專利名稱：從雨生紅球藻中提取總蝦青素的固相萃取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本 發(fā)明涉及一種蝦青素的固相萃取方法，具體涉及ー種從雨生紅球藻中提取蝦青素的固相萃取方法。屬于分離富集化學(xué)的固相萃取エ藝技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蝦青素(Astanxantin)是ー種具有鄰羥基酮結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素，其化學(xué)名稱為3，3-ニ羥基-4，4-ニ酮基-3， Τ-胡蘿卜素，分子式為C4tlH52O4，相對(duì)分子量為596. 86，純蝦青素是暗紅棕色晶體，熔點(diǎn)224°C，不溶于水，能溶于大多數(shù)有機(jī)溶剤。蝦青素具有超強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基的能力，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過胡蘿卜素(約為10倍)、維生素E (約為550倍)，被譽(yù)為“超級(jí)維生素Ε”和“健康軟黃金”。臨床及動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明蝦青素具有良好的抗炎、抗腫瘤、抗衰老、保護(hù)皮膚、增強(qiáng)機(jī)體免疫、預(yù)防心血管疾病、維護(hù)眼睛健康、提高動(dòng)物的繁殖力等多方面重要的生物學(xué)功能。除此之外，蝦青素還具有顯著的著色性能，目前主要作為水產(chǎn)品、禽蛋、觀賞動(dòng)物養(yǎng)殖和畜牧產(chǎn)品的著色劑。因此蝦青素在食品、醫(yī)藥、化妝品、保健品和飼料等行業(yè)具有非常大的應(yīng)用潛力，市場(chǎng)前景廣闊。全球蝦青素產(chǎn)量每年不超過4噸，國(guó)際市場(chǎng)天然蝦青素的價(jià)格在 3500 美兀 / 公斤以上(NatuRose (astaxanthin) powder)。我國(guó)天然蝦青素的生產(chǎn)目前還處于初級(jí)階段，大量工作主要集中在實(shí)驗(yàn)室研究水平。國(guó)內(nèi)蝦青素粉(蝦青素含量為2 3%)的市場(chǎng)價(jià)格為3500元/公斤。因此蝦青素的生產(chǎn)具有很大的市場(chǎng)潛力。商品蝦青素的生產(chǎn)主要有兩種途徑，ー是人工化學(xué)合成，ニ是生物提取。目前，化學(xué)合成蝦青素在市場(chǎng)上還占據(jù)著主導(dǎo)地位，主要供應(yīng)商有Roche及BASF等公司。但是，采用人工化學(xué)合成方法生產(chǎn)蝦青素必須面對(duì)生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的環(huán)境污染問題，另外其產(chǎn)品中還含有不能被人體和動(dòng)物體所利用的非天然異構(gòu)體。隨著科技的發(fā)展、人們生活水平的提高和環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，化學(xué)合成蝦青素在食品、飼料、醫(yī)藥品及化妝品上的應(yīng)用受到很大的限制，例如美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)僅批準(zhǔn)反式結(jié)構(gòu)的蝦青素用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的添加剤，不允許任何化學(xué)合成產(chǎn)品進(jìn)入保健食品市場(chǎng)。因此，從含蝦青素的生物原料中提取天然蝦青素已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外商家的高度關(guān)注。蝦青素在生物界分布較為廣泛，特別是水產(chǎn)動(dòng)物如蝦、蟹和魚等，以及鳥類的羽毛中，作為生產(chǎn)原料，人們多采用甲殼動(dòng)物的売，酵母菌、藻類和蝦青素生產(chǎn)菌。雨生紅球藻中蝦青素的含量可高達(dá)細(xì)胞干重的2. 0-3. 0%，被看作是天然蝦青素的“濃縮品”，其所含的蝦青素?zé)o論從含量、結(jié)構(gòu)、生物可利用性，還是從游離蝦青素所占的比例上講，都具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，被公認(rèn)為是自然界中蝦青素的最佳來(lái)源。在蝦青素含量較高的生物體中，如雨生紅球藻、紅發(fā)夫酵母、短桿菌等，蝦青素大多數(shù)是以酯類形式存在，如雨生紅球藻中就含有70%的單酯和25%的雙酯形式的蝦青素。蝦青素提取的研究主要涉及破孢、粗提、純化、皂化和結(jié)晶等五階段。目前報(bào)道較多的破孢法有勻漿法(以水為介質(zhì)，破壁22min)、凍融溫差法(水介質(zhì)中，-70°C，處理2次，每次12h)、超聲波法(功率400W，超聲處理300次，每次5 s)和微波法等，另外還有資料報(bào)導(dǎo)采用直接研磨法、液氮低溫研磨法、負(fù)壓空化法和高壓均質(zhì)法等。不同的方法，提取率存在一定差異，以直接研磨法最好，但太過耗時(shí)，不利于エ業(yè)化生產(chǎn)，而負(fù)壓空化法明顯優(yōu)于其它方法。目前，國(guó)內(nèi)蝦青素提取的研究主要集中在粗提エ藝的探索，已報(bào)導(dǎo)的方法有堿解法、酸提法和溶劑萃取法等。通常是采用各種非極性或弱極性的溶劑，如植物油，有機(jī)溶剤，超臨界流體等方法進(jìn)行萃取，其エ藝簡(jiǎn)單、無(wú)需特殊設(shè)備，但存在浸提時(shí)間長(zhǎng)、提取的純度和效率低，而且有機(jī)溶劑的殘留問題影響了其在食品和藥品等對(duì)安全性要求較高領(lǐng)域的應(yīng)用。油溶法提取蝦青素所用的油脂主要為可食用油脂類，最常見的是大豆油，也可用魚油。油溶法的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)品安全，提取效率高，而其缺點(diǎn)是提取物不易與高沸點(diǎn)的油分離，產(chǎn)品濃度不高，應(yīng)用范圍受到限制。若要進(jìn)ー步純化，需要采用層析或分子蒸餾等方法。低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑是ー類提取蝦青素的有效溶剤。由于選擇的萃取劑沸點(diǎn)低，故可 借助蒸餾技術(shù)將溶劑回收而循環(huán)利用，并可得到濃度較大的蝦青素油。常見的溶劑有丙酮、こ醇、氯仿、ニ氯甲烷等，可単獨(dú)使用也可將不同的溶劑按一定比例混合使用。專利02135919. 9介紹了ー種從甲殼素エ廠加工廢水中采用絮凝法提取法蝦青素的生產(chǎn)エ藝，其實(shí)現(xiàn)方案是用酸處理甲殼素エ廠加工的廢水或甲殼類生產(chǎn)加工的廢水，使其PH為6-7，按加工廢水與絮凝劑體積比為100 1-100 5加入絮凝劑殼聚糖膠體溶液，反應(yīng)4-10 h，再用酸調(diào)pH至I. 5-2. 5，產(chǎn)生泡沫，用濾網(wǎng)或泡沫收集器收集泡沫中懸浮的含有蝦青素的顆粒，真空干燥，即為蝦青素粗品。該エ藝過程變廢為寶，但需大量酸調(diào)解PH，會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，成產(chǎn)成本高，而且需要消耗大量殼聚糖，況且收集泡沫的勞動(dòng)強(qiáng)度較高，所得產(chǎn)品含雜質(zhì)較多。專利02122565. 6公開了ー種從鮮蝦殼生產(chǎn)甲殼素、蝦青素和蛋白的方法。其中生產(chǎn)蝦青素的方法是將鮮蝦殼經(jīng)機(jī)械破碎擠壓得到蝦液體和蝦殼體，對(duì)蝦液體用有機(jī)溶劑萃取1-3次，得到蝦青素和油脂的萃取液；對(duì)蝦殼體部分，先用有機(jī)酸脫鈣，再用堿液浸泡，然后用有機(jī)酸中和堿性浸泡液，沉淀蝦青素蛋白復(fù)合物。有機(jī)溶劑消耗量大、成本高，操作費(fèi)吋，勞動(dòng)強(qiáng)度高。專利CN200810236028.X是ー種利用克氏原螯蝦殼提取蝦青素的方法。以克氏原螯奸殼為原料，奸殼烘干后粉碎，用O. 5-3mol/L的鹽酸浸泡l_8h,干燥奸殼粉與鹽酸的比例為l_20g/100mL，離心去鹽酸，沉淀物用氯仿提取8_13h、蝦殼粉與氯仿的比例為Ι-lOg/lOOmL，離心取上清液，真空濃縮回收氯仿，得到蝦青素粗提物。專利CN200410013634. 7是ー種從法夫酵母中高效提取純化蝦青素的エ藝，它是將物料與提取溶媒——こ醇按比例混合后進(jìn)行負(fù)壓空化混旋固液萃取，經(jīng)離心得提取液，提取液減壓濃縮至小體積與萃取溶劑——ニ氯甲烷進(jìn)行負(fù)壓空化混旋液萃取，萃取液水洗、脫水后減壓濃縮至油狀物。以上由于萃取操作有機(jī)溶媒用量大，萃取時(shí)間長(zhǎng)，萃取物中雜質(zhì)含量多，有機(jī)溶媒回收能耗大，而且需要多次萃取才能獲得理想回收率，大量有機(jī)溶劑的使用更是帶來(lái)了高昂的成本和潛在的污染威脅。超臨界流體萃取(Supercritical fluid extraction, SFE)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的高新技術(shù)，由于其提取的產(chǎn)品具有純度高、溶劑殘留少、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，在食品和藥品加工領(lǐng)域的應(yīng)用日益増加。CO2因?yàn)榫哂械投竞偷团R界溫度的優(yōu)點(diǎn)，而成為在食品和天然產(chǎn)物的超臨界提取中最常用的溶剤。例如專利CN200910102291. 4中從雨生紅球藻中采用超臨界萃取法提取蝦青素，是取粉碎的雨生紅球藻粉末，裝入超臨界萃取裝置中的萃取釜中，設(shè)定萃取釜的溫度為30-50°C，壓カ為20-30MPa，分離釜I的溫度和壓カ分別為30_40°C和8_10MPa，分離釜II的溫度為30-40°C，C(V流體的流速為20-40L/h，萃取時(shí)間為2_4h，收集萃取物干容器中保存，萃取物為暗紅色粘稠狀物質(zhì)。又如專利CN201010548303. 9 ー種雨生紅球藻提取物的制備方法，以CO2為萃取介質(zhì)的超臨界流體萃取方法，萃取條件溫度60 80°C，壓カ35 45MPa，CO2流速15 25L/h,時(shí)間2 4小時(shí),奸青素的含量可達(dá)到2 20% (w/w)。 又如專利CN200510053294. 5從天然植物福壽草中提取天然蝦青素，是利用天然植物福壽草，將其置于超臨界流體萃取裝置內(nèi)，通過加熱、升壓、注入αν流體等手段獲得天然蝦青素。超臨界萃取技術(shù)與油溶法和有機(jī)溶劑法等傳統(tǒng)技術(shù)相比具有簡(jiǎn)單、快速、操作方便；萃取過程中所用的提取溶劑為CO2，使生產(chǎn)過程綠色環(huán)保，提取物無(wú)有機(jī)溶劑殘留；萃取過程中溫度較低，可以有效的避免有效物質(zhì)高溫分解等優(yōu)點(diǎn)。但利用超臨界萃取技術(shù)生產(chǎn)蝦青素具有設(shè)備前期投資大、生產(chǎn)技術(shù)要求高和成品純度較低等缺點(diǎn)，目前用于大規(guī)模エ業(yè)生產(chǎn)尚存在很大困難。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供ー種操作步驟簡(jiǎn)單、時(shí)間短、回收率高、有機(jī)溶劑消耗少，環(huán)境污染小、生產(chǎn)成本低且易エ業(yè)放大的固相萃取方法。本發(fā)明提供一種從雨生紅球藻中提取總蝦青素的固相萃取方法，所述方法包括步驟(I)固相萃取將雨生紅球藻粉與硅膠以重量比1:1-5:1混合均勻，然后每IOg雨生紅球藻粉加入I 5 mL甲醇、10 20 mL石油醚及I 5 mL ニ氯甲燒，攪拌萃取O. I I h后，將萃取混合物裝入層析柱中；(2)洗脫用甲醇洗脫，收集紅色流出液；(3)濃縮將所述紅色流出液減壓蒸餾，得到暗紅色蝦青素油狀液體。洗脫前需對(duì)層析柱進(jìn)行淋洗即將層析柱抽干后，用石油醚和ニ氯甲烷依次淋洗，待流出液無(wú)色后，抽干。進(jìn)ー步，所述蝦青素油狀液體按照如下步驟精提(4)皂化將所述油狀液體與6 40g/L的氫氧化鉀-甲醇溶液按體積比2 : I 10 : I混合，4 15°C，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，避光皂化1-2 h；(5)離心在所述皂化液中加入去離子蒸餾水，至紅色絮狀沉淀產(chǎn)生，離心得到蝦青素沉淀。進(jìn)ー步，所述蝦青素沉淀按照如下步驟獲得結(jié)晶產(chǎn)品出)純化將所述蝦青素沉淀通氮?dú)獯蹈?，用石油醚溶解，再通過硅膠柱層析純化，用正己烷與丙酮按體積比1:4混合作為洗脫液洗脫，收集紅色流出液；(7)結(jié)晶在所述紅色流出液中加入等體積去離子水混勻，置于-10°C _4°C，育晶2-24 h,3000轉(zhuǎn)/min離心，用去離子水洗滌沉淀兩次，收集晶體，氮?dú)獯蹈桑@得結(jié)晶產(chǎn)品。
本發(fā)明的有益效果在于
I.本發(fā)明提供的從雨生紅球藻中提取總蝦青素的固相萃取方法，無(wú)需物料溶劑預(yù)處理，有機(jī)溶劑消耗少，萃取劑能循環(huán)再利用，環(huán)境污染小、生產(chǎn)成本低。2.本發(fā)明以少量有機(jī)溶媒為中介，將物料中的蝦青素萃取到固體萃取劑上，通過固相萃取ー步即可從含蝦青素的物料中獲得蝦青素油；操作時(shí)間短、速度快，回收率高，雜質(zhì)少；所用的試劑種類和用量少，而且易回收，成本低。3.固相萃取物通過選擇性淋洗和洗脫，即可獲得高純度的蝦青素，且操作簡(jiǎn)便，回 收率高，易エ業(yè)放大。4.本發(fā)明方法可適用于除雨生紅球藻外的多種含蝦青素生物源料的加工，也易于作為提取蝦青素的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，整合到多種含蝦青素生物原料的綜合加工エ藝中。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例I 從雨生紅球藻中快速分離總蝦青素 按照以下步驟進(jìn)行操作
1.固相萃取在200mL的燒杯中，將10 g雨生紅球藻粉與2 g硅膠混合均勻，加入5mL甲醇，13 mL石油醚、5 mL ニ氯甲烷，攪拌萃取I h，再將混合物裝入直徑為30 mm的層析柱中；
2.淋洗將層析柱抽干，用石油醚、ニ氯甲烷依次淋洗，待流出液無(wú)色后，抽干；
3.洗脫用甲醇洗脫，收集紅色部分；
4.濃縮將洗脫液減壓蒸餾，得到暗紅色油狀液體——!!!下青素油。實(shí)施例2 制備高純度蝦青素 按照以下步驟進(jìn)行操作
1.固相萃取在200mL的燒杯中，將10 g雨生紅球藻粉與10 g硅膠混合均勻，加入I mL甲醇，20 mL石油醚、3mLニ氯甲烷，攪拌萃取O. 5小時(shí)，再將混合物裝入直徑為30 mm的層析柱中；
2.淋洗將層析柱抽干，用石油醚、ニ氯甲烷依次淋洗，待流出液無(wú)色后，抽干；
3.洗脫用甲醇洗脫，收集紅色流出液；
4.濃縮將紅色流出液減壓蒸餾，得到暗紅色油狀液體——!!!下青素油；
5.皂化將蝦青素油與40g/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，按體積比10 I混合，15°C，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，避光皂化約2 h，
6.離心在皂化液中加入適量去離子水，至紅色絮狀沉淀產(chǎn)生，離心得到蝦青素沉淀。實(shí)施例3 制備蝦青素結(jié)晶 按照以下步驟進(jìn)行操作
1.固相萃取在200mL的燒杯中，將10 g雨生紅球藻粉與5g硅膠混合均勻，加入3mL甲醇，10 mL石油醚、I mL ニ氯甲烷，攪拌萃取O. I h，再將混合物裝入直徑為30 mm的層析柱中；
2.淋洗將層析柱抽干，用石油醚、ニ氯甲烷依次淋洗，待流出液無(wú)色后，抽干；
3.洗脫用甲醇洗脫，收集紅色流出液；
4.濃縮將紅色流出液減壓蒸餾，得到暗紅色油狀液體——!!!下青素油；
5.皂化將蝦青素油與40g/L的氫氧化鉀-甲醇溶液按體積比10 I混合，15°C，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，避光皂化約I h ；
6.離心在皂化液中加入適量蒸餾水，離心可得到蝦青素沉淀；
7.純化將所述蝦青素沉淀通氮?dú)獯蹈桑蒙倭渴兔讶芙?，再通過硅膠柱層析純化，用正己烷-丙酮按體積比4:1混合作為洗脫液洗脫，收集紅色條帶的洗脫液；
8.結(jié)晶在洗脫液中加入適量去離子水，混勻，置于冰箱中育晶，控制溫度降至-10°C時(shí)，育晶24小時(shí),然后3000轉(zhuǎn)/min離心,再用去離子水洗滌兩次,收集晶體,氮?dú)獯蹈?獲得最終產(chǎn)品。 實(shí)施例4
基本與實(shí)施例3相同，所不同之處在于
在結(jié)晶時(shí)控制溫度為_8°C，育晶2小吋。實(shí)施例5
基本與實(shí)施例3相同，所不同之處在于
在結(jié)晶時(shí)控制溫度為4°C，育晶12小吋。實(shí)施例6
基本與實(shí)施例3相同，所不同之處在于
在結(jié)晶時(shí)控制溫度為0°C，育晶6小吋。實(shí)施例7
基本與實(shí)施例3相同，所不同之處在于
在結(jié)晶時(shí)控制溫度為_5°C，育晶18小吋。實(shí)施例I中，每10 g雨生紅球藻中可獲得5 g以上蝦青素油，其收率達(dá)到蝦青素實(shí)際含量(依據(jù)索氏提取法微量分析數(shù)據(jù))的90%以上，實(shí)施例3、4、5、6和7中粗提物經(jīng)過皂化、純化、結(jié)晶等步驟，均可得到O. 26 g以上純度為95%以上的蝦青素結(jié)晶，其收率亦達(dá)到蝦青素實(shí)際含量的90%以上。當(dāng)然，上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)作出的變化，都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種從雨生紅球藻中提取總蝦青素的固相萃取方法，其特征在于，所述方法包括步驟(I)固相萃取將雨生紅球藻粉與硅膠以重量比1:1-5:1混合均勻，然后每IOg雨生紅球藻粉加入I 5 mL甲醇、10 20 mL石油醚及I 5 mL 二氯甲燒，攪拌萃取O. I I h后，將萃取混合物裝入層析柱中；(2)洗脫用甲醇洗脫，收集紅色流出液部分；(3)濃縮將所述紅色流出液減壓蒸餾，得到暗紅色蝦青素油狀液體。
2.按照權(quán)利要求I所述的從雨生紅球藻中提取總蝦青素的固相萃取方法，其特征在于，所述蝦青素油狀液體按照如下步驟精提(4)皂化將所述油狀液體與6 40g/L的氫氧化鉀-甲醇溶液按體積比2 : I 10 : I混合為皂化液，4 15°C，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，避光皂化1-2 h ;(5)離心在所述皂化液中加入去離子蒸餾水，至紅色絮狀沉淀產(chǎn)生，離心得到蝦青素沉淀。
3.按照權(quán)利要求2所述的從雨生紅球藻中提取總蝦青素的固相萃取方法，其特征在于，所述蝦青素沉淀按照如下步驟獲得結(jié)晶產(chǎn)品(6)純化將所述蝦青素沉淀通氮?dú)獯蹈?，用石油醚溶解，再通過硅膠柱層析純化，用正己烷與丙酮按體積比1:4混合作為洗脫液洗脫，收集紅色流出液；(7)結(jié)晶在所述紅色流出液中加入等體積去離子水混勻，置于-10°C _4°C，育晶2-24 h,3000轉(zhuǎn)/min離心，用去離子水洗滌沉淀兩次，收集晶體，氮?dú)獯蹈?，獲得結(jié)晶產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從雨生紅球藻中提取總蝦青素的固相萃取方法，包括如下步驟(1)固相萃取將雨生紅球藻粉與硅膠以重量比1:1-5:1混合均勻，然后每10g雨生紅球藻加入1～5mL的甲醇、10～20mL的石油醚及1～5mL的二氯甲烷，攪拌萃取0.1～1h，將萃取混合物裝入層析柱中；(2)洗脫用甲醇洗脫，收集紅色流出液部分；(3)濃縮將所述紅色部分流出液減壓蒸餾，得到暗紅色蝦青素油狀液體。本發(fā)明提供的固相萃取方法操作步驟簡(jiǎn)單、時(shí)間短、回收率高、有機(jī)溶劑消耗少，環(huán)境污染小、生產(chǎn)成本低，且易工業(yè)放大。
文檔編號(hào)C07C403/24GK102659652SQ20121010623
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者廖光紅, 曹斌云, 王建剛, 秦寶富, 鄭立飛 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)