取物或雨生紅球藻提取物制劑中包含的蝦青素，適用范圍廣，測定的可靠性和準確性高。
文檔編號G01N21/31GK102012363SQ20101054823
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月16日 優(yōu)先權日2010年11月16日
發(fā)明者張秋玲, 杜偉春, 楊瑜, 王朝軍, 龍祥 申請人:云南綠A生物工程有限公司