專利名稱：篩選化學預(yù)防劑的雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤預(yù)防領(lǐng)域，具體涉及一種快速篩選化學預(yù)防劑的雙信號轉(zhuǎn)基因細 胞傳感器及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
化學預(yù)防劑是指可對癌癥進行預(yù)防、延緩以及逆轉(zhuǎn)其發(fā)生發(fā)展過程的一類天然或 人工合成的化合物。專用于化學預(yù)防劑體外檢測的方法較少，已有的方法是將抗氧化反應(yīng) 元件(ARE)、TK啟動子及綠色熒光蛋白(GFP)基因(報告基因)重組于H印G2細胞，使GFP的 表達量在ARE的調(diào)控之下。用溴乙啶(EB)染色校正細胞數(shù)對檢測結(jié)果的影響，直接檢測 GFP和EB熒光強度，通過相對熒光強度甄別或檢測化學預(yù)防劑。這種方法避免了用酶做報 告基因時測酶活性需要破壞細胞壁，不同的破壁方法對實驗結(jié)果影響較大，酶活性受時間、 溫度、PH、菌液濃度的影響較大，耗時長等缺點，但該方法單個ARE調(diào)控無法凸顯化學預(yù)防 劑的作用效果，且EB具有致癌性，危害人體健康，污染環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有篩選方法耗時長，不敏感，有污染的不足，本發(fā)明提供了一種快速篩 選化學預(yù)防劑的雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器，用于腫瘤預(yù)防藥物篩選，有效地解決了問題。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種篩選化學預(yù)防劑的雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器，其特征在于是一種轉(zhuǎn)基因細胞，該 轉(zhuǎn)基因細胞帶有ARE (抗氧化反應(yīng)元件)、TK啟動子、EGFP (增強綠色熒光蛋白)以及DsRed (紅色熒光蛋白)，EGFP的表達受ARE的調(diào)控。作為本發(fā)明的一個具體的技術(shù)方案，所說的轉(zhuǎn)基因細胞是H印G2-4ARE-TK-GFP/ DsRed,即在H印G2細胞中重組整合有ARE、TK、EGFP和DsRed，且EGFP的表達受ARE的調(diào) 控。結(jié)構(gòu)特征如圖1所示，傳感器中主要由2種熒光蛋白構(gòu)成=(I)EGFP (增強綠色熒光蛋 白)表達由TK啟動子驅(qū)動，且在ARE (抗氧化反應(yīng)元件)的調(diào)控之下；(2) DsRed (紅色熒光 蛋白)表達由CMV啟動子驅(qū)動。上述所說的篩選化學預(yù)防劑的雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器的構(gòu)建方法是
1)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建由TK啟動子啟動以及上游有4個ARE重復序列調(diào)控的EGFP 報告載體；
2)將紅色熒光蛋白DsRed及其啟動子片段插入步驟1)的報告載體，構(gòu)建雙信號報告載
體；
3)將步驟2)的報告載體轉(zhuǎn)染HepG2細胞，得到的轉(zhuǎn)基因細胞即本發(fā)明的雙信號轉(zhuǎn)基因 細胞傳感器。綠色熒光蛋白(GFP)是來自水母的一種天然熒光蛋白，紅色熒光蛋白(DsRed)是 從珊瑚蟲中分離出的綠色熒光蛋白同源的熒光蛋白，它們在細菌、真菌、植物和動物細胞中 表達時都能發(fā)出熒光，因此，具有活體、原位、實時表達的特點。這樣可將ARE與GFP相串聯(lián)，使GFP的表達處于ARE的調(diào)控之下，再插入紅色熒光(DsRed)蛋白及其啟動子片段，構(gòu)建 成一種雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器，其GFP的發(fā)光程度與化學預(yù)防劑的作用程度具有量效關(guān) 系。當化學預(yù)防劑作用于雙信號轉(zhuǎn)基因細胞時，EGFP基因的表達量與化學預(yù)防劑的作用強 度具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，通過測定EGFP和DsRed發(fā)光強度獲得的相對發(fā)光強度可以反 映化學預(yù)防劑的作用強度或快速篩選某些化學預(yù)防劑。該方法用4個ARE重復序列調(diào)控， 可敏感顯示化學預(yù)防劑的作用效果；用GFP為報告基因，可克服用酶作為報告基因不經(jīng)濟、 可比性差等缺點，也省卻了對細胞進行破壁等繁瑣步驟；以DsRed為內(nèi)參照來校正細胞數(shù)、 細胞狀態(tài)對結(jié)果的影響，可克服EB污染環(huán)境和危害人體健康等缺點。直接檢測紅綠熒光強 度，能方便、快速、定性、定量地評價化學預(yù)防劑的誘導效果。


圖1本發(fā)明雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器示意圖。圖2本發(fā)明雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器工作原理圖。圖 3 是 p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo 在!fepG2 細胞中的瞬時表達。圖 4 是!fepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed 細胞的表達。圖5是質(zhì)粒p4ARE-TK_GFP/neo結(jié)構(gòu)示意圖。圖6是陽性受試物PDTC和tBHQ劑量效應(yīng)關(guān)系。
具體實施例方式文中所用到的質(zhì)?；蚣毎?HepG2 購自中科院上海細胞研究所。p4ARE-TK-GFP/neo 本室構(gòu)建保存；結(jié)構(gòu)如圖5。(徐海榮，卜平，李湘 鳴.真核表達載體p4ARE-TK-GFP/ne0的構(gòu)建及其表達.細胞與分子免疫學雜 志，2009，25(11) 1008-1012.)申請人承諾向公眾提供20年。p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo 本室構(gòu)建保存。承諾向公眾提供20年。用PCR方法從 質(zhì)粒pDsRed2-Nl (Clontech公司)擴增紅色熒光蛋白及其啟動子序列，上游引物為5，-CG CCCTTAAGTAGTTATTAATAGTAATCAATT -3，(SEQ ID NO :1)，下游引物為 5，_GAGCACGTAGTGCTA CAGGAACAGGTGGTGGCGG -3，(SEQ ID NO :2)。在引物的 5，端分別設(shè)計 BspT I 和 Ade I 兩 酶切位點(黑體字所示)，并增加3、個保護堿基。PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)純化回收后與pMDlS-Τ載 體(TaKaRa公司)相連，構(gòu)建的載體命名為pMD_DsRed。用Ade I和BspT I酶分別對載體pMD-DsRed和p4ARE-TK_GFP/neo進行雙酶切， 產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)切膠回收后用T4連接酶連接，構(gòu)建的載體命名為p4ARE-TK-GFP/DSRed/ne0 (如 圖1)。實施例1 本發(fā)明雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器的構(gòu)建 (1)紅、綠雙色熒光蛋白報告載體的構(gòu)建
1) PMD-DsRed載體的構(gòu)建
用PCR方法從質(zhì)粒pDsRed2-Nl( Clontech公司)擴增紅色熒光蛋白及其啟動子序列，上 游引物為 5，-CGCCCTTAAGTAGTTATTAATAGTAATCAATT -3，(SEQ ID NO :1)，下游引物為 5，_GA GCACGTAGTGCTACAGGAACAGGTGGTGGCGG -3，(SEQ ID NO :2)。在引物的 5，端分別設(shè)計 BspTI和Ade I兩酶切位點(黑體字所示)，并增加3、個保護堿基。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒 純化回收后與PMD18-T載體(TaKaRa公司)相連，陽性克隆載體經(jīng)常規(guī)酶切鑒定、測序，命名 為 pMD-DsRed ；
2 ) p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo報告載體的構(gòu)建用Ade I和BspT I酶分別對載體 pMD-DsRed和p4ARE-TK-GFP/ne0進行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)切膠回收后用T4連接酶連接，陽 性克隆載體經(jīng)常規(guī)酶切鑒定、測序，命名為p4ARE-TK-GFP/DSRed/ne0。(2)雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器的建立
將p4ARE-TK-GFP/DSRed/ne0大量制備純化后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將載體轉(zhuǎn)染于 !fepG2細胞，轉(zhuǎn)染24、8 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞熒光，可見細胞發(fā)出明顯的紅 色綠色熒光(圖3)，細胞用G418進行篩選，挑取陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，將該雙信號轉(zhuǎn)基因 細胞命名為 H印G2-4ARE-TK-GFP/DsRed。(圖 4)
其工作原理如圖2所示，當化學預(yù)防劑作用于雙信號轉(zhuǎn)基因細胞時，EGFP基因的表達 量與化學預(yù)防劑的作用強度具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，通過測定EGFP和DsRed發(fā)光強度獲 得的相對發(fā)光強度可以反映化學預(yù)防劑的作用強度或快速篩選某些化學預(yù)防劑。實施例2
H印G2-4ARE-TK-GFP/DsRed接種入黑色96孔培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)為5 X IO4個，培 養(yǎng)24 h后加入用二甲基亞砜(DMSO)配制的不同濃度的受試物吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽 (PDTC)和叔丁基對苯二酚(tBHQ)，受試物終濃度設(shè)計為:0(對照)、12· 5、25、50、100和 200 μ Μ,每一濃度組有3個重復，370C，5% CO2培養(yǎng)箱中作用24 48 h，用PBS洗滌后每孔 再加入200 ？ L PBS，用多功能熒光酶標儀檢測細胞的GFP和DsRed熒光強度，其激發(fā)波 長/發(fā)射波長分別為485 nm/530 nm (GFP)和558 nm/ 583 nm (DsRed)，求其相對發(fā)光度。
權(quán)利要求
一種篩選化學預(yù)防劑的雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器，其特征在于，是一種轉(zhuǎn)基因細胞，該轉(zhuǎn)基因細胞帶有抗氧化反應(yīng)元件ARE、TK啟動子、增強綠色熒光蛋白EGFP以及紅色熒光蛋白DsRed，EGFP的表達受ARE的調(diào)控。
2.如權(quán)利要求1所說的篩選化學預(yù)防劑的雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器，其特征在于，所 說的轉(zhuǎn)基因細胞是H印G2-4ARE-TK-GFP/DsRed，即在H印G2細胞中重組整合有ARE、TK、EGFP 和DsRed，且EGFP的表達受ARE的調(diào)控。
3.權(quán)利要求1所說的篩選化學預(yù)防劑的雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器的構(gòu)建方法，是1)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建由TK啟動子啟動以及上游有4個ARE重復序列調(diào)控的EGFP 報告載體；2)將紅色熒光蛋白DsRed及其啟動子片段插入步驟1)的報告載體，構(gòu)建雙信號報告載體；3)將步驟2)的報告載體轉(zhuǎn)染H印G2細胞，得到的轉(zhuǎn)基因細胞即本發(fā)明的雙信號轉(zhuǎn)基因 細胞傳感器。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種篩選化學預(yù)防劑的雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器及其構(gòu)建方法。該雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器帶有抗氧化反應(yīng)元件ARE、TK啟動子、增強綠色熒光蛋白EGFP以及紅色熒光蛋白DsRed。EGFP的表達受ARE的調(diào)控。其構(gòu)建方法是先構(gòu)建由TK啟動子啟動以及上游有4個ARE重復序列調(diào)控的真核報告載體；再將DsRed及其啟動子片段插入該載體構(gòu)建雙信號報告載體；然后將報告載體轉(zhuǎn)染HepG2細胞，得到的轉(zhuǎn)基因細胞即本發(fā)明的雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器。本發(fā)明以EGFP為報告基因，以DsRed為內(nèi)參照所構(gòu)建的雙信號轉(zhuǎn)基因細胞傳感器，不需要添加任何底物和輔助試劑，安全，對環(huán)境無污染，且操作方便、時間短，費用低。
文檔編號C12N15/63GK101948805SQ20101029356
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月27日
發(fā)明者卜平, 徐海榮, 李湘鳴 申請人:揚州大學