專利名稱：一種雜化凝膠載體的固定化酶制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雜化凝膠載體的固定化酶制備方法，特別涉及無機(jī)納米氧化 物-有機(jī)高分子聚丙烯酰胺雜化凝膠的吸附-絮凝固定化酶技術(shù)，本發(fā)明制備的無機(jī)-有 機(jī)雜化凝膠固定化酶負(fù)載量大、不易脫落且酶穩(wěn)定性好，屬吸附-絮凝耦合固定化酶的制 備技術(shù)。
背景技術(shù)：
固定化酶的性能主要取決于固定化方法和所使用的載體材料，隨著對固定化酶研 究的不斷深入，綜合性能優(yōu)良的載體材料的設(shè)計(jì)與耦合固定化技術(shù)已成為固定化酶技術(shù)領(lǐng) 域的一個(gè)非常重要的研究內(nèi)容。傳統(tǒng)的無機(jī)載體材料穩(wěn)定性好、無毒、成本低、機(jī)械強(qiáng)度高，一般是借助吸附方法 負(fù)載酶分子。吸附固定條件溫和，酶的構(gòu)象變化較小，對酶的催化活性影響小。特別是無機(jī) 納米顆粒具有高表面能等特性，吸附力強(qiáng)，能夠負(fù)載更多的酶，同時(shí)增加了與底物的接觸面 積，催化反應(yīng)擴(kuò)散影響小，是目前非?；钴S的研究方向。其缺點(diǎn)是酶與載體結(jié)合不牢，易脫 落，酶活力損失。高分子凝膠絮凝是固定化酶比較簡便的方法(張志華2005 ；劉勇2006 ；)固定化 條件溫和，較少改變酶的空間構(gòu)象，酶活回收率較高，酶分子也不容易脫落，但也存在機(jī)械 強(qiáng)度差、酶分子容易發(fā)生泄露和傳質(zhì)阻力較大等不足。解決問題的方法之一是利用無機(jī)納 米粒子預(yù)吸附酶分子，然后進(jìn)行有機(jī)高分子凝膠絮凝耦合固定化，制備無機(jī)_有機(jī)雜化固 定化酶催化體系。吸附_絮凝耦合固定化技術(shù)能夠很好地解決固定化酶分子易脫落、機(jī)械 強(qiáng)度差、擴(kuò)散限制等問題(Youichi 1998)。利用高分子凝膠絮凝體多孔疏松結(jié)構(gòu)能有效 改善固定化酶傳質(zhì)阻力大、酶分子易脫落、機(jī)械強(qiáng)度低的缺點(diǎn)，采用吸附_絮凝耦合固定化 法得到的固定化酶兼有吸附和絮凝固定化方法的優(yōu)點(diǎn)，在固定化酶領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前
旦
ο有機(jī)高分子聚丙烯酰胺凝膠是一種具有實(shí)用潛力的凝膠絮凝材料，近年來在國內(nèi) 外獲得了較廣泛的研究。聚丙烯酰胺凝膠可以通過氫鍵、范德華力、弱靜電引力與載體及酶 作用，將納米酶牽連在一起；聚丙烯酰胺的長分子鏈可以提供空間位阻屏蔽和靜電斥力穩(wěn) 定作用，有效阻礙納米顆粒的團(tuán)聚。這種納米顆粒增強(qiáng)型聚丙烯酰胺雜化凝膠具有以下特點(diǎn)(1)納米載體增加固定 化酶催化劑的比表面，提高催化活性。納米吸附載體材料，比表面積大，負(fù)載量大，能有效減 少酶的泄漏；(2)無機(jī)納米顆?？捎行б种聘叻肿幽z溶脹，并提高固定化酶載體的穩(wěn)定 性和機(jī)械強(qiáng)度；(3)高分子凝膠絮凝體具有較大的凝膠孔徑，納米酶與高分子凝膠絮凝劑 連結(jié)成一種具有大孔的疏松網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，可以保證酶促反應(yīng)底物和產(chǎn)物具有較高的擴(kuò)散速 率，酶促反應(yīng)擴(kuò)散限制??；(4)凝膠絮凝固定酶分子，溫和的相互作用為酶分子創(chuàng)造出適宜 的微環(huán)境，可使酶分子的三維結(jié)構(gòu)得以很好地維持，提高了聚丙烯酰胺凝膠固定化酶的活 性和穩(wěn)定性等；吸附絮凝固定化條件溫和，較好保持固定化酶的酶活性，催化活性高；(5)無機(jī)_有機(jī)雜化凝膠酶固定化技術(shù)，方便實(shí)現(xiàn)酶與底物和產(chǎn)物的快速分離，從而提高酶的 使用效率；所制備的固定化雜化凝膠載體可用于酶及生物大分子的固定化，既保持了較高 的酶活，又可在反應(yīng)后回收再利用，是一種簡便、溫和、穩(wěn)定性好、酶分子不易脫落的耦合固 定化酶制備技術(shù)。[1]張志華，江昌明，酶催化劑耦合固定化技術(shù)的研究進(jìn)展，工業(yè)催化，2005， 13(1) 5-8[2]劉勇，吾滿江·艾力，夏木西卡瑪爾，張永學(xué)，甘爭艷，孫燕，黑曲霉脂肪酶的耦 合固定化及特性，分子催化，2006, 20 (3) 260-265[3]Youichi K,Keiichiro S,Yuko T. Adsorption and enzyme(β -galactosidase and α -chymotrypsin) Immobilization properties of gel fiber prepared by the gel formation of cellulose acetate and titaniumiso-propoxide. Biotechnol Bioeng 1998,59 651 65
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種雜化凝膠載體的固定化酶制備方法，本發(fā) 明采用吸附-絮凝耦合固定化酶技術(shù)，以無機(jī)納米材料為吸附載體，利用納米氧化物如二 氧化硅、鈦、鋯、磁性材料等具有比表面積大等特點(diǎn)，有效吸附溶液中的酶分子；再將納米酶 絮凝固定于有機(jī)高分子聚丙烯酰胺凝膠體系中，制備無機(jī)-有機(jī)雜化凝膠固定化酶。本發(fā) 明制備的雜化凝膠固定化酶是一種高活性、高穩(wěn)定性和高傳質(zhì)性的固定化酶催化體系。是 一種簡便、溫和、活力穩(wěn)定、酶分子不易脫落的耦合固定化酶制備技術(shù)。技術(shù)方案本發(fā)明涉及一種雜化凝膠載體的固定化酶制備方法，特別涉及無機(jī)納 米氧化物-有機(jī)高分子聚丙烯酰胺雜化凝膠吸附-絮凝耦合固定化酶的制備方法。具體實(shí)施過程為載體溶液配制將聚丙烯酰胺緩慢加入溫水中，迅速攪拌，配成0. 1 20g/L聚丙 烯酰胺凝膠溶液，將吸附載體無機(jī)納米氧化物粉體超聲分散，制備含量為20. O 2400g/L 納米凝膠懸浮液，均質(zhì)后備用；酶蛋白液配制酶蛋白用緩沖溶液溶解，含量為1 50g/L ；構(gòu)建無機(jī)-有機(jī)雜化凝膠固定化酶體系，其組成及含量為無機(jī)納米氧化物載體 10. O 2000g/L，酶蛋白0. 1 30g/L，聚丙烯酰胺0. 01 10g/L，其余為緩沖溶液。吸附-絮凝耦合固定化工藝過程采用吸附-絮凝耦合固定化工藝過程，先混合酶 蛋白液與納米凝膠懸浮液，PH 6 10，30 45°C搖床預(yù)吸附酶蛋白20 60min后，添加聚 丙烯酰胺凝膠溶液，30 45°C振蕩，絮凝固定20 60min，得無機(jī)-有機(jī)雜化凝膠絮凝體， 離心洗滌，直至上清液中檢測不到蛋白質(zhì)為止，獲得雜化凝膠耦合固定化酶，2 4°C冰箱 保存于緩沖溶液中備用。所述的酶蛋白來自細(xì)胞，經(jīng)增殖培養(yǎng)、離心分離菌體、超聲波破碎、冷凍離心后，經(jīng) 飽和硫酸銨分級(jí)沉淀及透析脫鹽初步純化后，溶于緩沖溶液留存；酶蛋白也可以來自酶制 劑。所述的無機(jī)納米氧化物為二氧化硅、二氧化鈦、二氧化鋯或磁性材料。所添加的有機(jī)高分子凝膠包括聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯基甲
4基醚、聚乙烯吡咯烷酮中的一種。所述的聚丙烯酰胺包括陽離子聚丙烯酰胺，陰離子聚丙烯酰胺，非離子聚丙烯酰 胺。本發(fā)明可以推廣到對甘油脫氫酶、甘油脫水酶、1，3_丙二醇氧化還原酶等其它酶 和生物大分子的吸附_絮凝固定，無機(jī)_有機(jī)雜化凝膠耦合固定的生物催化劑可用于歧化 甘油合成1，3-丙二醇。有益效果本發(fā)明的目的在于提供一種雜化凝膠載體的固定化酶制備方法，本發(fā) 明采用吸附-絮凝耦合固定化酶技術(shù)，以無機(jī)納米材料為吸附載體，利用納米材料具有比 表面積大等特點(diǎn)，有效吸附溶液中的酶分子，再將納米酶絮凝固定于有機(jī)高分子聚丙烯酰 胺凝膠體系中，制備無機(jī)_有機(jī)雜化凝膠耦合固定化酶。具有負(fù)載量大，不易溶脫，活性穩(wěn) 定的優(yōu)點(diǎn)。


圖1.耦合固定化溫度條件對固定化酶負(fù)載量和活力回收的影響。圖2.固定化酶溶脫時(shí)間曲線，1為單一吸附法固定化酶；2為吸附_絮凝耦合固定化酶。圖3.吸附_絮凝耦合固定化酶和游離酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性的比較。
具體實(shí)施例方式載體溶液配制將聚丙烯酰胺緩慢加入溫水中，迅速攪拌，配成0. 1 20g/L聚丙 烯酰胺凝膠溶液，將吸附載體無機(jī)納米氧化物粉體超聲分散，制備含量為20. 0 2400g/L 納米凝膠懸浮液，均質(zhì)后備用；酶蛋白液配制酶蛋白用緩沖溶液溶解，含量為1 50g/L ；構(gòu)建無機(jī)-有機(jī)雜化凝膠固定化酶體系，其組成及含量為無機(jī)納米氧化物載體 10. 0 2000g/L，酶蛋白0. 1 30g/L，聚丙烯酰胺0. 01 10g/L，其余為緩沖溶液。吸附-絮凝耦合固定化工藝過程采用吸附-絮凝耦合固定化工藝過程，先混合酶 蛋白液與納米凝膠懸浮液，PH 6 10，30 45°C搖床預(yù)吸附酶蛋白20 60min后，添加聚 丙烯酰胺凝膠溶液，30 45°C振蕩，絮凝固定20 60min，得無機(jī)-有機(jī)雜化凝膠絮凝體， 離心洗滌，直至上清液中檢測不到蛋白質(zhì)為止，獲得雜化凝膠耦合固定化酶，2 4°C冰箱 保存于緩沖溶液中備用。實(shí)施例一不同TiO2加量對雜化凝膠固定化酶負(fù)載量及負(fù)載率的影響菌種克雷伯肺炎桿菌(K. pneumoniae)評價(jià)指標(biāo)①根據(jù)固定化前后溶液中的酶蛋白含量Ctl，C及溶液體積V，計(jì)算雜化凝膠載體對 酶蛋白的負(fù)載量Q
^ (Co-C)xF 式中Ctl為初始酶蛋白含量(mg/mL) ；C為吸附-絮凝稱合固定化后，上清液殘余酶蛋白 含量(mg/mL) ；V是混合液體積(mL)，m以無機(jī)納米氧化物質(zhì)量(g)計(jì)，Q為負(fù)載量(mg/g)。
其中酶蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法測定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。②根據(jù)吸附前后溶液中的蛋白含量CtlCt,計(jì)算納米打02粒子對酶蛋白的負(fù)載率ε 式中Ctl為初始酶含量(g/L)，Ct為吸附t時(shí)刻殘余酶蛋白含量(g/L)，ε為負(fù)載率。取500mL發(fā)酵液離心收集菌體，洗滌并稱重，加入10倍質(zhì)量0. 9%生理鹽水，混勻 后，冰浴環(huán)境下超聲波破碎、高速冷凍離心后獲得粗酶，粗酶用磷酸緩沖液溶解后，經(jīng)飽和 度50%的硫酸銨沉淀及透析脫鹽后，用磷酸緩沖液溶解，得酶蛋白液。取五份不同濃度的TiO2 (P25)懸浮液(pH7. 0)各5mL，向其中分別加入5mL酶蛋白 液，在一定溫度下振蕩預(yù)吸附30min后，添加聚丙烯酰胺凝膠溶液lmL，相應(yīng)溫度下振蕩絮 凝固定30min，取出在4000rpm下離心lOmin，下層沉淀(雜化凝膠耦合固定化酶)用pH = 7. 0的磷酸緩沖溶液洗滌至上清液無蛋白后，合并洗滌液及上清液，用于負(fù)載量和負(fù)載率的 分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1。表1不同TiO2含量對雜化凝膠固定化酶負(fù)載量及負(fù)載率影響 實(shí)施例一比較了在吸附_絮凝耦合固定化過程中，不同TiO2含量對固定化酶負(fù)載 量及負(fù)載率的影響。結(jié)果表明，雜化凝膠固定化酶的負(fù)載量隨著TiO2含量的增加而減小， 其負(fù)載率一直增加并逐漸變平緩，當(dāng)TiO2含量在200g/L時(shí)，TiO2對酶吸附達(dá)飽和，再增加 TiO2量不會(huì)對吸附率有很大的改進(jìn)，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致負(fù)載量的減小。綜合兩個(gè)因素考慮，可選擇 100 200g/L的TiO2作為固定化酶的最佳加量。實(shí)施例二耦合固定化溫度條件對雜化凝 膠固定化酶負(fù)載量及活力回收的影響實(shí)驗(yàn)用酶蛋白液同實(shí)施例一。甘油脫氫酶(⑶H)酶活測定5mL GDH反應(yīng)液(含30mmol/L (NH4) 2S04,0. 2mol/L甘 油，2mmol/L NAD+, 1 μ mol/L (NH4) 2Fe (SO4)2,用pH = 11的碳酸鉀緩沖液配制)在37°C條件下 加入酶啟動(dòng)反應(yīng)，在搖床中恒溫反應(yīng)40min，轉(zhuǎn)移到離心管中于8000r/min離心10分鐘，上 清液于紫外340nm下測定吸光度A。一個(gè)酶活力單位(U)是在該條件下一分鐘內(nèi)消耗Imol 底物所需要的酶量。固定化酶負(fù)載量和酶活力回收實(shí)驗(yàn)①負(fù)載量Q定義同例一；
6
②酶的活力回收率是指固定化酶活力與用于固定化的溶液酶活力之比(％ )。耦 合固定化溫度條件對雜化凝膠固定化酶負(fù)載量及活力回收的影響實(shí)驗(yàn)取六份已超聲分散的TiO2 (P25)懸浮液(pH7. 0) 5mL,向其中分別加入5mL酶蛋白 液，不同溫度下(4 60°C)振蕩預(yù)吸附30min后，添加聚丙烯酰胺凝膠溶液lmL，相應(yīng)溫度 下振蕩絮凝固定30min，取出在4000rpm下離心lOmin，下層沉淀(雜化凝膠耦合固定化酶) 用PH = 7. O的磷酸緩沖溶液洗滌至上清液無蛋白后，合并洗滌液及上清液，用于負(fù)載量的 分析；固定化酶用于酶活測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。實(shí)施例二研究了耦合固定溫度條件對固定化酶負(fù)載量和活力回收的影響情況，結(jié) 果表明隨著溫度的升高，固定酶負(fù)載量有所增加，最高可達(dá)到85. 16mg/g，但是增加的比較 緩慢，這說明溫度不是影響TiO2酶負(fù)載量的主要因素。但溫度對酶活力影響很大，隨著耦 合固定溫度增加，酶活力回收明顯下降，所以固定溫度在35 45°C比較適宜。實(shí)施例三單吸附固定化酶和吸附_絮凝雜化凝膠固定化酶溶脫情況的比較實(shí)驗(yàn)用酶蛋白液同實(shí)施例一。混合酶蛋白液與納米凝膠懸浮液，pH 7，37°C搖床預(yù)吸附酶蛋白60min，離心得單 吸附固定化酶；混合酶蛋白液與納米凝膠懸浮液，pH 7，37°C搖床預(yù)吸附酶蛋白60min，添加聚丙 烯酰胺凝膠溶液，37°C搖床振蕩絮凝固定30min，離心得吸附-絮凝雜化凝膠固定化酶；分別取用單吸附和吸附-絮凝法制備好的固定化酶各0. 3g，加入到IOOmL三角瓶 中。向每個(gè)三角瓶內(nèi)加入20mL緩沖溶液(pH = 8.0)，將固定化酶放于搖床中振蕩(37°C， 180rpm)，間隔時(shí)間測量上清液吸光度，計(jì)算溶脫下來的酶蛋白量。兩個(gè)平行樣取平均值，實(shí) 驗(yàn)結(jié)果如圖2。 實(shí)施例三比較了 pH = 8時(shí)單吸附固定化酶和吸附_絮凝雜化凝膠固定化酶的溶 脫情況。結(jié)果表明，耦合固定酶的酶蛋白脫落得到改善，溶脫率顯著小于單一吸附時(shí)情況， 雜化凝膠固定化酶具有更好的穩(wěn)定性。實(shí)施例四固定酶和游離酶催化穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察實(shí)驗(yàn)用酶蛋白液同實(shí)施例一。酶活測定同實(shí)施例二。混合酶蛋白液與納米凝膠懸浮液，pH 7，37°C搖床預(yù)吸附酶蛋白60min，添加聚丙 烯酰胺凝膠溶液，相應(yīng)溫度下振蕩絮凝固定30min，離心得吸附-絮凝雜化凝膠固定化酶；催化穩(wěn)定性將吸附_絮凝雜化凝膠固定化酶，進(jìn)行多批次催化反應(yīng)，測定每批次 反應(yīng)后剩余酶活，考察催化穩(wěn)定性。以第一次固定化酶活力作為100%，如表2結(jié)果表明經(jīng) 過4批次反應(yīng)，相對酶活力能保持在46. 7%。表2固定化酶催化穩(wěn)定性 儲(chǔ)存穩(wěn)定性將固定化酶和游離酶4°C保存，間隔時(shí)間測其酶活力，如圖3，以第 一次活力作為100%。結(jié)果表明將固定化酶和游離酶4°C保存30天后，游離酶活力下降近 34%，而固定化酶活力下降17%。雜化凝膠耦合固定化酶儲(chǔ)存30天后酶活仍保持80%以 上，儲(chǔ)存穩(wěn)定性好。
權(quán)利要求
一種雜化凝膠載體的固定化酶制備方法，其特征在于該方法采用吸附 絮凝耦合固定化酶方法，以無機(jī)納米氧化物粉體為吸附載體，利用納米材料具有比表面積大的特點(diǎn)，有效吸附溶液中的酶分子；再將納米酶絮凝固定于有機(jī)高分子聚丙烯酰胺凝膠體系中，制備無機(jī) 有機(jī)雜化凝膠固定化酶體系，其工藝過程為載體溶液配制將聚丙烯酰胺緩慢加入溫水中，迅速攪拌，配成0.1～20g/L聚丙烯酰胺凝膠溶液，將吸附載體無機(jī)納米氧化物粉體超聲分散，制備含量為20.0～2400g/L納米凝膠懸浮液，均質(zhì)后備用；酶蛋白液配制酶蛋白用緩沖溶液溶解，含量為1～50g/L；構(gòu)建無機(jī) 有機(jī)雜化凝膠固定化酶體系，其組成及含量為無機(jī)納米氧化物載體10.0～2000g/L，酶蛋白0.1～30g/L，聚丙烯酰胺0.01～10g/L，其余為緩沖溶液；吸附 絮凝耦合固定化工藝過程采用吸附 絮凝耦合固定化工藝過程，先混合酶蛋白液與納米凝膠懸浮液，pH 6～10，30～45℃搖床預(yù)吸附酶蛋白20～60min后，添加聚丙烯酰胺凝膠溶液，30～45℃振蕩，絮凝固定20～60min，得無機(jī) 有機(jī)雜化凝膠絮凝體，離心洗滌，直至上清液中檢測不到蛋白質(zhì)為止，獲得雜化凝膠耦合固定化酶，2～4℃冰箱保存于緩沖溶液中備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雜化凝膠載體的固定化酶制備方法，其特征在于所述的 酶蛋白來自細(xì)胞，經(jīng)增殖培養(yǎng)、離心分離菌體、超聲波破碎、冷凍離心后，經(jīng)飽和硫酸銨分級(jí) 沉淀及透析脫鹽初步純化后，溶于緩沖溶液留存；酶蛋白也可以來自酶制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雜化凝膠載體的固定化酶制備方法，其特征在于所述的 無機(jī)納米氧化物為二氧化硅、二氧化鈦、二氧化鋯或磁性材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雜化凝膠載體的固定化酶制備方法，其特征在于所添加 的有機(jī)高分子凝膠包括聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯吡咯 烷酮中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雜化凝膠載體的固定化酶制備方法，其特征在于所述的 聚丙烯酰胺包括陽離子聚丙烯酰胺，陰離子聚丙烯酰胺，非離子聚丙烯酰胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雜化凝膠載體的固定化酶制備方法，特別涉及無機(jī)納米氧化物-有機(jī)高分子聚丙烯酰胺雜化凝膠的吸附-絮凝固定化酶技術(shù)，其工藝過程為采用吸附-絮凝耦合固定化技術(shù)，以無機(jī)納米氧化物為吸附載體，利用納米材料如二氧化硅、鈦、鋯、磁性材料等比表面積大等特點(diǎn)，有效吸附溶液中的酶分子，再將納米酶絮凝固定于有機(jī)高分子聚丙烯酰胺凝膠體系中，制備無機(jī)-有機(jī)雜化凝膠固定化酶。本發(fā)明制備的雜化凝膠固定化酶酶分子負(fù)載量大、不易脫落、穩(wěn)定性好。
文檔編號(hào)C12N11/08GK101914519SQ201010222820
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者何琴, 倪恨美, 吳敏, 左勇剛, 張玲 申請人:東南大學(xué)