專(zhuān)利名稱：利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法。
背景技術(shù)：
凝乳酶屬于酸性蛋白酶，又稱天冬氨酸蛋白酶，是生產(chǎn)干酪不可缺少的制劑。凝乳 酶的傳統(tǒng)來(lái)源是哺乳期期小牛的皺胃，動(dòng)物凝乳酶及其凝乳活力與蛋白水解能力的高比值 成為制作奶酪的首選酶，但是動(dòng)物生長(zhǎng)緩慢且價(jià)格昂貴，容易增加企業(yè)成本，并且從動(dòng)物中 提取酶液程序和工藝較復(fù)雜。木瓜、無(wú)花果、菠蘿、南瓜、合歡樹(shù)、銀杏等植物中都含有能使 乳凝固的蛋白酶，植物來(lái)源的凝乳酶因有太高的蛋白水解活力或本身有毒，因此很多植物 性凝乳酶沒(méi)有得到大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用。微生物凝乳酶來(lái)源廣泛，目前發(fā)現(xiàn)有40余種微生物可發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶，這些微生 物主要是放線菌、細(xì)菌和真菌等，由于微生物發(fā)酵的方法控制容易，成本低，且安全無(wú)毒，而 被廣泛使用。目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的氮源主要來(lái)自大豆組織蛋白和玉米粉，生產(chǎn)成 本較高。乳酸鏈球菌素生產(chǎn)中所產(chǎn)生的廢物菌體直接排放對(duì)環(huán)境造成污染，做成菌體蛋白 飼料成本高，附加值低，而廢物菌體經(jīng)水解后則含有豐富的有機(jī)氮源，可作為凝乳酶發(fā)酵的 原料，另一方面降低發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶中的生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的成本高，乳酸鏈球菌素生產(chǎn)中所 產(chǎn)生的廢物菌體直接排放造成環(huán)境污染、做成菌體蛋白飼料成本高、附加值低的問(wèn)題，而提 供一種利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法。本發(fā)明利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法，可以按以 下步驟實(shí)現(xiàn)一、利用酶水解或酸水解的方法水解乳酸鏈球菌，得到乳酸鏈球菌水解液； 二、利用步驟一得到的乳酸鏈球菌水解液配制培養(yǎng)基將NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高溫淀 粉酶、吐溫80、玉米粉、乳酸鏈球菌水解液和大豆組織蛋白溶解于水中配制培養(yǎng)基，其中 NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L，吐溫 80 0. 13g/ L，玉米粉70g/L，乳酸鏈球菌水解液60 160g/L，大豆組織蛋白0 20g/L，用質(zhì)量濃度 為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，裝入250mL三角瓶中，在0. 14Mpa壓力下滅菌 30min ；三、接種將米黑根毛霉接入種子液培養(yǎng)基中，然后在搖床的轉(zhuǎn)速為260 280rpm， 溫度為37 38°C條件下培養(yǎng)20 24h，再將接種培養(yǎng)后的種子液培養(yǎng)基按體積比1 40 的量接種到步驟二中的三角瓶中；四、培養(yǎng)將三角瓶于37 38°C條件下放在搖床上培養(yǎng)， 搖床的轉(zhuǎn)速為260 280rpm，培養(yǎng)96h，即得到凝乳酶；其中步驟二中乳酸鏈球菌水解液的 總含氮量為0.922% (質(zhì)量)，大豆組織蛋白的含氮量為8% (質(zhì)量)；步驟二中培養(yǎng)基的裝 入量為三角瓶體積的20% ；步驟三中種子液培養(yǎng)基按照下列濃度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L，吐溫 80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L， 大豆組織蛋白18g/L，將它們?nèi)芙庠谒校?50mL三角瓶培養(yǎng)基裝量為20%，用質(zhì)量濃度為 5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min，最終得到種子液中 米黑根毛霉?jié)舛葹? 6X 106cfu/mL。本發(fā)明利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶，減少了乳酸鏈球菌 素生產(chǎn)中所產(chǎn)生的廢物菌體直接排放對(duì)環(huán)境造成的污染，作為凝乳酶發(fā)酵的原料，降低了 發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的成本。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的 任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳 酶的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、利用酶水解或酸水解的方法水解乳酸鏈球菌，得到乳酸鏈 球菌水解液；二、利用步驟一得到的乳酸鏈球菌水解液配制培養(yǎng)基將NaH2PCV Na2HPO4、葡 萄糖、高溫淀粉酶、吐溫80、玉米粉、乳酸鏈球菌水解液和大豆組織蛋白溶解于水中配制培 養(yǎng)基，其中 NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L，吐溫 80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L，乳酸鏈球菌水解液60 160g/L，大豆組織蛋白0 20g/L, 用質(zhì)量濃度為5 6 %的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，裝入250mL三角瓶中，在0. 14Mpa壓 力下滅菌30min ；三、接種將米黑根毛霉接入種子液培養(yǎng)基中，然后在搖床的轉(zhuǎn)速為260 280rpm，溫度為37 38°C條件下培養(yǎng)20 24h，再將接種培養(yǎng)后的種子液培養(yǎng)基按體積比 1 40的量接種到步驟二中的三角瓶中；四、培養(yǎng)將三角瓶于37 38°C條件下放在搖床上 培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速為260 280rpm，培養(yǎng)96h，即得到凝乳酶；其中步驟二中乳酸鏈球菌水 解液的總含氮量為0.922% (質(zhì)量)，大豆組織蛋白的含氮量為8% (質(zhì)量)；步驟二中培 養(yǎng)基的裝入量為三角瓶體積的20% ；步驟三中種子液培養(yǎng)基按照下列濃度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L,葡萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L,吐溫 80 0. 13g/L，玉米 粉70g/L，大豆組織蛋白18g/L，將它們?nèi)芙庠谒校?50mL三角瓶培養(yǎng)基裝量為20%，用 質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min，最終得 到種子液中米黑根毛霉?jié)舛葹? 6X 106cfu/mL。本實(shí)施方式中米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏 管理中心，菌種保藏編號(hào)為AS 3. 4960。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中酶水解的方法 是按下述操作進(jìn)行的用動(dòng)物蛋白酶水解乳酸鏈球菌，動(dòng)物蛋白酶的添加重量是乳酸鏈球 菌菌體濕重的0. 45%，在PH為6. 75、溫度為55°C水浴條件下水解8h，然后再升溫至85°C保 持lOmin，得到乳酸鏈球菌水解液。其他與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中酸水解的方法 是按下述操作進(jìn)行的采用鹽酸將乳酸鏈球菌的PH值調(diào)至1.0，然后在121°C的條件下水解 12h，得到乳酸鏈球菌水解液。其他與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一、二或三不同的是步驟二中加入 的乳酸鏈球菌水解液濃度為70 150g/L。其他與具體實(shí)施方式
一、二或三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四不同的是步驟二中加入的乳酸鏈 球菌水解液濃度為75 140g/L。其他與具體實(shí)施方式
四相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五不同的是步驟二中加入的乳酸鏈 球菌水解液濃度為78g/L。其他與具體實(shí)施方式
五相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
六不同的是步驟二中加入的大豆組 織蛋白濃度為3. 6 9. Og/L。其他與具體實(shí)施方式
六相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
七不同的是步驟二中加入的大豆組 織蛋白濃度為5.4g/L。其他與具體實(shí)施方式
七相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳 酶的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、用動(dòng)物蛋白酶水解乳酸鏈球菌，動(dòng)物蛋白酶的添加重量是 乳酸鏈球菌菌體濕重的0. 45%，在PH為6. 75、溫度為55°C水浴條件下水解8h，然后再升 溫至85°C保持lOmin，得到乳酸鏈球菌水解液；二、利用步驟一得到的乳酸鏈球菌水解液配 制培養(yǎng)基將NaH2P04、Na2HPO4、葡萄糖、高溫淀粉酶、吐溫80、玉米粉和乳酸鏈球菌水解液 溶解于水中配制培養(yǎng)基，其中NaH2PO4 3. 25g/L, Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高溫淀 粉酶20g/L，吐溫80 0. 13g/L，玉米粉70g/L，乳酸鏈球菌水解液156g/L，用質(zhì)量濃度為 5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6.8，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min ；三、接種將米黑根 毛霉接入種子液培養(yǎng)基中，然后在搖床的轉(zhuǎn)速為260 280rpm，溫度為37 38°C條件下 培養(yǎng)20 24h，再將接種培養(yǎng)后的種子液培養(yǎng)基按體積比1 :40的量接種到步驟二中的三 角瓶中；四、培養(yǎng)將三角瓶于37 38°C條件下放在搖床上培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速為260rpm，培 養(yǎng)96h，即得到凝乳酶；其中步驟二中乳酸鏈球菌水解液的總含氮量為0.922% (質(zhì)量)；步 驟二中培養(yǎng)基的裝入量為三角瓶體積的20% ；步驟三中種子液培養(yǎng)基按照下列濃度配制 NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L,葡萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L，吐溫 80 0. 13g/ L，玉米粉70g/L，大豆組織蛋白18g/L，將它們?nèi)芙庠谒校?50mL三角瓶培養(yǎng)基裝量為 20%,用質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min， 最終得到種子液中米黑根毛霉?jié)舛葹? 6X 106cfu/mL。本實(shí)施方式生產(chǎn)的凝乳酶經(jīng)檢測(cè)活力為47. 5IMCU/ml。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳 酶的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、用動(dòng)物蛋白酶水解乳酸鏈球菌，動(dòng)物蛋白酶的添加重量是 乳酸鏈球菌菌體濕重的0. 45%，在pH為6. 75、溫度為55°C水浴條件下水解8h，然后再升 溫至85°C保持lOmin，得到乳酸鏈球菌水解液；二、利用步驟一得到的乳酸鏈球菌水解液配 制培養(yǎng)基將NaH2P04、Na2HPO4、葡萄糖、高溫淀粉酶、吐溫80、玉米粉、乳酸鏈球菌水解液和 大豆組織蛋白溶解于水中配制培養(yǎng)基，其中NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖 2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L,吐溫80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L，乳酸鏈球菌水解液:140g/ L，大豆組織蛋白1. 8g/L，用質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa 壓力下滅菌30min;三、接種將米黑根毛霉接入種子液培養(yǎng)基中，然后在搖床的轉(zhuǎn)速為 260 280rpm，溫度為37 38°C條件下培養(yǎng)20 24h，再將接種培養(yǎng)后的種子液培養(yǎng)基按 體積比1 40的量接種到步驟二中的三角瓶中；四、培養(yǎng)將三角瓶于37 38°C條件下放 在搖床上培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速為260rpm，培養(yǎng)96h，即得到凝乳酶；其中步驟二中乳酸鏈球菌 水解液的總含氮量為0.922% (質(zhì)量)，大豆組織蛋白的含氮量為8% (質(zhì)量)；步驟二中培養(yǎng)基的裝入量為三角瓶體積的20%;步驟三中種子液培養(yǎng)基按照下列濃度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L,吐溫 80 0. 13g/L，玉米 粉70g/L，大豆組織蛋白18g/L，將它們?nèi)芙庠谒校?50mL三角瓶培養(yǎng)基裝量為20%，用 質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min，最終得 到種子液中米黑根毛霉?jié)舛葹? 6X 106cfu/mL。本實(shí)施方式生產(chǎn)的凝乳酶經(jīng)檢測(cè)活力為55. 2IMCU/ml。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝 乳酶的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、用動(dòng)物蛋白酶水解乳酸鏈球菌，動(dòng)物蛋白酶的添加重量 是乳酸鏈球菌菌體濕重的0. 45%，在pH為6. 75、溫度為55°C水浴條件下水解8h，然后再 升溫至85°C保持lOmin，得到乳酸鏈球菌水解液；二、利用步驟一得到的乳酸鏈球菌水解液 配制培養(yǎng)基將NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高溫淀粉酶、吐溫80、玉米粉、乳酸鏈球菌水解液 和大豆組織蛋白溶解于水中配制培養(yǎng)基，其中NaH2PO4 3. 25g/L, Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖
2.14g/L，高溫淀粉酶:20g/L,吐溫80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L，乳酸鏈球菌水解液:125g/ L，大豆組織蛋白3. 6g/L，用質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa 壓力下滅菌30min;三、接種將米黑根毛霉接入種子液培養(yǎng)基中，然后在搖床的轉(zhuǎn)速為 260 280rpm，溫度為37 38°C條件下培養(yǎng)20 24h，再將接種培養(yǎng)后的種子液培養(yǎng)基按 體積比1 40的量接種到步驟二中的三角瓶中；四、培養(yǎng)將三角瓶于37 38°C條件下放 在搖床上培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速為260rpm，培養(yǎng)96h，即得到凝乳酶；其中步驟二中乳酸鏈球菌 水解液的總含氮量為0.922% (質(zhì)量)，大豆組織蛋白的含氮量為8% (質(zhì)量)；步驟二中 培養(yǎng)基的裝入量為三角瓶體積的20%;步驟三中種子液培養(yǎng)基按照下列濃度配制=NaH2PO4
3.25g/L，Na2HPO4 3. llg/L,葡萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L,吐溫 80 0. 13g/L，玉米 粉70g/L，大豆組織蛋白18g/L，將它們?nèi)芙庠谒校?50mL三角瓶培養(yǎng)基裝量為20%，用 質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min，最終得 到種子液中米黑根毛霉?jié)舛葹? 6X 106cfu/mL。本實(shí)施方式生產(chǎn)的凝乳酶經(jīng)檢測(cè)活力為75. lIMCU/ml。
具體實(shí)施方式
十二 本實(shí)施方式利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝 乳酶的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、用動(dòng)物蛋白酶水解乳酸鏈球菌，動(dòng)物蛋白酶的添加重量 是乳酸鏈球菌菌體濕重的0. 45%，在pH為6. 75、溫度為55°C水浴條件下水解8h，然后再 升溫至85°C保持lOmin，得到乳酸鏈球菌水解液；二、利用步驟一得到的乳酸鏈球菌水解液 配制培養(yǎng)基將NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高溫淀粉酶、吐溫80、玉米粉、乳酸鏈球菌水解液 和大豆組織蛋白溶解于水中配制培養(yǎng)基，其中NaH2PO4 3. 25g/L, Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖 2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L,吐溫80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L，乳酸鏈球菌水解液:109g/ L，大豆組織蛋白5. 4g/L，用質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa 壓力下滅菌30min;三、接種將米黑根毛霉接入種子液培養(yǎng)基中，然后在搖床的轉(zhuǎn)速為 260 280rpm，溫度為37 38°C條件下培養(yǎng)20 24h，再將接種培養(yǎng)后的種子液培養(yǎng)基按 體積比1 40的量接種到步驟二中的三角瓶中；四、培養(yǎng)將三角瓶于37 38°C條件下放 在搖床上培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速為260rpm，培養(yǎng)96h，即得到凝乳酶；其中步驟二中乳酸鏈球菌 水解液的總含氮量為0.922% (質(zhì)量)，大豆組織蛋白的含氮量為8% (質(zhì)量)；步驟二中 培養(yǎng)基的裝入量為三角瓶體積的20%;步驟三中種子液培養(yǎng)基按照下列濃度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L,吐溫 80 0. 13g/L，玉米 粉70g/L，大豆組織蛋白18g/L，將它們?nèi)芙庠谒校?50mL三角瓶培養(yǎng)基裝量為20%，用 質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min，最終得 到種子液中米黑根毛霉?jié)舛葹? 6X 106cfu/mL。本實(shí)施方式生產(chǎn)的凝乳酶經(jīng)檢測(cè)活力為91. 8IMCU/ml。
具體實(shí)施方式
十三本實(shí)施方式利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn) 凝乳酶的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、用動(dòng)物蛋白酶水解乳酸鏈球菌，動(dòng)物蛋白酶的添加重 量是乳酸鏈球菌菌體濕重的0. 45%，在pH為6. 75、溫度為55°C水浴條件下水解8h，然后 再升溫至85°C保持lOmin，得到乳酸鏈球菌水解液；二、利用步驟一得到的乳酸鏈球菌水 解液配制培養(yǎng)基將NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高溫淀粉酶、吐溫80、玉米粉、乳酸鏈球菌水 解液和大豆組織蛋白溶解于水中配制培養(yǎng)基，其中NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡 萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L,吐溫80 0. 13g/L，玉米粉:70g/L，乳酸鏈球菌水解液 93. 6g/L，大豆組織蛋白7. 2g/L，用質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在 0. 14Mpa壓力下滅菌30min ；三、接種將米黑根毛霉接入種子液培養(yǎng)基中，然后在搖床的轉(zhuǎn) 速為260 280rpm，溫度為37 38°C條件下培養(yǎng)20 24h，再將接種培養(yǎng)后的種子液培養(yǎng) 基按體積比1 :40的量接種到步驟二中的三角瓶中；四、培養(yǎng)將三角瓶于37 38°C條件下 放在搖床上培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速為260rpm，培養(yǎng)96h，即得到凝乳酶；其中步驟二中乳酸鏈球 菌水解液的總含氮量為0.922% (質(zhì)量)，大豆組織蛋白的含氮量為8% (質(zhì)量)；步驟二中 培養(yǎng)基的裝入量為三角瓶體積的20%;步驟三中種子液培養(yǎng)基按照下列濃度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L,葡萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L,吐溫 80 0. 13g/L，玉米 粉70g/L，大豆組織蛋白18g/L，將它們?nèi)芙庠谒校?50mL三角瓶培養(yǎng)基裝量為20%，用 質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min，最終得 到種子液中米黑根毛霉?jié)舛葹? 6X 106cfu/mL。本實(shí)施方式生產(chǎn)的凝乳酶經(jīng)檢測(cè)活力為115.3IMCU/ml。
具體實(shí)施方式
十四本實(shí)施方式利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝 乳酶的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、用動(dòng)物蛋白酶水解乳酸鏈球菌，動(dòng)物蛋白酶的添加重量 是乳酸鏈球菌菌體濕重的0. 45%，在pH為6. 75、溫度為55°C水浴條件下水解8h，然后再 升溫至85°C保持lOmin，得到乳酸鏈球菌水解液；二、利用步驟一得到的乳酸鏈球菌水解液 配制培養(yǎng)基將NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高溫淀粉酶、吐溫80、玉米粉、乳酸鏈球菌水解液 和大豆組織蛋白溶解于水中配制培養(yǎng)基，其中NaH2PO4 3. 25g/L, Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖 2. 14g/L，高溫淀粉酶20g/L，吐溫80 0. 13g/L，玉米粉70g/L，乳酸鏈球菌水解液78g/L， 大豆組織蛋白9g/L，用質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓 力下滅菌30min ；三、接種將米黑根毛霉接入種子液培養(yǎng)基中，然后在搖床的轉(zhuǎn)速為260 280rpm，溫度為37 38°C條件下培養(yǎng)20 24h，再將接種培養(yǎng)后的種子液培養(yǎng)基按體積比 1 40的量接種到步驟二中的三角瓶中；四、培養(yǎng)將三角瓶于37 38°C條件下放在搖床 上培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速為260rpm，培養(yǎng)96h，即得到凝乳酶；其中步驟二中乳酸鏈球菌水解液 的總含氮量為0.922% (質(zhì)量)，大豆組織蛋白的含氮量為8% (質(zhì)量)；步驟二中培養(yǎng)基的 裝入量為三角瓶體積的20% ；步驟三中種子液培養(yǎng)基按照下列濃度配制=NaH2PO4 3. 25g/ L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖:2· 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L，吐溫 80 :0· 13g/L，玉米粉:70g/L，大豆組織蛋白18g/L，將它們?nèi)芙庠谒校?50mL三角瓶培養(yǎng)基裝量為20%，用質(zhì)量濃度 為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min，最終得到種子液 中米黑根毛霉?jié)舛葹? 6X 106cfu/mL。本實(shí)施方式生產(chǎn)的凝乳酶經(jīng)檢測(cè)活力為134.0IMCU/ml。
具體實(shí)施方式
十五本實(shí)施方式利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝 乳酶的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、采用鹽酸將乳酸鏈球菌的PH值調(diào)至1.0，然后在121°C的 條件下水解12h，得到乳酸鏈球菌水解液；二、利用步驟一得到的乳酸鏈球菌水解液配制培 養(yǎng)基將NaH2P04、Na2HP04、葡萄糖、高溫淀粉酶、吐溫80、玉米粉和乳酸鏈球菌水解液溶解于 水中配制培養(yǎng)基，其中NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶 20g/L，吐溫80 0. 13g/L，玉米粉70g/L，乳酸鏈球菌水解液160g/L，將它們?nèi)芙庥谒校?用質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min ；三、接 種將米黑根毛霉接入種子液培養(yǎng)基中，然后在搖床的轉(zhuǎn)速為260 280rpm，溫度為37 38°C條件下培養(yǎng)20 24h，再將接種培養(yǎng)后的種子液培養(yǎng)基按體積比1 40的量接種到步 驟二中的三角瓶中；四、培養(yǎng)將三角瓶于37 38°C條件下放在搖床上培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速為 260rpm，培養(yǎng)96h，即得到凝乳酶；其中步驟二中乳酸鏈球菌水解液的總含氮量為0. 922% (質(zhì)量)；步驟二中培養(yǎng)基的裝入量為三角瓶體積的20%;步驟三中種子液培養(yǎng)基按照下列 濃度配制=NaH2PO4 3. 25g/L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L，吐溫 80 0. 13g/L，玉米粉70g/L，大豆組織蛋白18g/L，將它們?nèi)芙庠谒校?50mL三角瓶培養(yǎng) 基裝量為20%，用質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力下滅 菌30min，最終得到種子液中米黑根毛霉?jié)舛葹? 6 X 106cfu/mL。本實(shí)施方式生產(chǎn)的凝乳酶經(jīng)檢測(cè)活力為84. 0IMCU/ml。
具體實(shí)施方式
十六本實(shí)施方式利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝 乳酶的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、采用鹽酸將乳酸鏈球菌的PH值調(diào)至1.0，然后在121°C的 條件下水解12h，得到乳酸鏈球菌水解液；二、利用步驟一得到的乳酸鏈球菌水解液配制培 養(yǎng)基將NaH2PCV Na2HPO4、葡萄糖、高溫淀粉酶、吐溫80、玉米粉、乳酸鏈球菌水解液和大豆 組織蛋白溶解于水中配制培養(yǎng)基，其中NaH2PO4 3. 25g/L, Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖2. 14g/ L,高溫淀粉酶20g/L，吐溫80 0. 13g/L，玉米粉70g/L，乳酸鏈球菌水解液80g/L，大豆組 織蛋白9g/L，然后用質(zhì)量濃度為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力 下滅菌30min ；三、接種將米黑根毛霉接入種子液培養(yǎng)基中，然后在搖床的轉(zhuǎn)速為260 280rpm，溫度為37 38°C條件下培養(yǎng)20 24h，再將接種培養(yǎng)后的種子液培養(yǎng)基按體積比 1 40的量接種到步驟二中的三角瓶中；四、培養(yǎng)將三角瓶于37 38°C條件下放在搖床 上培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速為260rpm，培養(yǎng)96h，即得到凝乳酶；其中步驟二中乳酸鏈球菌水解液 的總含氮量為0.922% (質(zhì)量)，大豆組織蛋白的含氮量為8% (質(zhì)量)；步驟二中培養(yǎng)基的 裝入量為三角瓶體積的20% ；步驟三中種子液培養(yǎng)基按照下列濃度配制=NaH2PO4 3. 25g/ L，Na2HPO4 3. llg/L，葡萄糖:2· 14g/L，高溫淀粉酶:20g/L，吐溫 80 :0· 13g/L，玉米粉:70g/ L，大豆組織蛋白18g/L，將它們?nèi)芙庠谒校?50mL三角瓶培養(yǎng)基裝量為20%，用質(zhì)量濃度 為5 6%的氫氧化鈉調(diào)pH至6. 7 6. 8，在0. 14Mpa壓力下滅菌30min，最終得到種子液 中米黑根毛霉?jié)舛葹? 6X 106cfu/mL。本實(shí)施方式生產(chǎn)的凝乳酶經(jīng)檢測(cè)活力為118.5IMCU/ml。
權(quán)利要求
利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法，其特征在于它按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、利用酶水解或酸水解的方法水解乳酸鏈球菌，得到乳酸鏈球菌水解液；二、利用步驟一得到的乳酸鏈球菌水解液配制培養(yǎng)基將NaH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、高溫淀粉酶、吐溫80、玉米粉、乳酸鏈球菌水解液和大豆組織蛋白溶解于水中配制培養(yǎng)基，其中NaH2PO43.25g/L，Na2HPO43.11g/L，葡萄糖2.14g/L，高溫淀粉酶20g/L，吐溫800.13g/L，玉米粉70g/L，乳酸鏈球菌水解液60～160g/L，大豆組織蛋白0～20g/L，用質(zhì)量濃度為5～6％的氫氧化鈉調(diào)pH至6.7～6.8，裝入250mL三角瓶中，在0.14Mpa壓力下滅菌30min；三、接種將米黑根毛霉接入種子液培養(yǎng)基中，然后在搖床的轉(zhuǎn)速為260～280rpm，溫度為37～38℃條件下培養(yǎng)20～24h，再將接種培養(yǎng)后的種子液按體積比140的量接種到步驟二中的三角瓶中；四、培養(yǎng)將三角瓶于37～38℃條件下放在搖床上培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速為260～280rpm，培養(yǎng)96h，即得到凝乳酶；其中步驟二中乳酸鏈球菌水解液的總含氮量為0.922％(質(zhì)量)，大豆組織蛋白的含氮量為8％(質(zhì)量)；步驟二中培養(yǎng)基的裝入量為三角瓶體積的20％；步驟三中種子液培養(yǎng)基按照下列濃度配制NaH2PO43.25g/L，Na2HPO43.11g/L，葡萄糖2.14g/L，高溫淀粉酶20g/L，吐溫800.13g/L，玉米粉70g/L，大豆組織蛋白18g/L，將它們?nèi)芙庠谒校?50mL三角瓶培養(yǎng)基裝量為20％，用質(zhì)量濃度為5～6％的氫氧化鈉調(diào)pH至6.7～6.8，在0.14Mpa壓力下滅菌30min，最終得到種子液中米黑根毛霉?jié)舛葹?～6×106cfu/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方 法，其特征在于步驟一中酶水解的方法是按下述操作進(jìn)行的用動(dòng)物蛋白酶水解乳酸鏈球 菌，動(dòng)物蛋白酶的添加重量是乳酸鏈球菌菌體濕重的0. 45%，在pH為6. 75、溫度為55°C水 浴條件下水解8h，然后再升溫至85°C保持lOmin，得到乳酸鏈球菌水解液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方 法，其特征在于步驟一中酸水解的方法是按下述操作進(jìn)行的采用鹽酸將乳酸鏈球菌的PH 值調(diào)至1. 0，然后在121°C的條件下水解12h，得到乳酸鏈球菌水解液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶 的方法，其特征在于步驟二中加入的乳酸鏈球菌水解液濃度為70 150g/L。
5 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方 法，其特征在于步驟二中加入的乳酸鏈球菌水解液濃度為75 140g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方 法，其特征在于步驟二中加入的乳酸鏈球菌水解液濃度為78g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方 法，其特征在于步驟二中加入的大豆組織蛋白濃度為3. 6 9. Og/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方 法，其特征在于步驟二中加入的大豆組織蛋白濃度為5. 4g/L。
全文摘要
利用乳酸鏈球菌水解液作為部分氮源發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的方法，本發(fā)明涉及應(yīng)用水解液生產(chǎn)凝乳酶的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有微生物發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的成本高，乳酸鏈球菌發(fā)酵廢液直接排放造成環(huán)境污染的問(wèn)題。本發(fā)明采用動(dòng)物蛋白酶或鹽酸水解乳酸鏈球菌。凝乳酶的生產(chǎn)方法如下將NaH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、高溫淀粉酶、吐溫80、玉米粉、乳酸鏈球菌水解液和大豆組織蛋白加入到三角瓶中，培養(yǎng)96h，即得凝乳酶。本發(fā)明利用乳酸鏈球菌水解液作為氮源替代大豆組織蛋白生產(chǎn)凝乳酶，不但減少了污染物的排放，還降低了生產(chǎn)凝乳酶的成本，廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N9/58GK101914513SQ20101028195
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者張欽革, 王貴元, 郭坤, 馬之霄, 馬莉, 黃亦存 申請(qǐng)人:安泰生物工程股份有限公司