專利名稱：nisin-rbLF-N融合基因以及表達(dá)該融合基因的畢赤酵母工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種高效表達(dá)重組nisin-rbLF-N融合 基因的畢赤酵母工程菌、其構(gòu)建方法及誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種高效、無毒的天然防腐劑，也是唯一一種可作為防 腐劑應(yīng)用于食品的細(xì)菌素。Nisin又稱乳酸鏈球菌肽，是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽物 質(zhì)，它能有效抑殺嗜熱脂肪芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、肉毒梭 菌、乳酸菌等各種革蘭氏陽性菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和芽孢。加入食品中，可大大地降低食品的滅菌 溫度、縮短食品滅菌時(shí)間，使食品保持原有營(yíng)養(yǎng)成份、風(fēng)味、色澤，同時(shí)還可節(jié)約大量能源。 可廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、植物蛋白食品、罐裝食品、果汁飲料及經(jīng)熱處理密閉包裝食 品的防腐保鮮，同時(shí)也可應(yīng)用于化妝品和醫(yī)療保健品等領(lǐng)域。乳鐵蛋白肽(LFcin)是乳鐵蛋白在酸性環(huán)境下經(jīng)胃蛋白酶作用N端釋放的一段多 肽，廣泛存在于動(dòng)物的乳汁、體液、淚液、唾液、血漿、中性粒細(xì)胞及多種組織中。具有抗菌、 抗病毒、抗氧化、消炎、抗癌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、促進(jìn)骨細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生物功能，在眾多的功 能中，抗菌功能是最引人注目的，而對(duì)真核細(xì)胞幾乎沒有毒性。且牛乳鐵蛋白氨基末端多肽 (rbLF-N)的抗菌活性較其它的乳鐵蛋白肽活性高具有很好的應(yīng)用前景。Nisin應(yīng)用前景廣闊，但也存在局限性，如不能夠抑制G-菌、酵母菌以及霉菌，在 中性及堿性環(huán)境中溶解度低、不穩(wěn)定而且抗菌效果大大降低等，因此擴(kuò)大nisin抗菌譜的 研究不僅具有理論價(jià)值，而且具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明針對(duì)乳鏈菌肽(nisin)抑菌譜窄的缺點(diǎn)，選擇抗菌譜較廣且具有較強(qiáng)抗性 的牛乳鐵蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)為材料，構(gòu)建融合基因nisin-rbLF-N，并在畢赤酵母 GS115宿主中進(jìn)行表達(dá)，獲得具有較廣抗菌譜的融合蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能在畢赤酵母中高效表達(dá)的重組nisin-rbLF-N融合基 因。本發(fā)明的另一目的是提供一種含有所述重組nisin-rbLF-N融合基因的表達(dá)載 體。本發(fā)明的再一目的是提供能夠高效表達(dá)重組nisin-rbLF-N融合基因的畢赤酵母 工程菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述畢赤酵母工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種融合基因，其含有編碼乳酸鏈球菌素的 nisin基因和編碼牛乳鐵蛋白氨基末端多肽的rbLF-N基因。前述的融合基因?yàn)镹isin-rbLF-N，其具有Seq ID No. 1所示的核苷酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的具有編碼同等功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供含有上述融合基因的載體。優(yōu)選地，其出發(fā)載體為PPIC9K。本發(fā)明還提供含有上述載體的工程菌。優(yōu)選地，所述工程菌為畢赤酵母。更優(yōu)選 地，其為畢赤酵母GS115。本發(fā)明另外提供構(gòu)建上述畢赤酵母GS115工程菌的方法。根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，設(shè)計(jì)并合成適于在BL21中表達(dá)的nisin基因，并在5’端和 3’端設(shè)計(jì)EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)，將優(yōu)化后的nisin基因克隆于pMD19_T載體。根據(jù) 目的序列分別設(shè)計(jì)引物。在上游引物設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)BamH I (下劃線標(biāo)記)和保護(hù)堿基。上游引物Fl :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’ ；下游引物Rl :5，-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3，。根據(jù)牛乳鐵蛋白cDNA序列，設(shè)計(jì)引物。在上游引物設(shè)計(jì)與nisin互補(bǔ)配對(duì)的序列 (下劃線標(biāo)記)，下游引物設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)EcoR I (下劃線標(biāo)記)、終止密碼子和保護(hù)堿基。上游引物F2 :5，-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3 ；下游引物R2 5，-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3，。以合成的pMD19-T/niSin質(zhì)粒為模板，用引物Fl、Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增nisin基因 為179bp，純化回收PCR產(chǎn)物；以牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增 rbLF-N基因?yàn)?81bp，純化回收PCR產(chǎn)物；以純化回收后的nisin基因和rbLF_N基因?yàn)槟?板，用引物Fl、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增nisin-rbLF-N融合基因約為340bp。將上述合成的nisin-rbLF-N融合基因插入到載體pPIC9K中，將該載體轉(zhuǎn)入畢赤 酵母GS115中，然后進(jìn)行重組克隆的篩選，獲得重組畢赤酵母GS115工程菌，冷凍保存。為了獲得Nisin-rbLF-N重組蛋白的高效表達(dá)，所述赤酵母GSl 15工程菌在如下條 件下誘導(dǎo)培養(yǎng)1)將重組酵母凍存菌種接于YPD平板上活化，28°C培養(yǎng)2d，至長(zhǎng)出單菌落；2)挑取一活化的單菌落于200mL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30°C，250rpm培養(yǎng)，直至 培養(yǎng)基的OD6tltl達(dá)到2. 0 6. 0 ；3) 6000rpm離心5min收集菌體，用無菌水洗滌菌體1 2次；4)將菌體轉(zhuǎn)移至200mL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于28 30°C，200rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)1 2d。優(yōu)選地，誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為28°C，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間間為2d。本發(fā)明選用的pPIC9K質(zhì)粒是表達(dá)融合蛋白的畢赤酵母GSl 15高效表達(dá)載體，選擇 該載體的主要原因是①PPIC9K含有乙醇氧化酶AOXl的調(diào)控序列，當(dāng)其轉(zhuǎn)化入受體菌株 中，能與受體染色體上相應(yīng)的序列AOXl發(fā)生同源重組，從而使整個(gè)載體連同外源基因被插 入到受體染色體上，外源基因可在AOXl啟動(dòng)子控制下穩(wěn)定地表達(dá)②質(zhì)粒pPIC9K攜帶有野 生型HIS4基因，于是通過基因的互補(bǔ)作用，野生型HIS4基因就可作為His+重組子的篩選 標(biāo)記。所以重組菌株可以在不含組氨酸的MD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。本發(fā)明將上述pPIC9K/niSin-rbLF-N原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母，然后進(jìn)行重組 克隆的篩選，從而獲得重組畢赤酵母工程菌，其出發(fā)菌株優(yōu)選為GS115。本發(fā)明針對(duì)Msin抑菌譜窄的缺點(diǎn)，選擇對(duì)抗菌譜較廣且具有較強(qiáng)抗性的rbLF-N 為材料，構(gòu)建nisin-rbLF-N融合基因，并在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，獲得具有G+菌和G-菌抗 性的融合蛋白。其優(yōu)點(diǎn)在于
(1)本發(fā)明針對(duì)乳鏈菌肽(Msin)抑菌譜窄的缺點(diǎn)，選擇對(duì)抗菌譜較廣且具有較 強(qiáng)抗性的牛乳鐵蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)為材料，通過特異引物的設(shè)計(jì)用PCR技術(shù)成功 獲得融合蛋白基因nisin-rbLF-N，并能夠由畢赤酵母GSl 15高效表達(dá)。(2)使用pPIC9K作為表達(dá)載體，pPIC9K含有乙醇氧化酶AOXl的調(diào)控序列，當(dāng)其轉(zhuǎn) 化入受體菌株中，能與受體染色體上相應(yīng)的序列AOXl發(fā)生同源重組，從而使整個(gè)載體連同 外源基因被插入到受體染色體上，外源基因可在AOXl啟動(dòng)子控制下穩(wěn)定地表達(dá)。同時(shí)質(zhì)粒 PPIC9K攜帶有野生型HIS4基因，于是通過基因的互補(bǔ)作用，野生型HIS4基因就可作為His+ 重組子的篩選標(biāo)記。所以重組菌株可以在不含組氨酸的MD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。(3)本發(fā)明將融合基因nisin-rbLF-N克隆到原核表達(dá)載體pPIC9K中，轉(zhuǎn)化畢赤 酵母GS115進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后可表達(dá)出可觀的融合蛋白，融合蛋白的大小為 IOkDa左右。在信號(hào)肽的作用下，融合蛋白nisin-rbLF-N可順利地分泌到培養(yǎng)基的上清 中。去糖基化后的融合蛋白經(jīng)過復(fù)合蛋白酶酶解后具有抑干酪乳桿菌(G+菌)和大腸桿菌 (G-菌)的作用。


圖1為本發(fā)明以合成的pMD19-T/niSin質(zhì)粒為模板，用引物Fl、Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增 的nisin基因片段和以牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的rbLF_N 基因片段；其中1為擴(kuò)增目的片段nisin ；2為陰性對(duì)照；3為擴(kuò)增目的片段rbLF_N ；4為陰 性對(duì)照；5 為 DL2000Marker。圖2為本發(fā)明以純化回收后的nisin基因片段和rbLF-N基因片段為模板，用引物 Fl、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增nisin-rbLF-N融合基因片段；其中1為nisin-rbLF-N的PCR產(chǎn)物；2 為 DL2000Markero圖3為本發(fā)明重組質(zhì)粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N的酶切鑒定電泳圖，其中，1為 DL2000Marker ；2為目的基因nisin-rbLF-N PCR產(chǎn)物對(duì)照；3為重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；4為 重組表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9K/nisin-rbLF-N。圖4為本發(fā)明用特異引物Fl和R2從pGEM_T easy/nisin-rbLF-N質(zhì)粒中擴(kuò)增到 長(zhǎng)度約為 340bp 的融合基因；其中，1 為 DL2000Marker ；2 為 pGEM_T easy/nisin-rbLF-N 質(zhì) 粒的PCR產(chǎn)物。圖5為本發(fā)明重組質(zhì)粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N和載體pPIC9K純化回收后的 目的基因，經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切鑒定電泳圖，其中，1為DL2000Marker ;2為目的基因 nisin-rbLF-N的PCR產(chǎn)物對(duì)照；3為重組質(zhì)粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N ；4為重組質(zhì)粒 pGEM-T easy/nisin-rbLF-N 雙酶切產(chǎn)物；5 為重組表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9K/nisin-rbLF_N ；6 為重 組質(zhì)粒 pPIC9K/nisin-rbLF-N 雙酶切產(chǎn)物；7 為 DL2000Marker。圖6為本發(fā)明酵母轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖；其中，1為DL2000Marker ；2為陽 性對(duì)照；3 13為重組酵母菌株P(guān)CR產(chǎn)物；14為陰性對(duì)照。圖7為本發(fā)明不同天數(shù)誘導(dǎo)的重組酵母菌株上清中蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳圖，其 中，1為小分子量蛋白Marker ；2 6分別代表菌株誘導(dǎo)1、2、3、4、5天的蛋白表達(dá)量。圖8為本發(fā)明nisin-rbLF-N融合蛋白對(duì)干酪乳桿菌(G+菌)的抑菌活性圖，其中 1為處理后的表達(dá)上清液去糖基化并酶切后的上清液100 μ L ；2為陽性對(duì)照乳酸鏈球菌
5素10 μ L ;3為陰性對(duì)照未處理的表達(dá)上清液100 μ L ；4為陰性對(duì)照處理后的空載體的酵 母發(fā)酵液100 μ L。圖9為本發(fā)明nisin-rbLF-N融合蛋白對(duì)大腸桿菌(G_菌)的抑菌活性圖，其中 1和2為處理后的表達(dá)上清液去糖基化并酶切后的上清液100 μ L ；3為陰性對(duì)照未處理 的表達(dá)上清液100 μ L ;4為陰性對(duì)照處理后的空載體的酵母發(fā)酵液100 μ L0
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 nisin基因及牛乳鐵蛋白基因引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)nisin基因序列及蛋白序列，使目的基因獲得穩(wěn)定表達(dá)，用適于在BL21中表 達(dá)的密碼子代替那些不適合于在其中表達(dá)的密碼子優(yōu)化nisin基因，并在5’端和3’端設(shè) 計(jì)EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)。優(yōu)化后的nisin基因序列合成并克隆于pMD19_T載體。根 據(jù)目的序列分別設(shè)計(jì)引物。在上游引物設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)BamH I (下劃線標(biāo)記)和保護(hù)堿基。上游引物Fl :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’ ；下游引物Rl :5，-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3，。根據(jù)牛乳鐵蛋白cDNA序列，設(shè)計(jì)引物。在上游引物設(shè)計(jì)與nisin互補(bǔ)配對(duì)的序列 (下劃線標(biāo)記)，下游引物設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)EcoR I (下劃線標(biāo)記)、終止密碼子和保護(hù)堿基。上游引物F2:5， -GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3’ ；下游引物R2:5，-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’。實(shí)施例2 重組質(zhì)粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N的構(gòu)建與鑒定以合成的pMD19-T/niSin質(zhì)粒為模板，用引物Fl、Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增nisin基因?yàn)?179bp，純化回收PCR產(chǎn)物(圖1)；以牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2進(jìn)行PCR擴(kuò) 增rbLF-N基因?yàn)?81bp，純化回收PCR產(chǎn)物(圖1)；以純化回收后的nisin基因和rbLF_N 基因?yàn)槟０澹靡颋1、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增ηi sin-rbLF-N融合基因約為340bp，純化回收PCR 產(chǎn)物(圖2)后與pGEM-T easy載體連接，并轉(zhuǎn)化E. cili DH5 α，用PCR及EcoR I和BamH I雙酶切鑒定陽性克隆。實(shí)施例3 nisin-rbLF-N基因克隆載體的構(gòu)建根據(jù)表達(dá)載體基因序列和目的基因序列分別設(shè)計(jì)引物，在上游引物設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn) EcoR I (下劃線標(biāo)記)和保護(hù)堿基，下游引物設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)Not I (下劃線標(biāo)記)、終止密碼 子和保護(hù)堿基。F3 :5， -CGGAATTCATGAGCACCAAAGAT-3’R3 :5， -TTGCGGCCGCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3‘以重組的pGEM-T easy/nisin-rbLF-N質(zhì)粒為模板，F(xiàn)3和R3為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)， PCR采用25 μ L反應(yīng)體系。將nisin-rbLF-N基因的PCR回收產(chǎn)物通過連接酶連接到pGEM-Teasy克隆載體 上。連接反應(yīng)采用10 μ L體系，連接后，將連接產(chǎn)物通過熱激反應(yīng)立即轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。
挑取平板上的白色菌落(轉(zhuǎn)化子)，接種于加Amf的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37°C，150rpm振蕩培養(yǎng)12h。取1 μ L菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。挑取陽性菌落小量提取質(zhì)粒。(圖 3和圖4)實(shí)施例4 nisin-rbLF-N基因表達(dá)載體的構(gòu)建上述克隆載體構(gòu)建好后，同時(shí)用EcoR I和Not I對(duì)重組質(zhì)粒pGEM_T/ nisin-rbLF-N和酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K進(jìn)行雙酶切，酶切采用20 μ L體系。之后將回 收的pPIC9K載體片段與nisin-rbLF-N基因片段進(jìn)行體外連接，連接反應(yīng)采用20 μ L體系。 (圖5)實(shí)施例5畢赤酵母菌株GS115的轉(zhuǎn)化1、活化巴斯德畢赤酵母菌株GS115取200μ L于-80°C凍存的GSl 15菌株接入2mL新鮮的YPD培養(yǎng)基中，28 °C搖床 200rpm過夜培養(yǎng)后，于新鮮的YPD平板上劃線，28 °C培養(yǎng)2天至出現(xiàn)單菌落。2、制備GS115感受態(tài)細(xì)胞a)挑取一個(gè)單菌落接種于5mLYPD培養(yǎng)基中，28°C搖床180rpm過夜培養(yǎng)，取出2mL 接種于200mL YPD培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD6tltl = 1. 3-1. 5，其余可用20%的甘油進(jìn)行菌種保藏。b)于4°C，1500 X g離心5min收集菌體細(xì)胞，并用200mL冰預(yù)冷無菌水重懸菌體細(xì)胞。c)于4°C，1500 X g離心5min收集菌體細(xì)胞，再用IOOmL冰預(yù)冷無菌水重懸菌體細(xì)胞。d)于4°C，1500Xg離心5min收集菌體細(xì)胞，再用8mL冰預(yù)冷的無菌的lmol/L山 梨醇重懸菌體細(xì)胞。e)于4°C，1500 X g離心5min收集菌體細(xì)胞，再用2mL冰預(yù)冷的無菌的lmol/L山 梨醇重懸菌體細(xì)胞。置于冰上備用。也可將此感受態(tài)細(xì)胞分裝80 μ L于1. 5mL微離心管中 凍存?zhèn)溆?，但其轉(zhuǎn)化效率將明顯下降。3、重組表達(dá)載體的線性化通過對(duì)nisin-rbLF-N基因和pPIC9K載體的酶切位點(diǎn)分析，采用SacI酶切線性化 重組質(zhì)粒pPIC9K/nisin-rbLF-N(37°C，5h)。凝膠回收純化。4、畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化在Bio-Rad Gene Pulse電轉(zhuǎn)儀上進(jìn)行電轉(zhuǎn)化反應(yīng)。電轉(zhuǎn)化條件為電壓1500V， 電容25 μ F，電阻200 Ω，轉(zhuǎn)化時(shí)間隨DNA樣品的不同而變化，并由儀器自動(dòng)給出，通常在 3. 5-4. Os范圍內(nèi)。(圖6)實(shí)施例6 nisin-rbLF-N基因在畢赤酵母GSl 15中的誘導(dǎo)表達(dá)1、將重組酵母凍存菌種接于YPD平板上活化，28°C培養(yǎng)2d，至長(zhǎng)出單菌落。2、挑取一活化的單菌落于200mL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30°C，250rpm搖床培養(yǎng)，
至培養(yǎng)基OD6tltl達(dá)到2. 0 6. 0。3、6000rpm離心5min收集菌體，用無菌超純水洗滌菌體1 2次。4、將菌體轉(zhuǎn)移至200mL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于30°C，200rpm搖床培養(yǎng)。5、每隔24h從BMMY培養(yǎng)基中取出ImL菌液于1. 5mL離心管中，同時(shí)補(bǔ)加甲醇至終 濃度為1% (v/v)，于8000rpm離心5min，取上清液，存于-20°C，待測(cè)。
實(shí)施例7 nisin-rbLF-N融合蛋白的鑒定收集到的上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳，nisin-rbLF-N基因全長(zhǎng)324bp，其編碼的融合 蛋白由108個(gè)氨基酸構(gòu)成，其N端23個(gè)氨基酸是前導(dǎo)肽，預(yù)計(jì)所編碼的融合蛋白約為10KD。 (圖7)實(shí)施例8去糖基化和酶裂解融合蛋白nisin-rbLF-N取80μ L凍干溶解后的上清液于小離心管中，加入90μ L變性緩沖液(0. 5% SDS， 1 %巰基乙醇)，煮沸IOmin后加入10 μ L GT反應(yīng)緩沖液(50mmPBS緩沖液，PH7. 5), 10 μ L 的10%NP-40，100U(0. 2yL)的PNGaseF，37°C水浴過夜。向去糖基化后的表達(dá)上清液中加 入0. 15w/v %胃蛋白酶，37°C酶解6h后于80°C滅酶活lOmin，6000 X g離心20min，取上清用 于活性檢測(cè)。實(shí)施例9融合蛋白nisin-rbLF-N抗菌活性的初步檢測(cè)對(duì)酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)4天，5000rpm條件下離心5min后分離菌體 和上清液，將IOml上清液置于凍干機(jī)中進(jìn)行凍干后溶于3ml無菌水中，-20°C保存。取去糖 基化并酶切后的上清液，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)抗菌活性，測(cè)試菌株為干酪乳桿菌(G+菌)和 大腸桿菌(G-菌)。抑菌活性檢測(cè)表明，nisin-rbLF-N融合蛋白具有革蘭氏陽性菌抗性和 革蘭氏陰性菌抗性。對(duì)照中，未誘導(dǎo)的以及轉(zhuǎn)入空載體的酵母發(fā)酵液中均未出現(xiàn)透明圈。表 明編碼融合蛋白nisin-rbLF-N的基因已成功整合于宿主基因組中，并開始表達(dá)目的蛋白。 (圖8和圖9)雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
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權(quán)利要求
一種融合基因，其含有編碼乳酸鏈球菌素的nisin基因和編碼牛乳鐵蛋白氨基末端多肽的rbLF N基因。
2.如權(quán)利要求1所述的融合基因，其具有SeqID No. 1所示的核苷酸序列或該序列經(jīng) 替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的具有編碼同等功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求1或2所述融合基因的載體。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，其出發(fā)載體為PPIC9K。
5.含有權(quán)利要求3或4所述載體的工程菌。
6.如權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于，其為畢赤酵母。
7.如權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于，其為畢赤酵母GS115。
8.構(gòu)建權(quán)利要求7所述工程菌的方法，其特征在于，包括如下步驟1)根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，設(shè)計(jì)并合成適于在BL21中表達(dá)的nisin基因，將優(yōu)化后的 nisin基因克隆于pMD19-T載體，以合成的pMD19-T/niSin質(zhì)粒為模板，用引物F1、R1進(jìn)行 PCR擴(kuò)增nisin基因，純化回收PCR產(chǎn)物；以從牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2 進(jìn)行PCR擴(kuò)增rbLF-N基因，純化回收PCR產(chǎn)物；以純化回收后的nisin基因和rbLF_N基因 為模板，用引物Fl、R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增nisin-rbLF-N融合基因，純化回收PCR產(chǎn)物；其中，F(xiàn)l :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3，；Rl :5’ -TTTGCTCACATGAATGCTGC-3’ ；F2 5' -GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3'；R2 :5’ -CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’ ；2)將步驟1)中合成的nisin-rbLF-N融合基因插入到載體pPIC9K中；3)將步驟2)的含有nisin-rbLF-N融合基因的pPIC9K載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母GSl15中，然 后進(jìn)行重組克隆的篩選，獲得重組畢赤酵母GS115工程菌，冷凍保存。
9.權(quán)利要求7所述工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，包括如下步驟1)將重組酵母凍存菌種接于YPD平板上活化，28°C培養(yǎng)2d，至長(zhǎng)出單菌落；2)挑取一活化的單菌落于200mLBMGY液體培養(yǎng)基中，于30°C，250rpm培養(yǎng)，直至培養(yǎng) 基的OD6tltl達(dá)到2. 0 6. 0 ；3)6000rpm離心5min收集菌體，用無菌水洗滌菌體1 2次；4)將菌體轉(zhuǎn)移至200mLBMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于28 30°C，200rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)1 2d。
10.如權(quán)利要求9所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟4)的誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為28°C， 誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為2d。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種Nisin-rbLF-N融合基因、含有該基因序列的表達(dá)載體，以及能夠高效表達(dá)Nisin-rbLF-N融合基因的重組畢赤酵母菌；另外，本發(fā)明還提供了所述重組畢赤酵母菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。本發(fā)明通過PCR方法，將融合基因Nisin-rbLF-N克隆到真核表達(dá)載體pPIC9K中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，能夠表達(dá)出可觀的融合蛋白。去糖基化后的融合蛋白經(jīng)過復(fù)合蛋白酶酶解，具有抑干酪乳桿菌(G+菌)和大腸桿菌(G-菌)的作用。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101974546SQ201010258798
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者王海峰, 田文瑩, 田洪濤, 羅云波, 袁曉宇, 許文濤, 黃昆侖 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)