專利名稱：：基于b7-2-pe40外毒素融合基因的dna疫苗及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組核酸構(gòu)建體，其含有與真核表達(dá)載體PCDNA3.l/Zeo(+)有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQIDN0:1)。本發(fā)明還涉及含有與真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQIDN0:1)組成的重組表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及所述重組核酸構(gòu)建體用于制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗的用途，以及包含本發(fā)明所述重組核酸構(gòu)建體的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步的還涉及治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括向受試者施用治療有效量的所述DNA疫苗。
背景技術(shù)：
：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是一種抗原驅(qū)動由CD4+CD28+Thl細(xì)胞介導(dǎo)的慢性全身性自身免疫性疾病，主要累及各關(guān)節(jié)，以滑膜及鄰近組織的炎性病變?yōu)橹饕卣鳌Ｔ摷膊〉念A(yù)后較差，80%的病人20年后關(guān)節(jié)變形殘疾，喪失勞動力。DNA疫苗是將攜帶抗原編碼基因的質(zhì)粒直接注人動物體內(nèi)，通過在動物細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白以誘導(dǎo)動物產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗具有如下優(yōu)點1、不必提取靶蛋白，不必在體外原核或真核表達(dá)，也不必對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化、加工；2、易操作性和穩(wěn)定性；3、外源基因在體內(nèi)存在時間長，不斷表達(dá)外源蛋白，可以持續(xù)給免疫系統(tǒng)提供刺激；4、能用各種投遞疫苗的方法；5、具有熱穩(wěn)定性；6、可規(guī)?；a(chǎn)；7、不僅能防病，還能有效治病。1993年Ulmer等[UlmerJB,etal.Science，1993，259(5102)1745-1749]首次報道了肌肉注射質(zhì)粒DNA可保護(hù)小鼠抵抗流感和瘧疾，標(biāo)志著DNA疫苗的誕生。它的出現(xiàn)代表了新的、具有潛力的疫苗發(fā)展途徑和研究方向，被譽為繼減毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗。在隨后的十多年里，DNA疫苗被不斷的完善和發(fā)展，由最初給動物注射重組質(zhì)粒DNA能引起外源蛋白在機體的表達(dá)，到所表達(dá)的外源蛋白能同時引起機體的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，再到該免疫反應(yīng)能保護(hù)機體免受相應(yīng)病源的致命性打擊。DNA疫苗在各種小動物疾病模型中取得的成功大大推動了其在臨床上的研究及應(yīng)用。盡管現(xiàn)有技術(shù)對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及基因治療和DNA疫苗等有了較詳盡的公開，但是，有關(guān)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗尤其是否可以通過誘導(dǎo)免疫耐受或/和免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞的策略采用基因治療性疫苗直接有效的治療，哪些類型的DNA疫苗可能有效預(yù)防或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，帶有B7-2-PE40外毒素融合基因的pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40重組核酸構(gòu)建體是否能夠在動物體內(nèi)有效表達(dá)、所表達(dá)的產(chǎn)物是否具有生物學(xué)功能、以及該重組核酸構(gòu)建體pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40是否可以直接作為有效預(yù)防或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疫苗，這些問題在現(xiàn)有技術(shù)中尚無任何教導(dǎo)。因此，提供一種可有效預(yù)防或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗仍是本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個方面，涉及一種重組核酸構(gòu)建體，其含有與真核表達(dá)載體pcDNA3.1/3Zeo(+)有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQIDN0:1)。本發(fā)明的又一方面，涉及包含本發(fā)明所述重組核酸構(gòu)建體的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗。本發(fā)明人在研究中令人意外地發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞的重組核酸構(gòu)建體pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾被分泌到胞外，pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40可在真核細(xì)胞中高效表達(dá)并且表達(dá)產(chǎn)物具有很好的靶向免疫抑制活性；發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗可以有效地預(yù)防和治療大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明基于這些發(fā)現(xiàn)而得以完成。因此，本發(fā)明提供的各個方面和特征概述如下本發(fā)明的一個方面涉及一種重組核酸構(gòu)建體，其含有與表達(dá)調(diào)控序列有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQIDNO1)。在本發(fā)明中，所述表達(dá)調(diào)控序列用于在真核宿主細(xì)胞中實現(xiàn)B7-2-PE40外毒素融合基因的有效表達(dá)。本發(fā)明中，所述表達(dá)調(diào)控序列選自CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白I。本發(fā)明的又一方面涉及一種重組表達(dá)載體，其含有與選自PCDNA3.1/Zeo(+),pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表達(dá)載體有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQIDN0:1)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述重組表達(dá)載體含有與真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因。本發(fā)明的另一方面，涉及所述重組核酸構(gòu)建體用于制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗的用途。本發(fā)明的再一方面，涉及一種預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗，其包含與表達(dá)調(diào)控序列有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因。在本發(fā)明中，所述表達(dá)調(diào)控序列用于在真核宿主細(xì)胞中實現(xiàn)B7-2-PE40外毒素融合基因的有效表達(dá)。本發(fā)明的又一方面，涉及一種預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗，其包含一種重組表達(dá)載體，其含有與選自pcDNA3.1/Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表達(dá)載體有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述DNA疫苗中所包含的重組表達(dá)載體，其含有與真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因。在本發(fā)明中，所述的DNA疫苗還可以包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的免疫佐劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述DNA疫苗用于以注射、粘膜、基因槍導(dǎo)入等方式實施免疫；優(yōu)選的，其用于以至少一種選自靜脈注射、動脈注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射和腹腔內(nèi)注射的方式實施免疫。在本發(fā)明的又一實施方案中，所述DNA疫苗為可經(jīng)由注射或可經(jīng)由粘膜施用的水溶液劑或復(fù)溶用凍干粉針劑。本發(fā)明的又一方面，提供一種制備DNA疫苗的方法，其包括將包含SEQIDN0:1所示DNA序列的B7-2-PE40外毒素融合基因與pcDNA3.1/Zeo(+)載體共同構(gòu)建的步驟。根據(jù)本發(fā)明所述制備DNA疫苗的方法，其包括以下步驟1)分別設(shè)計含有信號肽及Kpnl酶切位點的上游引物P1，及含有確Xbal酶切位點的下游引物P2，其中所述引物的序列如下上游弓丨物P15，-CGGGGTACCTGTTATGGATGGACTGAGTAACATTCTCTTTGTGATGGCCTTCCTGCTCTCTGGTGCTGCTCCTCTGAAGATTCAAG-3，(SEQIDNO2)[其中，加單下劃線的為Kpnl酶切位點；加雙下劃線的為起始密碼子及信號肽編碼序列]下游引物P2:5’-GCTCTAGATTACTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTG-3’(SEQIDN03)[其中，加單下劃線的為XbaI酶切位點]；2)以原核表達(dá)載體PRSETA-B7-2-PE40KDEL質(zhì)粒為模板，采用高保真的PfuDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，并用KpnI+Xbal雙酶切上述回收產(chǎn)物及pcDNA3.1/Zeo(+)載體，電泳后回收酶切產(chǎn)物；4)回收酶切產(chǎn)物；5)將雙酶切后的PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1/Zeo⑴載體連接；6)挑取具有Amp抗性的陽性菌落，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，菌株凍存；和7)培養(yǎng)菌株，提取并純化DNA疫苗治療用質(zhì)粒，以及任選地，8)將所獲得的質(zhì)粒與醫(yī)藥學(xué)上可接受的免疫佐劑混合。本發(fā)明的又一方面，提供一種在有需要的哺乳動物中預(yù)防和/或治療自身免疫性疾病特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其包括向所述哺乳動物施用預(yù)防和/或治療有效量的本發(fā)明所述DNA疫苗，所述的DNA疫苗包含一種重組核酸構(gòu)建體，其包含與表達(dá)調(diào)控序列有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQIDNO1)的；或者含有重組表達(dá)載體，其與選自pcDNA3.1/Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表達(dá)載體有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因。B7-2-PE40測定序列及開放閱讀框架(SEQIDNO1)分析如下1gctagcgtttaacttaagcttggtacctgttKpnl酶切位點32atggatggactgagtaacattctctttgtgatggccttcctgctc起始密碼子和信號肽M|DGi.SNILFVMAFLL77tctggtgctgctcctctgaagattcaagcttatttcaatgagact|Sf.AA1LKIQAYFNET122gcaggcctgccgtgccaatttgcaaactctcaaaaccaaagcctgAG*LPCQFANSQNQSL167agtgagctagtagtattttggcaggaccaggaaaacttggttctgSELVVFWQDQENLVL212aatgaggtatacttaggcaaagagaaatttgacagtgttcattccNEVYLGKEKFDSVHS257aagtatatgggccgcacaagttttgattcggacagttggaccctgKYMGRTSFDSDSffTL302agacttcacaatcttcagatcaaggacaagggcttgtatcaatgtRLHNLQIKDKGLYQC347atcatccatcacaaaaagcccacaggaatgattcgcatccaccagIIHHKKPTGMIRIHQ392atgaattctgaactgtcagtgcttgctaacttcagtcaacctgaaMNSELSVLANFSQPE437atagtaccaatttctaatataacagaaaatgtgtacataaatttgIVPISNITENVYINL482acctgctcatctatacgcggttacccagaacctaagaagatgagtTCSSIRGYPEPKKMS527gttttgctaagaaccaagaattcaactatcgagtatgatggtattVLLRTKNSTIEYDGI572atgcagaaatctcaagataatgtcacagaactgtacgacgtttccMQKSQDNVTELYDVS617atcagcttgtctgtttcattccctgatgttgcgagcaatatgaccISLSVSFPDVASNMT662atcttctgtattctggaaactgacaagacgcggcttttatcttcaIFCILETDKTRLLSS707cctttctctatagagcttgaggaccctcagcctcccccagaccagPFSIELEDPQPPPDQ752attcctggtggcggcggatctggaggcggtggaagcggtggcggtIPGGGGSGGGGSGGG797ggctcgggcggtggtgggtcgggcggcagcctggccgcgctgaccGSGGGGSGGSLAALT842gcgcaccaggcttgccacctgccgctggagacttccacccgtcatAHQACHLPLETS*TRH887cgccagccgcgcggctgggaacaactggagcagtgcggctatccgRQPRGWEQLEQCGYP932gtgcagcggctggtcgccctctacctggcggcgcggctgtcgtggVQRLVALYLAARLSff977aaccaggtcgaccaggtgatccgcaacgccctggccagccccggcNQVDQVIRNALASPG1022agcggcggcgacctgggcgaagcgatccgcgagcagccggagcagSGGDLGEAIREQPEQ1067gcccgtcttgccctgaccctggccgccgccgagagcgagcgcttcARLALTLAAAESERF1112gtccggcagggcaccggcaacgacgaggccggcgcggccaacgccVRQGTGNDEAGAANA1157gacgtggtgagcctgacctgcccggtcgccgccggtgaatgcgcgDVVSLTCPVAAGECA1202ggcccggcggacagcggctacgccctgctggagcgcaactatccc6GPADSGYALLERNYP1247actggcgcggagttcctcggcgacggcggcgacgtcagcttcagcTGAEFLGDGGDVSFS1292acccgcggcacgcagaactggacggtggagcggctgctccaggcgTRGTQNWTVERLLQA1337caccgccaactggaggagcgcggctatgtgttcgtcggctaccacHRQLEERGYVFVGYH1382ggcaccttcctcgaagcggcgcaaagcatcgtcttcggcggggtgGTFLEAAQSIVFGGV1427cgcgcgcgcaaccaggacctcgacgcgatctggcgcggtttctatRARNQDLDAIffRGFY1472atcgccggcgatccggcgctggcctacggctacgcccaggaccagIAGDPALAYGYAQDQ1517gaacccgacgcacgcggccggatccgcaacggtgccctgctgcggEPDARGRIRNGALLR1562gtctatgtgccgcgctcgagcctgccgggcttctaccgcaccagcVYVPRSSLPGFYRTS1607ctgaccctggccgcgccggaggcggcgggcgaggtcgaacggctgLTLAAPEAAGEVERL1652atcggccatccgctgccgctgcgcctggacgccatcaccggccccIGHPLPLRLDAITGP1697gaggaggaaggcgggcgcctggagaccattctcggctggccgctgEEEGGRLETILGWPL1742gccgagcgcaccgtggtgattccctcggcgatccccaccgacccgAERTVVIPSAIPTDP1787cgcaacgtcggcggcgacctcgacccgtccagcatccccgacaagRNVGGDLDPSSIPDK1832gaacaggcgatcagcgccctgccggactacgccagccagcccggcEQAISALPDYASQPG1877aaaccgccgcgcgaggacctgaagtaatctagaggcccgtaacKPPREDLK*終止密碼子和Xbal酶切位點下面進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。用于本文的術(shù)語“哺乳動物”是指可能罹患、即將罹患、或己經(jīng)罹患本發(fā)明所述自身免疫性疾病的受試者，其包括但不限于豬、狗、貓、牛、羊等家畜和人類。優(yōu)選地，所述的哺乳動物是人類。用于本文的術(shù)語“預(yù)防”是指所述哺乳動物處于可能發(fā)生、即將發(fā)生所述自身免疫性疾病的情況下使用本發(fā)明的DNA疫苗預(yù)防該自身免疫性疾病的發(fā)生。用于本文的術(shù)語“治療”是指所述哺乳動物已經(jīng)罹患或已經(jīng)發(fā)生所述自身免疫性疾病的情況下使用本發(fā)明的DNA疫苗，使該自身免疫性疾病減輕、緩解、延緩、阻止、消除或治愈等。本發(fā)明的DNA疫苗可以是可經(jīng)由注射或可經(jīng)由粘膜施用的水溶液劑或復(fù)溶用凍干粉針劑。優(yōu)選的，所述的水溶液劑或復(fù)溶用凍干粉針劑是通過本領(lǐng)域公知的無菌操作工藝制備的；并且還優(yōu)選的，它們在貯藏、運輸、使用過程中均呈無菌狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明，所述的藥物組合物可以是本領(lǐng)域公知的任何可用于給藥的藥物形式，包括藥物組合物、藥物制劑、藥盒等。雖然本發(fā)明所述用途中涉及的DNA疫苗可以經(jīng)注射、粘膜等途徑施用，并且這些施用方式也是本發(fā)明的一部分。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，適合于本發(fā)明所述用途的最優(yōu)選施用途徑是胃腸外途徑或經(jīng)注射方式施用。對于本發(fā)明的實施而言，所述的藥物組合物優(yōu)選是用于胃腸外給藥的制劑，包括但不限于局部注射用制劑和全身注射用制劑，具體劑型包括但不限于注射用溶液劑和注射用粉針劑。更優(yōu)選的，所述的藥物是無菌的注射用含水溶液劑，或者是無菌的用于臨床使用前用注射用水復(fù)溶配制的粉針劑，特別是冷凍干燥粉針劑。在制成冷凍干燥粉針劑時，其中還可以含有醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如甘露醇。本發(fā)明的DNA疫苗可以通過本領(lǐng)域公知的方法導(dǎo)入生物體內(nèi)。所述的導(dǎo)入方法包括，但不限于，肌肉注射、基因槍導(dǎo)入法、③黏膜免疫、靜脈注射法、腹腔注射法等，更詳細(xì)的可以參考AlparH0，etal.ExpertOpinDrugDeliv，2005，2:829_842所公開的，該文獻(xiàn)以其整體內(nèi)容通過引用并入本文。另外，根據(jù)下文中提供的研究結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定在其它哺乳動物中使用時有效劑量，特別是用于人時的有效劑量。可以將一天的劑量在一天中一次性全部給與受試者，也可以在一天內(nèi)將需要的劑量分成兩個、三個、四個或更多個小劑量以合適的間隔施用。所述小劑量可以配制成單元劑量形式，例如每個單元劑量形式含有日總劑量細(xì)分適宜次數(shù)的相應(yīng)量。當(dāng)然，也可以以一定的時間周期施用，例如一天施用一次、兩天施用一次、一周施用一次、一月施用一次、二月施用一次、三月施用一次、六月施用一次、一年施用一次、兩年施用一次等。本發(fā)明所述的DNA疫苗或藥物組合物在用于具體的臨床案例時，它們的具體使用量可因多種因素而可能需要作相應(yīng)的變化，這些因素包括但不限于受試者病況的嚴(yán)重程度，受試者的年齡、性別、體重，施用途徑，藥物劑型等等。本文提及的參考文獻(xiàn)、專利說明書、專利申請說明書等，均可以作為本申請的參考，并且以其整體內(nèi)容通過引用并入本文。根據(jù)本發(fā)明，可有效地將含有pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗用于預(yù)防或治療自身免疫性疾病特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。詞語解釋本發(fā)明涉及的部分縮略詞及其中英文對照如下英文縮寫英文全稱中文譯名CIAcollageninducedarthritis膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>圖1是真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40構(gòu)建示意圖，其中S為信號肽序列，圖IA是pcDNA3.1/Zeo(+)真核表達(dá)載體圖譜。圖2是瓊脂糖電泳分析經(jīng)PCR擴(kuò)增B7-2-PE40的結(jié)果。其中1為DNA標(biāo)志物，2為B7-2-PE40PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3是瓊脂糖電泳分析KpnI+Xbal雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40結(jié)果。其中1為DNA標(biāo)志物，2為KpnI+Xbal雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40。圖4是轉(zhuǎn)染CH0-K1-RPE.40細(xì)胞后RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析。其中A:B7-2-PE40PCR擴(kuò)增結(jié)果；Bβ-actinPCR擴(kuò)增結(jié)果。其中1是DNA標(biāo)志物，2是轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40KDEL的CH0-K1-RPE.40細(xì)胞；3是轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Zeo(+)空載體的CH0-K1-RPE.40細(xì)胞；4為中國倉鼠卵巢細(xì)胞抗綠膿桿菌外毒素細(xì)胞株。圖5是WesternBlot檢測B7_2_PE40融合蛋白在真核細(xì)胞中的分泌表達(dá)的結(jié)果。圖6是經(jīng)Zeo篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CH0-K1-RPE.40細(xì)胞株的RT-PCR驗證結(jié)果。其中8、10、12、13、14、15、16、20、21、22、28為陽性克隆，陽性率37%圖7是真核表達(dá)產(chǎn)物B7-2-PE40的選擇性細(xì)胞抑制活性比較結(jié)果。圖8是瓊脂糖電泳分析pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒肌肉注射后體內(nèi)表達(dá)結(jié)^ο圖9顯示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗肌肉注射后體內(nèi)⑶28+T細(xì)胞清除狀況。圖10顯示預(yù)防性給予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗對CIA大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹程度的影響。圖11顯示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療對CIA大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹程度的影響。圖12顯示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療對CIA大鼠外周血⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞的影響。圖13是采用流式細(xì)胞儀分析外周血⑶4+CD25+Treg細(xì)胞比例的部分代表圖。圖14顯示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療對CIA大鼠外周血⑶8+⑶28_Ts細(xì)胞的影響。圖15是采用流式細(xì)胞儀分析外周血⑶8+CD28—TS細(xì)胞比例的部分代表圖。圖16顯示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療對CIA大鼠外周血CD28+T細(xì)胞的影響。圖17是采用流式細(xì)胞儀分析外周血⑶28+T細(xì)胞比例的部分代表圖。圖18顯示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療對Thl/Th2細(xì)胞比例的影響。圖19顯示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療對Thl/Th2比值的影響。圖20顯示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療對CD4/⑶8比值的影響。具體實施例方式下面通過具體的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實施例僅僅是用于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。本部分對本發(fā)明試驗中所使用到的材料以及試驗方法進(jìn)行一般性的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。實施例1:dcDNA3.l/Zeo(+)-B7-2_PE40外毒素融合基因的DNA疫苗真核表汰載體的構(gòu)津與鑒定。1.材料與方法1.1.質(zhì)粒、細(xì)胞及主要試劑pRSETA-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE原核表達(dá)載體由本室構(gòu)建。表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)、Zeocin、Trizol及Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。Jurkat和Raji細(xì)胞系購自美國ATCC(美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)。CH0-K1-RPE.40細(xì)胞系(中國倉鼠卵巢細(xì)胞抗綠膿桿菌外毒素細(xì)胞株)亦購自美國ATCC；PEA多抗、CD86單抗及TMB底物顯色液購自Sigma公司。PVDF膜與AmiconUltra-4購自Millipore公司。ECL購自Pierce公司。MTS(CellTiter96AQueousOneSolutionCellProliferationAssay)及PureYieiIdplasmidmidipr印system購自Promega公司。KpnI酶、XbaI酶及T4連接酶購自TaKaRa公司。2XPfuPCRMasterMix購自TIANGEN公司。QIAquickGelExtractionKit購自QIAGEN公司。1.2.主要儀器9700PCR儀(PerkinElmer)，Du640紫外檢測儀(Beckman)，MiniII型蛋白電泳儀及蛋白半干電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)，Gel-Pro3.1凝膠成像系統(tǒng)(MediaCybernetic)。1.3.真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40的構(gòu)建分別設(shè)計含有信號肽及KpnI酶切位點的上游引物P1，及含有XbaI酶切位點的下游引物P2。引物序列如下上游弓丨物P15，-CGGGGTACCTGTTATQGATGGArTGAGTAACATTCTCTTTGTGATGGCCTTr:CTGCTC:TC:TGGTrTnrrTnrrTTnrrTAArTATT「AAr「:V(SEQIDNO2)[其中，加單下劃線的為KpnI酶切位點；加雙下劃線的為起始密碼子及信號肽編碼序列]下游引物P2:5，-GCTCTAGATTACTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTG-3，(SEQIDNO3)[其中，加單下劃線的為XbaI酶切位點]以原核表達(dá)載體pRSETA-B7-2-PE40KDEL質(zhì)粒為模板，采用高保真的PfuDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>PCR反應(yīng)條件如下96°C預(yù)變性5min，96°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸3min，30個循環(huán)，后72°C延伸lOmin。瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，并用KpnI+Xbal雙酶切上述回收產(chǎn)物及pcDNA3.1/Zeo(+)載體，電泳后回收酶切產(chǎn)物。酶切體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>混勻后37°C水浴3h。將酶切產(chǎn)物按如下步驟回收1)用干凈刀片將目的條帶從瓊脂糖凝膠上切下放入1.5mlEp管中。2)稱量凝膠的重量，按IOOmg的凝膠加300μ1的緩沖劑QG加入相應(yīng)體積的溶膠液。3)50°C水浴孵育IOmin直至膠完全溶解，其間每2-3min上下顛倒以徹底混勻。膠完全溶解后，顏色應(yīng)變?yōu)辄S色。4)加入1倍體積的異丙醇，充分混勻。5)將樣品加入QIAquick柱，離心lmin。棄掉廢液，加0.5ml緩沖劑QG，離心lmin。6)棄掉廢液。加0.75ml的緩沖劑PE，放置2min_5min，離心lmin。7)棄掉廢液，離心lmin。后將柱放于1.5ml的干凈Ep管中。8)將30μ1注射用水加入柱膜中央，放置Imin后離心Imin收集洗脫液。將雙酶切后的PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1/Zeo(+)載體連接，體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>雙酶切pcDNA3.1/Zeo(+)3μ1ddH203μ,總體積20μ1將連接管至于4°C冰水混合物中連接過夜。將連接產(chǎn)物按如下方法轉(zhuǎn)化入T0P10感受態(tài)菌中。具體操作如下1)將連接產(chǎn)物10μ1、試劑A20μ1用無菌水稀釋至100μ1，冰上備用。2)冰上融化入Τ0Ρ10感受態(tài)菌(5min)，加入上述稀釋備用質(zhì)粒。3)冰上放置15min，后37°C放置Imin。鋪板，37°C過夜。挑取具有Amp抗性的陽性菌落，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定(條件同前)，陽性者送TaKaRa公司測序確認(rèn)。將鑒定序列正確的菌株凍存并大量培養(yǎng)，采用PureYieild質(zhì)粒中提試劑盒大規(guī)模提取并純化DNA疫苗治療用質(zhì)粒。提純的質(zhì)粒溶解于生理鹽水中，260/280彡1.80.濃度>1.0μg/μ1。1.4.重組質(zhì)粒dcDNA3.1/Ζθο(+)-B7-2-PE40在CHO-Kl-RPE.40細(xì)胞中的瞬時表汰采用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，將0.5X105-2XIO5CHO-KI-RPE.40細(xì)胞傳入24孔板(培養(yǎng)基為DMEM/F12，7.5%FBS,1X非必需氨基酸)，培養(yǎng)基0.5ml。0.8μg質(zhì)粒和2.0μ1Lipofectamine2000分別用50μIOPTI-MEMI培養(yǎng)基稀釋，兩者混合孵育20min，緩慢加入24孔板中。37°C、5%C02孵育6h后，更換為完全DMEM培養(yǎng)基。48h后收集培養(yǎng)細(xì)胞及上清，采用RT-PCR及Western印跡進(jìn)行檢測。1.5.RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中B7-2-PE40外毒素融合蛋白的mRNA轉(zhuǎn)染48h后，將生長的CH0-K1-RPE.40細(xì)胞用PBS清洗兩次，參照說明書用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，分別用上述引物PI、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并采用β-actin作為參比對照。反轉(zhuǎn)錄體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>反應(yīng)條件為42°C30min，99°C5min，5°C5min。PCR反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>反應(yīng)條件如下96°C預(yù)變性5min，96°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸3min，30個循環(huán)，后72°C延伸IOmin。瓊脂糖凝膠電泳鑒定。人β-actin引物序列為上游引物P5:5，AGAAAATCTGGCACCACACC3，(SEQIDNO4)下游引物P6:5，AGCACTGTGTTGGCGTACAG3，(SEQIDNO5)1.6.Western印跡檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞B7_2_PE40外毒素融合蛋白的表汰1)蛋白電泳轉(zhuǎn)染CH0-K1-RPE.40細(xì)胞48h后，收集培養(yǎng)上清并利用AmiconUltra-4將其濃縮。取15μ1樣品與15μ1XSDSLoading緩沖劑混勻，煮沸5min，行SDS-PAGE蛋白電泳，80V電壓電泳至蛋白泳出積層膠，后行160V電泳至分離膠底部，斷開電源。2)轉(zhuǎn)膜電轉(zhuǎn)至PVDF膜。PVDF膜選用Immobilon-P。在甲醇浸泡15s，水中泡2min,電轉(zhuǎn)液中泡20min，同時將濾紙及膠泡電轉(zhuǎn)液15min，按+(白色)/三層濾紙/膜/膠/三層濾紙/黑色。轉(zhuǎn)膜條件60mA40min。3)使用封閉液室溫封閉2h；4)加入以適當(dāng)比例用封閉液稀釋的一抗，PEA多抗或⑶86單抗4°C過液；5)TBST洗滌3次，每次5min；6)加入以適當(dāng)比例用封閉液稀釋的HRP-抗兔或小鼠IgG二抗，室溫孵育Ih；7)TBST洗滌3次，每次IOmin；8)采用ECL方法曝光顯影、定影。以上步驟1)的蛋白電泳配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1.7.重組質(zhì)粒dcDNA3.1/ΖΘΟ(+)-B7-2-PE40穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO-Kl-RPE.40細(xì)胞采用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，具體操作同1.4。轉(zhuǎn)染24h后，110稀釋轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按700μg/ml濃度加入Zeocin，每隔3d換液一次，待抗性克隆逐漸增大后將其轉(zhuǎn)至24孔板，長滿后傳至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，并擴(kuò)增多瓶。用RT-PCR方法進(jìn)行鑒定，將陽性產(chǎn)物凍存?zhèn)溆谩?.8.ELISA檢測丨穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)朐B7-2-PE40外毒素融合蛋白表汰量1)收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的24h培養(yǎng)上清并濃縮，濃縮方法同前。2)取10μ1濃縮液按110稀釋后包被96孔板過夜，每孔100μ1，每組樣品設(shè)3個平行孔。3)封閉液封閉Ih。4)加入抗PEA多抗37°C孵育Ih。5)用PBST洗板3次。6)力卩HRP-抗兔IgG37°C孵育Ih。7)PBST洗板3次。8)加入顯色液TMB，15min后用2mol/L的H2SO4中止，測450nm吸光度值并計算相應(yīng)濃度。以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白對照。采用PEA作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[參考何婕等，生物工程學(xué)報，2006，22(3):378-383]。1.9.真核表達(dá)產(chǎn)物B7-2-PE40外毒素融合蛋白的選擇性細(xì)胞毒作用檢測將高表達(dá)CD28的人淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat、鑒定陽性的pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CH0-K1-RPE.40細(xì)胞以2X105/ml濃度共培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，于37°C、5%CO2培養(yǎng)條件下孵育48h，加入20μ1MTS，Ih后測定490nm吸光度值計算細(xì)胞毒活性。以低表達(dá)⑶28的人Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞系Raji作為陰性對照。細(xì)胞死亡率按如下公式計算細(xì)胞死亡率=(1-穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CH0-K1-RPE.40細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)孔中的存活細(xì)胞/未轉(zhuǎn)染的CH0-K1-RPE.40細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)孔中的存活細(xì)胞)X100%2.結(jié)果2.1.pcDNA3.l/Zeo(+)-B7-2-PE40真核表達(dá)載體的構(gòu)建為使B7-2-PE40外毒素融合基因可在真核細(xì)胞中表達(dá)，一個含有B7_2_PE40以及Zeo抗性基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40按圖1所示構(gòu)建(其中真核表達(dá)載體圖見圖1A)。用所設(shè)計的PCR引物擴(kuò)增人B7-2-PE40，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見預(yù)期大小為1919bp的特異性條帶(見圖2)。將雙酶切回收后產(chǎn)物克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)的KpnI和XbaI酶切位點，構(gòu)建成pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40重組質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒提取、雙酶切后電泳(見圖3)，得到陽性克隆。測序顯示信號肽之后的堿基序列沒有發(fā)生點突變和移碼突變，與原核表達(dá)質(zhì)粒PRSETA-B7-2-PE40KDEL中的基因序列完全一致，與人B7-2以及PE40蛋白一、二級結(jié)構(gòu)比對結(jié)果見表1。表1、B7-2-PE40外毒素融合蛋白與B7_2及PE40蛋白一、二級結(jié)構(gòu)的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2.2.B7-2-PE40夕卜毒素融合蛋白在直核細(xì)胞,中的表汰輪測丨將測序鑒定正確的pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40真核表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染CH0-K1-RPE.40細(xì)胞，分別采用以下方法檢測了B7-2-PE40外毒素融合蛋白的表達(dá)首先用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中B7-2-PE40mRNA的合成，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40的CH0-K1-RPE.40細(xì)胞在1919bp處可見特異性條帶，而轉(zhuǎn)染空載體的CHO-K1-RPE.40細(xì)胞未出現(xiàn)此條帶。而兩種細(xì)胞中均有看家基因β-actin的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖4)。采用Western印跡方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清B7-2-PE40外毒素融合蛋白的抗原性及分泌表達(dá)情況。結(jié)果表明無論采用PEA多克隆抗體還是采用CD86單克隆抗體，均在相對分子質(zhì)量約90XIO3處有陽性條帶，而空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清無任何條帶顯示，結(jié)果見圖52.3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選及B7-2-PE4O夕卜毒素融合蛋白的表汰輪測丨在所篩選獲得的29個克隆中，經(jīng)RT-PCR驗證，11個為陽性，擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存(見圖6)。為檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞B7-2-PE40表達(dá)分泌量，取數(shù)個陽性克隆的上清，或已知濃度的PEA作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用ELISA方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)直線(見表2)。將待測上清的OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較獲得各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆的分泌量，具體結(jié)果見表3。其余穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株未檢測。結(jié)果表明1XIO6個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h約表達(dá)0.23μg/L的B7-2-PE40外毒素融合蛋白。表2、不同濃度PEA標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA檢測值<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>以PEA濃度為橫坐標(biāo)，OD450為縱坐標(biāo)，發(fā)現(xiàn)PEA濃度在0.1-5μg/L時，PEA的濃度的對數(shù)與OD45tl呈直線關(guān)系，其直線方程式為Y=1.52+1.334Χ，其中X為PEA標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度的對數(shù)值，Y為OD45tl吸光度值。表3、Β7-2-ΡΕ40外毒素融合蛋白表達(dá)水平檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>2.4.B7-2-PE40真核表達(dá)產(chǎn)物的選擇性細(xì)胞毒性作用利用高表達(dá)CD28的人淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat檢測真核表達(dá)產(chǎn)物B7-2-PE40的細(xì)胞毒抑制活性，并以低表達(dá)⑶28的人Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞系Raji作為陰性對照。MTT檢測結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞共孵育48h后測得的OD值為1.013，未轉(zhuǎn)染組為1.318；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與Raji細(xì)胞共孵育后測得的OD值為1.671，未轉(zhuǎn)染組為1.633。根據(jù)公式計算獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞對Jurkat細(xì)胞的殺傷率為92.87%，抑制率顯著高于對Raji細(xì)胞的19.14%，證實真核表達(dá)產(chǎn)物B7-2-PE40對⑶28陽性細(xì)胞具有很好的選擇性抑制效應(yīng)(見圖7)。實施例2:pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗防治大鼠類風(fēng)濕件關(guān)節(jié)炎療效觀察。1.材料與方法1.1.質(zhì)粒、細(xì)胞、主要試劑pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40真核表達(dá)載體由本研究室構(gòu)建。天然雞II型膠原(CCII)、完全弗氏佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)及PEA多克隆抗體購自Sigma公司。FITC-anti-ratCD3、PE-anti_ratCD28和Pharmlyse購自BD公司。注射用氨甲喋呤購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。1.2.主要儀器WJ2002活體基因?qū)雰x(ScientzBiotechnology)，550全自動酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)。1.3.II型膠原蛋白$秀導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎樽型(CIA)的歲立實驗動物為4-6周齡Wistar雌性大鼠。參照文獻(xiàn)[RosloniecEF，etal.Collagen-inducedarthritis.In:CocoR,ShevachΕ,editors,Currentprotocolsinimmunology,NewYork:ffiley&Sons,1997,1-24]的方法，將天然雞II型膠原(CCII,Sigma公司)用0.lmol/L的冰醋酸溶解后，配成5mg/ml的溶液，加等體積完全弗氏佐劑CFA(Sigma公司)，使其終濃度為2.5mg/ml。以1.Oml/只在右后足跖皮內(nèi)、尾根部及背部多點注射，一周后腹腔注射0.5ml/只加強免疫一次，誘導(dǎo)CIA。1.4.CIA的治療方案大鼠于初次免疫后在第9天發(fā)病，于第12日開始治療。實驗分為六組，分別為(l)pcDNA3.l/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒150μg/只治療組；(2)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒200μg/只治療組；(3)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒300μg/只治療組。(4)MTX治療組；(5)空載體注射組；(6)CIA對照組?？蛰d體和治療載體均溶解在生理鹽水中，采取肌肉注射結(jié)合電脈沖刺激(200V/cm，20ms，2Hz，8脈沖)的方法[MirLM,etal.ProcNatlAcadSciUSA,1999,96:4262_4267]。MTX的給藥方式為0.75mg/kg，每周肌肉注射一次，連續(xù)給予4周。1.5.CIA的預(yù)防方案在用雞II型膠原誘導(dǎo)免疫的同時預(yù)防性地給予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒及MTX，治療劑量及途徑同上，共五組(1)空載體注射組；(2)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒200μg/只治療組；(3)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒300μg/只治療組。(4)MTX治療組。(5)CIA對照組。1.6.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗在體內(nèi)的表達(dá)檢測采用肌肉注射的方法，將150μg的pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40純化質(zhì)粒注射入Wistar大鼠右后肢股二頭肌內(nèi)，后給予電脈沖刺激(200V/Cm，20ms，2HZ，8脈沖)。在注射后第2d、4d、7d、14d、21d、28d及56d分取對側(cè)肌肉組織，利用Trizol提取RNA，利用RT-PCR方法檢測B7-2-PE40外毒素融合基因在體內(nèi)表達(dá)情況，以β-actin作為內(nèi)部參照。RNA的提取從液氮中取出保存組織，轉(zhuǎn)移至勻漿器，加入lmlTrizol，研磨使其充分裂解。室溫放置5min，在每mlTrizol中加入200μ1氯仿，振蕩混勻，放置分層后40C12000g離心15min。吸取上層水相至另一管中，加入500μ1異丙醇，混勻室溫放置IOmin后，4°C12000g離心lOmin，棄上清，RNA沉于管底，用75%乙醇清洗，4°C8000g離心5min,棄去上清，待管中乙醇完全揮發(fā)后，用適量DEPC水溶解RNA，紫外分光光度儀定量。逆轉(zhuǎn)錄條件如下<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>反應(yīng)條件為42°C30min，99°C5min，5°C5min。大鼠β-actin引物序列為上游引物P7:5，AGGCATCCTGACCCTGAAGTAC3，(SEQIDNO6)下游引物P8:5，TCTTCATGAGGTAGTCTGTCAG3，(SEQIDNO7)PCR反應(yīng)體系如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>反應(yīng)條件如下96°C預(yù)變性5min，96°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸3min，30個循環(huán)，后72°C延伸IOmin。瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1.7.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗體內(nèi)活性檢測在150μgpcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40純化質(zhì)粒注射后第2d、4d、7d、14d、21d、28d以及56d，將大鼠麻醉，心臟穿刺采血并用肝素抗凝。取100μ1抗凝血，加入FITC-anti-ratCD3及PE-anti-ratCD28各1μg，室溫避光孵育30min。加2mlPharmlyse紅細(xì)胞裂解液，室溫避光孵育15min。1500rpm離心5min，棄掉上清，用PBS重懸，1500rpm離心5min。棄掉上清，加入0.5ml2%多聚甲醛PBS，上機檢測。1.8.關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Al)CIA大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹程度按0-4級評分0分無紅腫；1分個別足趾輕度紅腫；2分大部分足趾關(guān)節(jié)及足趾紅腫；3分踝關(guān)節(jié)以下足爪嚴(yán)重紅腫；4分包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪紅腫。每一只大鼠的關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)為四肢關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)之和，最大可能為16分，AI>5分為造模成功。1.9.組織病理學(xué)檢杳雞II型膠原免疫誘導(dǎo)第35d后，按規(guī)定處死實驗大鼠，取左后足炎性踝及趾關(guān)節(jié)作標(biāo)本，以10%甲醛溶液固定、脫鈣、脫水、切片、HE染色，觀察炎性關(guān)節(jié)組織的病理改變。1.10.血清中抗CII型膠原抗體的檢測參考文獻(xiàn)[姚中強，等.中華微生物和免疫學(xué)雜志，2006，29(9):846_849]方法進(jìn)行。雞II型膠原注射4周后，從眶靜脈取血，離心分離血清后-20°c儲存?zhèn)溆?。本實驗采用ELISA方法，具體操作如下將CII(25mg/L)溶于0.2mol/L的PBS，按每孔100μ1包被，4°C過夜。待測血清1500稀釋后100μ1/孔37°C孵育2h，PBST洗三次，HRP酶標(biāo)兔抗大鼠IgG150000稀釋100μ1/孔37°C孵育lh，PBST洗六次后100μ1/孔TMB顯色液37°C避光孵育15πη，100μ1/孔2MH2SO4終止，450nm處測定吸光度值，并與已知CIA大鼠血清的稀釋度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，獲得相應(yīng)的濃度。1.11.血清中抗PEA抗體的檢測參考文獻(xiàn)[何婕，等.生物工程學(xué)報，2006，22(3)378-383]方法進(jìn)行。雞II型膠原免疫8周后，從眶靜脈取血，離心分離血清后-20°C儲存?zhèn)溆?。檢測采用ELISA方法將PEA(lmg/L)溶于包被液，按每孔100μ1包被，4°C過夜。待測血清1100稀釋后100μ1/孔37°C孵育2h，PBST洗三次，HRP酶標(biāo)兔抗大鼠IgG150000稀釋100μ1/孔37°C孵育lh,PBST洗六次后100μ1/孔TMB顯色液37°C孵育15min，100μ1/孔2ΜH2SO4終止，450nm處測定吸光度值。以兔抗PEA多克隆抗體作為陽性對照，以CIA對照組大鼠血清為陰性對照。1.12.統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，方差齊性時組間比較采用ANOVA分析，Dunnett-t檢驗，P<0.05為差異有顯著性；方差不齊時采用非參數(shù)統(tǒng)計。2.結(jié)果2.1.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗在體內(nèi)的表汰檢測RT-PCR分析結(jié)果見如圖8，其中顯示pcDNA3.1/Zeo(+)-B72-PE40質(zhì)粒在注射后2d、4d、7d、14d、21d及28d均可檢測出B7-2-PE40的mRNA，56天時基本檢測不到。與內(nèi)參β-actin相比，B7-2-PE40的表達(dá)在注射后14天最高，此后逐漸減弱。2.2.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗在體內(nèi)的活性檢測結(jié)果見圖9，顯示T細(xì)胞清除狀況與B7-2-PE40在體內(nèi)的表達(dá)變化一致。在pcDNA3.l/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒肌肉注射第2天，CD28+T細(xì)胞已被明顯殺傷，其比值低于正常及CIA對照大鼠。治療第4天時，⑶28+T細(xì)胞下降至最低，達(dá)34%。此后有短暫恢復(fù)。隨著B7-2-PE40在14天表達(dá)高峰的到來，在21天時再一次下降至低谷。后由于B7-2-PE40表達(dá)的降低，⑶28+T細(xì)胞所占比例逐漸增加，并于第56天時恢復(fù)至正常水平。2.3.CIA大鼠血清中抗PEA抗體水平檢測采用ELISA方法檢測PEA抗體水平，結(jié)果詳見表4和5。pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40治療及預(yù)防組CIA大鼠血清中的抗PEA抗體水平隨著質(zhì)粒劑量的增加而增高，但明顯低于陽性對照組(P<0.05)，與陰性對照即空載體治療組的抗PEA水平無統(tǒng)計學(xué)差異。表4、pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療八周后CIA大鼠血清中PEA抗體水平<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注表示與陽性對照相比，P<0.05表5、pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗預(yù)防八周后CIA大鼠血清中PEA抗體水平<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注表示與陽性對照相比，P<0.052.4.CIA大鼠誘導(dǎo)情況免疫后第7天造模組部分大鼠足趾表面發(fā)紅；第12天開始相繼出現(xiàn)足爪紅腫，至第18天出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫及軟組織腫脹，后足為著。前足關(guān)節(jié)炎發(fā)生率明顯低于后足，且出現(xiàn)時間比后足晚2-3天；第18-25天紅腫達(dá)高峰，隨之漸消退，關(guān)節(jié)屈曲，活動受限。其中治療組50只，40只符合造模成功的標(biāo)準(zhǔn)，成功率為80%。2.5.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗能有效預(yù)防CIA疾病的發(fā)牛在膠原免疫當(dāng)天預(yù)防性給予不同劑量pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒后，觀察了大鼠前后腳掌、腳踝及關(guān)節(jié)的變化(結(jié)果未附圖示)，并根據(jù)平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)繪制了臨床積分變化圖，結(jié)果見圖10。研究發(fā)現(xiàn)在膠原免疫的第一周中，各組均會出現(xiàn)微弱的關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)。隨著pcDNA3.l/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒的表達(dá)，預(yù)防各組的關(guān)節(jié)炎癥狀會逐漸消失。但在膠原免疫24天后，200μg及300μg預(yù)防組呈現(xiàn)了不同的預(yù)防效果。200μg預(yù)防組仍可很好的抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，減輕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，直至10周實驗結(jié)束后。但300μg預(yù)防組僅部分抑制了關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生，從第三周起，關(guān)節(jié)炎癥逐漸明顯。研究發(fā)現(xiàn)200yg預(yù)防效果與MTX組接近，遠(yuǎn)勝于300μg預(yù)防組?？蛰d體預(yù)防組無任何預(yù)防效果，其臨床積分類似于CIA對照組。2.6.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療對CIA大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹稈度的影響當(dāng)膠原免疫第12天出現(xiàn)足爪紅腫時，給予不同劑量的pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40真核表達(dá)質(zhì)粒，觀察pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40DNA疫苗治療對CIA大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹程度的影響，臨床評分結(jié)果見圖11。研究結(jié)果顯示pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40DNA疫苗在給予5天后即開始發(fā)揮作用，一直延續(xù)到第10周實驗結(jié)束后。200μg治療組及300μg治療組與MTX治療組的療效接近，均可明顯減輕四肢關(guān)節(jié)腫脹程度，降低疾病發(fā)生率；而150μg治療組的關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)略高于上述三組，但明顯低于空載體治療組及CIA對照組。與CIA對照組相比，空載體組對CIA大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹程度無任何治療作用，兩組的臨床評分基本接近。在300μg治療組大鼠膠原注射處可見潰瘍形成，且經(jīng)久不愈。2.7.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗對CIA大鼠后足組織病理學(xué)影響組織病理結(jié)果(未附圖)顯示CIA對照組滑膜細(xì)胞大量增生，炎性細(xì)胞廣泛浸潤，滑膜下層有纖維增生和新生血管形成，局部有壞死及肉芽腫形成，軟骨和骨的完整性遭到破壞。pcDNA3.1/Zeo(+)空載體對照組的結(jié)果類似。而經(jīng)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40預(yù)防及治療后的各組均有一定程度的改善滑膜增生減弱，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，少見纖維樣物質(zhì)沉積，基本看不到骨及軟骨的破壞。在治療各組中，MTX治療組病理改變最少，其次為200μg治療組；而預(yù)防各組中，200μg預(yù)防組病理表現(xiàn)優(yōu)于MTX預(yù)防組。300μg預(yù)防組病理表現(xiàn)類似于CIA對照組，可見炎性細(xì)胞浸潤，纖維增生，局部有壞死及肉芽腫形成。2.8.CIA大鼠血清中抗CII抗體水平檢測ELISA檢測結(jié)果見表6、7?？蛰d體治療組與CIA對照組的CII抗體水平基本接近，明顯高于正常對照。而經(jīng)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40基因治療后的各組抗CII抗體水平均有一定程度的降低，尤以200μg治療組下降最多，但其濃度仍低于MTX治療組，統(tǒng)計學(xué)分析顯示除MTX治療組外，其他各組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在預(yù)防各組中，200μg預(yù)防組的抗CII抗體水平明顯低于其它各組(P<0.05)，而MTX預(yù)防組和300μg預(yù)防組的抗CII抗體滴度略高于空載體預(yù)防組及CIA對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表6、膠原免疫四周后CIA大鼠血清中抗CII抗體的濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*表示與CIA對照組相比，P<0.05《請將表中英文譯成中文》表7、膠原免疫四周后CIA大鼠血清中抗CII抗體的濃度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40治療組1.77土0.29200pgpcDNA3.1(+)-B7-2-PE40治療組1.70±0.18300pgpcDNA3.1(+)-B7-2-PE40治療組1.81±0.12MTX治療組1.44±0.51*空載體治療組2.49±0.20CIA對照組2.31±0.34正常對照組_0.002±0.0006_*表示與CIA對照組相比，P<0.05實施例3:DCDNA3.1/Ζθο(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療大鼠類風(fēng)濕件關(guān)節(jié)炎的試駘1.材料和方法1.1.實驗動物Wistar雌性大鼠，4_6周齡，平均體重(180士15)g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，飼養(yǎng)條件為SPF級。1.2.藥品與試劑pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40真核表達(dá)載體由本研究構(gòu)建保存。天然雞II型膠原(CCII)、完全弗氏佐劑(CFA)及不完全弗氏佐劑(IFA)購自Sigma公司。注射用甲氨喋呤購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。FITC-anti-ratCD3、PE_anti_ratCD28、PerCP_anti_ratCD8、PE-anti-ratCD4、FITC-anti-ratCD25、PE_anti_ratIL_4、FITC-anti-ratIFN-γ、PE-Cy5-anti-ratCD4和Cytofix/CytopermTMPlus(withGolgistopTM)kit均購自BD公司。IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-a和TGF-βELISA試劑盒均購自R&D公司。IL-10ELISA試劑盒購自Biosource公司。1.3.II型膠原蛋白誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎樽型的建立參照文獻(xiàn)[MyersLK,etal.LifeSci，1997,611861]的方法，將天然雞II型膠原用0.lmol/L的冰醋酸溶解后，配成5mg/ml的溶液，加等體積完全弗氏佐劑CFA，使其終濃度為2.5mg/ml。以1.Oml/只在右后足跖皮內(nèi)、尾根部及背部多點注射，一周后腹腔注射0.5ml/只加強免疫一次，誘導(dǎo)CIA。注射100μ1生理鹽水/只大鼠作為正常對照組。1.4.pcDNA3.1/Zeo(+)-Β7-2-ΡΕ40外毒素融合基因的DNA疫苗防治方案pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療方案大鼠于初次誘導(dǎo)免疫后9天發(fā)病，于第12日開始進(jìn)行DNA疫苗治療。實驗每組五只，分為六組，分別為(l)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒150μg/只治療組；(2)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒200μg/只治療組；(3)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒300μg/只治療組。(4)MTX治療組；(5)CIA對照組；(6)正常對照組?？蛰d體和治療載體均溶解在生理鹽水中，采取肌肉注射結(jié)合電脈沖刺激(200V/Cm，20ms，2HZ，8脈沖)的方法。MTX具有很好的療效及安全性，并得到國際風(fēng)濕界的公認(rèn)。作為治療RA的金標(biāo)準(zhǔn)，MTX的給藥方式為0.75mg/kg，每周肌肉注射一次，連續(xù)給予四周。pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40的基因預(yù)防方案在膠原免疫的前一天預(yù)防性地給予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒及MTX，治療劑量及途徑同上，共五組(1)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒200μg/只預(yù)防組；(2)pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40質(zhì)粒300μg/只預(yù)防組；(3)MTX預(yù)防組；(4)CIA對照組；(5)正常對照組。1.5.CIA大鼠血清中細(xì)胞因子的檢測膠原初次免疫4周后，從尾靜脈取血，離心分離血清后采用雙抗夾心ELISA試劑盒分別檢測CIA大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-y、TNF-α及TGF-β的水平，每份標(biāo)本進(jìn)行雙復(fù)孔檢測。由于缺乏大鼠TGF-i3ELISA試劑盒，因人與大鼠TGFii同源性較高，故使用人TGF-βELISA試劑盒代替。Α、大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ及TGF-β的檢測方法如下1)從平衡至室溫的密封袋中取出所需板條。2)除空白孔外，分別將標(biāo)本(11稀釋)或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(ΙΟΟμΙ/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育90min。3)洗板4次。除空白孔外，加入生物素化抗體工作液(100μ1/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育60min。4)洗板4次。除空白孔外，加入酶結(jié)合工作液(100μ1/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育30min。5)洗板4次。加入顯色劑100μ1/孔，避光37°C孵箱孵育10-15min。6)加入終止液100μ1/孔，混勻后即刻測量OD45tl值(5分鐘內(nèi))。B、大鼠血清IL-10的檢測方法如下1)從平衡至室溫的密封袋中取出所需板條。2)除空白孔外，分別將標(biāo)本(11稀釋)或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(ΙΟΟμΙ/孔)加入相應(yīng)孔中；加入生物素化抗體工作液(50μ1/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育120min。充分混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，要使用微量振蕩器(最低頻率700rpm)。3)洗板4次。除空白孔外，加入酶結(jié)合工作液(100μ1/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育30min。使用微量振蕩器(最低頻率700rpm)。4)洗板4次。加入顯色劑100μ1/孔，避光3，室溫孵育10-15min。5)加入終止液100μ1/孔，混勻后即刻測量OD45tl值(5分鐘內(nèi))。C、結(jié)果判斷1)每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值。2)手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。3)若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。1.6.CIA大鼠外周血T細(xì)胞亞群分析膠原初次免疫后28d，抽取CIA及各組大鼠外周血并用肝素鈉抗凝，分別加ΛFITC-anti-ratCD3、PerCP-anti-ratCD8、PE_anti_ratCD28，PE-anti-ratCD4、FITC-anti-ratCD25單克隆抗體，用流式細(xì)胞儀檢測外周血CD3+CD28+T細(xì)胞、⑶3+CD8+C28_抑制性T細(xì)胞亞群(Ts細(xì)胞)、⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群(Treg細(xì)胞)的變化。檢測方法如下取100μ1抗凝血，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記抗體各1μg，室溫避光孵育30min。加2mlPharmlySeTM紅細(xì)胞裂解液，室溫避光孵育15min。1500rpm離心5min，棄掉上清，用PBS重懸，1500rpm離心5min。棄掉上清，加入0.5ml2%多聚甲醛PBS，上機檢測。1.7.CIA大鼠外周血Thl和Th2細(xì)胞亞群的檢測用IMDM培養(yǎng)基以11比例稀釋抗凝血500μ1，后加入150ng/mlPMA和1μg/ml離子霉素、0.7μ1Golgistop刺激5h。按200μ1/管加入2mlBDPharmLyse,室溫孵育lOmin，離心500g5min。用1XStaining緩沖劑清洗一次，加入PE-Cy5-anti_ratCD4室溫避光放置20min。加入500μ1BDCytofix/cytopermsolution，固定和穿透細(xì)胞，室溫避光鮮育20min，離心500g5min。力口2mlPerm/washsolution洗漆2次，力口入PE—anti—ratIL-4、FITC-anti-ratIFNγ、室溫下避光孵育30min。最后以500μ1PBS洗滌液重懸細(xì)胞。采用Cellquest軟件分析獲取的細(xì)胞，以前向角(FSC)和側(cè)向角(SSC)散射光散點圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以⑶4直方圖設(shè)門選取Th細(xì)胞(⑶4+)，&IFN-Y和IL-4的散點圖顯示Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞。1.8.統(tǒng)計學(xué)方法結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，方差齊性時組間比較采用ANOVA分析，Dunnett-t檢驗，P<0.05為差異有顯著性；方差不齊時采用非參數(shù)統(tǒng)計。2.結(jié)果2.1.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療后大鼠血清中細(xì)胞因子的變化膠原免疫后四周后采用ELISA方法檢測了實驗各組大鼠血清，檢測結(jié)果詳見表8、9。CIA大鼠中IL-2、TNF-α和IFN-γ水平明顯高于正常對照組(P<0.05)，而二者的TGF-β和IL-10無統(tǒng)計學(xué)差異。由于檢測方法的靈敏度，IL-4基本檢測不到。經(jīng)不同劑量的pcDNA3.1/Zeo(+)-Β7-2-ΡΕ40外毒素融合基因的DNA疫苗治療后大鼠血清中參與促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子如TNF-α及IFN-γ均有顯著下降(P<0.05)，IL-2的變化不大；參與抑制炎癥的細(xì)胞因子IL-10在200μg治療組有顯著提高(P<0.05)，而150μg及300μg治療組中雖有一定程度地提高，但與CIA對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。TGF-β的變化與IL-10的后兩組情況類似。MTX治療組的TNF-a、IFN-γ及IL-10水平較CIA對照組有顯著性變化(P<0.05)。pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗和MTX預(yù)防組均可明顯降低TNF-α和IFN-γ的水平(P<0.05)，MTX預(yù)防組的IL-10和IL-2較CIA對照組亦有明顯改變(P<0.05)。此外，300μg預(yù)防組中IL-10的水平也有顯著提高(P<0.05)。其余各組雖可一定程度的提高TGF-β以及IL-10的水平、降低IL-2的水平，但與CIA對照組之間無顯著性差異。表8、經(jīng)pcDNA3.1/Zeo(+)-B-7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗或MTX治療后大鼠血清中細(xì)胞因子的變化(η=5，1士s,pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>注表示與CIA對照組相比，P<0.05；t表示與正常對照相比，P<0.052.2.pcDNA3.!/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療后大鼠外周血T細(xì)胞亞群的奪化膠原免疫四周后采用流式細(xì)胞儀檢測了三種T細(xì)胞亞群，其結(jié)果及代表性流式圖譜詳見圖12-17。與正常大鼠相比，CIA大鼠外周血中⑶3+CD28+T細(xì)胞、Ts及Treg細(xì)胞亞群所比例均有顯著下降(P<0.05)。在pcDNA3.1/Zeo(+)_B7_2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗及MTX治療各組中，Treg細(xì)胞顯著提高(P<0.05)；Ts細(xì)胞亦有一定程度地提高，尤其在300μg治療組達(dá)11.26%士3.23%，明顯高于CIA對照組(P<0.05)。除200μg治療組外，CIA大鼠中⑶3+CD28+T細(xì)胞亞群下降的情況均得到改善，但無統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)預(yù)防性給予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗或MTX后，CIA大鼠CD28+T細(xì)胞亞群、Ts細(xì)胞亞群及Treg細(xì)胞亞群的變化與上述治療組結(jié)果一致。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析部分結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。2.3.pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療后大鼠外周血Thl/Th2、CD4/CD8細(xì)胞比例的變化采用流式細(xì)胞儀在膠原免疫四周后檢測了外周血IFN-γ分泌型Thl細(xì)胞、IL-4分泌型Th2細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群的變化，評價pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療對Thl/Th2及⑶4/⑶8比例的影響，具體結(jié)果見表10及圖1921。表10、pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗對大鼠外周血Thl/Th2、CD4+/CD8+比值的影響(n=5,x±s,%)Thl/Th2CD4+/CD8+15(^g治療組4.61±0.501.34±0.25*200pg治療組2.18±1.05*1.55±0.34*300pg治療組7.48±5.200.94±0.12*MTX治療組6.59±1.621.53±0.17*200pg預(yù)防組4.83土2.761.02±0.64Λ300pg預(yù)防I且1.49±0.30*1.26士0.06MTX頓防組1.79±0.141.96±0.41CIA對照組11.34±1.812.45±0.31正常組5.89±3.091.9±0.1注表示與CIA對照組相比，P<0.05；t表示與正常對照相比，P<0.05圖18、19結(jié)果顯示CIA大鼠的IFN-γ分泌型Thl細(xì)胞、IL_4分泌型Th2細(xì)胞比例均低于正常對照，但I(xiàn)L-4分泌型Th2下降更為明顯，使得Thl/Th2比例偏高，發(fā)生向Thl的偏移。150和200μgpcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗治療可明顯抑制Thl細(xì)胞的比例，Th2細(xì)胞比例則可恢復(fù)至正常，阻止了CIA大鼠向Thl的偏移，抑制了疾病的進(jìn)展。盡管300yg治療組的Thl/Th2比值較CIA有所下降，但Thl細(xì)胞比例卻明顯高于正常對照。當(dāng)預(yù)防性給予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗后，Thl細(xì)胞比例明顯下降，阻止了向Thl的偏移。研究同時發(fā)現(xiàn)MTX治療對Thl細(xì)胞比例影響不大，但可誘導(dǎo)IL-4分泌型Th2細(xì)胞增加，下調(diào)了Thl/Th2比值。⑶4/⑶8比值的變化見圖20。研究結(jié)果顯示CIA大鼠⑶4/⑶8的比值高于正常對照。當(dāng)給予pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗后，⑶4/⑶8的比值得以逆轉(zhuǎn)，尤其在300μg治療組，下降更為明顯，可能與⑶28分子多表達(dá)于⑶4+T細(xì)胞有關(guān)。MTX也可逆轉(zhuǎn)⑶4/⑶8比例，使其更接近正常水平。根據(jù)本發(fā)明提供新型pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40外毒素融合基因的DNA疫苗經(jīng)證實其可有效地預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可進(jìn)行各條件的適當(dāng)變化?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述實施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個因素的等同替換.權(quán)利要求一種重組核酸構(gòu)建體，其含有與表達(dá)調(diào)控序列有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQIDNO1)。2.權(quán)利要求1的重組核酸構(gòu)建體，其中所述表達(dá)調(diào)控序列選自CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白I。3.一種重組表達(dá)載體，其含有與選自pcDNA3.1Zeo(+)、pWLNE0、pSV2CAT、p0G44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表達(dá)載體有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQIDNO:1)。4.權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其由B7-2-PE40基因與pcDNA3.1/Zeo(+)載體組成。5.一種預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗，其包含權(quán)利要求1所述的重組核酸構(gòu)建體和/或權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體。6.權(quán)利要求5所述的DNA疫苗，其中還包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的免疫佐劑。7.根據(jù)權(quán)利要求6的DNA疫苗，其用于以注射、粘膜、基因槍導(dǎo)入等方式實施免疫；優(yōu)選的，其用于以至少一種選自靜脈注射、動脈注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射和腹腔內(nèi)注射的方式實施免疫。8.根據(jù)權(quán)利要求6的DNA疫苗，其為可經(jīng)由注射或可經(jīng)由粘膜施用的水溶液劑或復(fù)溶用凍干粉針劑。9.權(quán)利要求1所述的重組核酸構(gòu)建體用于制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗的用途。10.一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括向受試者施用治療有效量的權(quán)利要求1所述的重組核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求5所述的DNA疫苗。全文摘要本發(fā)明涉及一種重組核酸構(gòu)建體，其含有與真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQIDNO1)。本發(fā)明還涉及包含與真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo(+)有效連接的B7-2-PE40外毒素融合基因(SEQIDNO1)的重組表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及所述重組核酸構(gòu)建體用于制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗的用途，以及包含本發(fā)明所述重組核酸構(gòu)建體的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的DNA疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步的還涉及治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括向受試者施用治療有效量的所述DNA疫苗。文檔編號C12N15/861GK101824424SQ201010144610公開日2010年9月8日申請日期2010年4月7日優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日發(fā)明者奚永志,薛紅申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院