專利名稱：納米凝膠固定化多酶體系的制備及在1,3-丙二醇合成中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種納米凝膠固定化多酶體系的制備及其在1，3_丙二醇(1，3_PD)合成 中的應(yīng)用，通過制備在水溶液中均勻分散的納米凝膠懸浮液，使用分散-吸附固定化技術(shù)， 構(gòu)建納米凝膠_多酶組裝體系，多酶偶聯(lián)催化合成1，3-PD。該方法能有效抑制團(tuán)聚，提高分 散性，形成均勻而穩(wěn)定的納米凝膠懸浮液，發(fā)揮納米載體高比表面等優(yōu)異性能，既為同時(shí)偶 聯(lián)多種生物酶即多酶固定提供場所，又減小載體對(duì)底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散影響。使用納米凝膠 固定化多酶體系催化合成1，3-PD，較微生物發(fā)酵法等具有成本低，反應(yīng)簡單，無細(xì)胞污染， 不易被微生物降解等優(yōu)點(diǎn)。屬于1，3-PD的納米凝膠固定化酶催化合成技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物基多元醇1，3_丙二醇(簡稱1，3_PD)是一種重要的平臺(tái)化合物，以1，3_PD 為單體合成的新型形狀記憶纖維材料Sorona ，是目前合成纖維新品種開發(fā)的熱點(diǎn)。微生物發(fā)酵甘油生產(chǎn)1，3_PD主要利用氧化與還原途徑偶聯(lián)進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化。細(xì)胞 內(nèi)的氧化途徑和還原途徑是通過NADH2/NAD+以及能量ATP/ADP偶聯(lián)在一起的。在氧化途徑 中，通過甘油脫氫酶(⑶H，EC 1. 1. 1. 6)把甘油氧化成二羥基丙酮(DHA)，同時(shí)生成還原當(dāng) 量NADH2。在還原途徑中，甘油在以維生素B12為輔酶的甘油脫水酶(⑶Ht，EC 4. 2. 1.30)的 作用下轉(zhuǎn)化成3-羥基丙醛(3-HPA)，而3-HPA在氧化還原酶(PD0R，EC 1. 1. 1. 202)的作用 下被還原成1，3-PD，NADH2作為1，3-PD氧化還原酶的電子供體，還原3-HPA合成1，3-PD。 催化過程伴隨著輔酶I的自身偶聯(lián)再生。將⑶H、⑶Ht、PDOR等關(guān)鍵酶固定化，偶聯(lián)酶法生產(chǎn)1，3_PD，就是利用兩個(gè)平行的 氧化還原反應(yīng)酶系統(tǒng)，還原酶催化甘油轉(zhuǎn)化成1，3-PD，氧化酶則催化輔酶NADH2/NAD+循環(huán) 再生。使用固定化多酶體系催化合成1，3-PD，較微生物發(fā)酵法等具有反應(yīng)簡單，無細(xì)胞 污染，有利于連續(xù)操作和后續(xù)分離等優(yōu)點(diǎn)。并且使用固定化多酶催化體系，可以使大型發(fā)酵 罐取代為小型的固定化酶反應(yīng)器，使大型工廠小型化，因此成為生物法制備1，3-PD的研究執(zhí)占。在固定化酶技術(shù)中，除了固定化方法外，尋找新型的載體，以提高固定化酶的各種 性能具有重要的意義。納米載體材料與相應(yīng)的塊體材料相比，具有高比表面積，高活性，強(qiáng) 吸附力，高催化效率等優(yōu)異特性，能有效提高酶分子的負(fù)載量和穩(wěn)定性(Wang et al. 2006 ； Liu et al. 2009)。特別是無機(jī)氧化物納米載體材料具有良好熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和生物 相容性，廣泛應(yīng)用于微型生物器件、生物器件陣列以及電學(xué)、酶催化、光催化、藥物輸送等許 多領(lǐng)域。無機(jī)氧化物納米粉體(多為團(tuán)聚體)，是一種無毒、無污染、成本低的無機(jī)非金屬 材料。如納米TiO2作為酶固定化載體時(shí)不易被微生物降解、耐酸堿、可提供更多固定位點(diǎn)， 是一種對(duì)酶分子具有高度吸附能力的非水溶性載體。納米載體材料具有獨(dú)特的表面與界面
3反應(yīng)性能，納米載體材料的粒徑越小，其比表面積越大，吸附能力越強(qiáng)，酶分子負(fù)載量大，固 定化酶的催化活性就越高。但是納米載體材料粒徑小、比表面積大，在水介質(zhì)中具有較高的表面能，容易團(tuán) 聚。在水中分散時(shí)會(huì)形成難以分散的團(tuán)聚體，產(chǎn)生沉淀和結(jié)塊，這大大降低納米載體材料對(duì) 酶的吸附能力。如何有效抑制團(tuán)聚，提高分散性，形成均勻而穩(wěn)定的納米凝膠懸浮液，發(fā)揮 納米載體高比表面等優(yōu)異性能，高效吸附酶分子，減小載體對(duì)底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散影響，就需 要對(duì)團(tuán)聚體進(jìn)行表面改性，常用的方法是添加界面改性劑(崔愛莉，2001)，即分散劑，抑制 團(tuán)聚，獲得在水溶液中均勻分散的納米凝膠懸浮液，充分發(fā)揮納米載體高比表面等優(yōu)異性 能。均勻分散形成的巨大的比表面積，為同時(shí)偶聯(lián)多種生物酶即多酶固定提供了場所，更有 利于多酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行。本發(fā)明擬制備在水溶液中均勻分散的納米凝膠懸浮液，運(yùn)用分散_吸附固定化技 術(shù)，構(gòu)建納米凝膠-多酶組裝體系，從單酶體系向多酶體系發(fā)展，利用平行的氧化還原反應(yīng) 酶系統(tǒng)，自身循環(huán)再生NADH2/NAD+，多酶偶聯(lián)生產(chǎn)1，3-PD。與溶膠凝膠(sol-gel)納米固定化酶相比，分散-吸附法消除了載體與酶之間的 強(qiáng)相互作用，可以使酶活性得以保持(Kim et al.2006)。sol-gel納米固定化酶過程中一 般采用酸、堿或鹽作為sol-gel過程的催化劑，酶在較高、較低pH或者較高離子強(qiáng)度的條件 下極易失活；在sol-gel過程中，酶分子表面存在的大量0H、C00H與凝膠網(wǎng)絡(luò)形成初期含有 M-O(H)-M和M-OH聚合物片段存在強(qiáng)烈的相互作用(許松偉，2004)，導(dǎo)致酶分子構(gòu)象的改 變，引起酶活性降低。此外sol-gel過程前驅(qū)體水解產(chǎn)生的乙醇破壞適宜酶生存的微環(huán)境、 凝膠將酶限制在一些并不適合酶活性保持的微環(huán)境中，酶的構(gòu)象變化和分子運(yùn)動(dòng)與在溶液 中相比受到限制。 利用納米載體分散-吸附溶液中的酶分子，構(gòu)建納米凝膠-多酶組裝體系，載體粒 徑小，比表面大，能有效地維持酶分子催化活性，比水溶性酶更適合于多酶偶聯(lián)反應(yīng)。酶負(fù) 載量大，反應(yīng)擴(kuò)散限制小，成本低，無細(xì)胞污染，不易被微生物降解，是一種有效的納米凝膠 固定化酶催化合成的新方法。[ 1 ] Wang P, Nanoscale biocatalyst systems. Current Opinion in Biotechnology,2006，17(6) :574_579·[2] Liu W, Zhang S, Wang P, Nanopart icle-supp or ted multi-enzyme biocatalysis with insitu cofactor regeneration. Journal of Biotechnology,2009, 139(1) :102-107.[3]崔愛莉，王亭杰，何紅，金涌，超細(xì)二氧化鈦粉末在水溶液中的分散，過程工程 學(xué)報(bào)，2001，1(1) 99-101.[4]Kim MI, Ham HO,Oh SD,et al. Immobilization of Mucor javanicus lipase oneffectively functionalized silica nanoparticles. J Mol Catal B-Enzymatic, 2006,39(1/4) :62-68.[5]許松偉，姜忠義，吳洪，黃淑芳，溶膠-凝膠生物包囊化物的制備與特性?；瘜W(xué) 進(jìn)展，2004，16(3) 443-449.

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明是一種納米凝膠固定化多酶體系的制備及其在1，3_丙二醇合 成中的應(yīng)用，采用無機(jī)氧化物納米粉體作為固定化酶的載體，利用分散劑抑制納米顆粒間 團(tuán)聚，獲得水中分散的納米凝膠懸浮液，通過分散_吸附固定化方法，制備納米凝膠_多酶 組裝體系，自身偶聯(lián)，多酶催化生產(chǎn)1，3_丙二醇。使用納米凝膠固定化多酶體系催化合成1，3-丙二醇，充分發(fā)揮納米載體高比表面 等優(yōu)異性能，既為同時(shí)偶聯(lián)多種生物酶即多酶固定提供場所，又減小載體對(duì)底物和產(chǎn)物的擴(kuò) 散影響。較微生物發(fā)酵法等具有成本低，反應(yīng)簡單，無細(xì)胞污染，不易被微生物降解等優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)方案本發(fā)明的目的是提供在水溶液中均勻分散的納米凝膠懸浮液，利用含 親水基的羥基醇基團(tuán)，分散無機(jī)氧化物納米粉體，防止納米粒子團(tuán)聚，充分發(fā)揮納米載體高 比表面等優(yōu)異性能，有效吸附固定偶聯(lián)酶體系的方法。一元或多元醇分散劑對(duì)酶分子二硫 鍵以及三維結(jié)構(gòu)具有一定的保護(hù)作用，醇分散-吸附固定化酶技術(shù)可有效地束縛酶的構(gòu)象 和維持微環(huán)境穩(wěn)定，是穩(wěn)定酶活性的重要方法之一。其特征包括以下步驟1)無細(xì)胞抽提 液制備；2)納米載體的分散；3)納米凝膠吸附負(fù)載固定化多酶體系。具體實(shí)施過程為1)無細(xì)胞抽提液制備將克雷伯桿菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)后，離心收集菌體；洗滌并稱 重，加入2 10倍質(zhì)量的生理鹽水，混勻后，冰浴環(huán)境下超聲破碎，離心后獲得粗酶液，再經(jīng) 飽和度30% 70%的硫酸銨分級(jí)沉淀，透析脫鹽，用pH = 6. 5 10. 0的Tris-HCl緩沖溶 液配制成濃度為5. 0 100g/L的多酶體系溶液；2)納米載體的分散將分散劑醇用TriS-HCl緩沖溶液溶解，按m # u:mTi02 =0.05 0.5:1的質(zhì)量配比與TiO2納米載體混合，超聲分散30 60min，得到水中分散的納米 TiO2凝膠懸浮液；3)納米凝膠吸附負(fù)載固定化多酶體系將多酶體系溶液與納米TiO2凝膠懸浮液 混勻，體積比1 1 10，于37-50°C時(shí)搖床中振蕩吸附0. 5 6h，離心混合體系，保留上清 液測定酶含量，下層沉淀用緩沖溶液洗滌至上清液無蛋白檢測出，獲得納米凝膠固定化多 酶體系，低溫保存；所述的分散劑醇為一元或多元醇分散劑，是聚乙二醇、乙二醇、甘油、檸檬酸、二 硫蘇糖醇或β-巰基乙醇中的一種或多種。所制備得到的納米凝膠固定化多酶體系包括甘油脫氫酶、甘油脫水酶和1，3_丙
二醇氧化還原酶。所述的納米凝膠固定化多酶體系在1，3_丙二醇合成中的應(yīng)用，其特征在于多 酶偶聯(lián)催化1，3_丙二醇合成方法為反應(yīng)液的組成為甘油100 650mmol/L，NAD+O. 5 5mmol/L, VB12 5 30 μ mol/L, (NH4) 2S04 20 50mmol/L，(NH4) 2Fe (SO4) 2 0. 5 2 μ mol/L, Mg2+O. 5 2mmol/L，檸檬酸0. 2 2mmol/L，pH = 6. 5 10. 0緩沖溶液；加入納米凝膠固 定化多酶體系10 100g/L，30 45°C條件下?lián)u床振蕩，反應(yīng)2 12小時(shí)，離心取上清液測 定1，3-丙二醇含量。有益效果本發(fā)明提供了一種有效的納米凝膠固定化酶催化合成的新方法。使 用納米凝膠分散_吸附固定化技術(shù)，構(gòu)建納米凝膠_多酶組裝體系，多酶偶聯(lián)催化合成1， 3-丙二醇，分散的納米凝膠載體具有大的比表面積，能有效提高酶的負(fù)載量；載體粒徑小，具有小的擴(kuò)散限制；制備工藝簡便，條件溫和，能有效地維持酶分子催化活性，適合于多酶 偶聯(lián)反應(yīng)。與微生物發(fā)酵法相比，具有反應(yīng)簡單，無細(xì)胞污染，不易被微生物降解、成本低等 優(yōu)點(diǎn)。


圖1.游離酶和納米凝膠固定化多酶體系的熱穩(wěn)定性比較。
具體實(shí)施例方式1)無細(xì)胞抽提液制備將克雷伯桿菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)后，離心收集菌體；洗滌并稱 重，加入2 10倍質(zhì)量的生理鹽水，混勻后，冰浴環(huán)境下超聲破碎，離心后獲得粗酶液，再經(jīng) 飽和度30% 70%的硫酸銨分級(jí)沉淀，透析脫鹽，用pH = 6. 5 10. 0的Tris-HCl緩沖溶 液配制成濃度為5. 0 100g/L的多酶體系溶液；2)納米載體的分散將分散劑醇用Tris-HCl緩沖溶液溶解，按m · _」:ιηΤ θ2 =0.05~0.5:1的質(zhì)量配比與TiO2納米載體混合，超聲分散30 60min，得到水中分散的納米 TiO2凝膠懸浮液；3)納米凝膠吸附負(fù)載固定化多酶體系將多酶體系溶液與納米TiO2凝膠懸浮液 混勻，體積比1 1 10，于37-50°C時(shí)搖床中振蕩吸附0. 5 6h，離心混合體系，保留上清 液測定酶含量，下層沉淀用緩沖溶液洗滌至上清液無蛋白檢測出，獲得納米凝膠固定化多 酶體系，低溫保存；實(shí)施例一不同醇分散劑對(duì)TiO2負(fù)載率影響菌種克雷伯肺炎桿菌(K. pneumoniae)取IOOOmL發(fā)酵液離心收集菌體，洗滌并稱重，加入10倍質(zhì)量0. 9%生理鹽水，混勻 后，冰浴環(huán)境下超聲破碎、離心后獲得粗酶液，以飽和度50%的硫酸銨沉淀，透析脫鹽后， 用Tris-HCl緩沖溶液配制濃度為20. Og/L的多酶體系溶液。分別稱取50mg TiO2 (粒徑16nm，比表面280m2/g)納米載體到1-7號(hào)試管中，1號(hào) 試管無分散劑，以5mLTris-HCl緩沖溶液作空白，超聲分散30min。2-7號(hào)試管中加入5mL 不同醇分散劑溶液，超聲分散30min。再往1-7號(hào)試管分別加入5mL多酶體系溶液，于37°C 時(shí)搖床中振蕩吸附約lh，取出在8000rpm下離心lOmin，下層沉淀用pH = 7. 0的Tris-HCl 緩沖溶液洗滌至上清液無蛋白后，合并洗滌液及上清液用于酶含量及負(fù)載率的分析。酶蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法測定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。根據(jù)吸附前 后溶液中的蛋白含量CQ，Ct，計(jì)算納米1102粒子對(duì)酶蛋白的負(fù)載率ε
Co-Ctε =-χ 100%
Co式中Ctl為初始酶濃度(g · L-1)，Ct為吸附t時(shí)刻殘余酶濃度(g · L-1)，ε為負(fù)載 率。表1不同醇分散劑對(duì)TiO2負(fù)載率影響
6 實(shí)施例一研究了不同醇分散劑對(duì)納米載體TiO2負(fù)載率的影響。表1結(jié)果表明添 加醇分散劑有效改善納米TiO2分散性，可充分發(fā)揮納米載體高比表面等優(yōu)異性能，有效提 高了 TiO2對(duì)酶蛋白的負(fù)載率。其中，聚乙二醇分散劑的分散機(jī)制屬于空間位阻穩(wěn)定機(jī)制。聚乙二醇作為非離子 型表面活性劑，主要通過在納米凝膠顆粒表面形成吸附層，產(chǎn)生并強(qiáng)化位阻效應(yīng)，使膠粒間 產(chǎn)生強(qiáng)位阻排斥力，抑制納米粒子團(tuán)聚。不同分子量聚乙二醇對(duì)TiO2負(fù)載率影響不同。甘油介電常數(shù)高，可以溶解無機(jī)化合物，對(duì)TiO2納米載體的分散也起到一定改善 作用。甘油對(duì)溶液中TiO2凝膠顆粒的分散作用是溶劑化作用的結(jié)果。醇分子的羥基與TiO2 表面的羥基氧通過氫鍵形成羥橋結(jié)構(gòu)，從而在TiO2表面形成溶劑化層，抑制納米TiO2顆粒 間團(tuán)聚。分散的納米載體具有大的比表面積，有效提高酶的負(fù)載率。此外，甘油又是酶作用底物，可誘導(dǎo)酶空間構(gòu)型，有效地束縛酶的構(gòu)象和維持微環(huán) 境穩(wěn)定，對(duì)固定化酶活性穩(wěn)定有一定輔助作用。實(shí)施例二不同pH負(fù)載工藝對(duì)納米凝膠載體負(fù)載甘油脫氫酶負(fù)載率的影響多酶體系溶液制備同實(shí)施例一。以甘油為分散劑，稱取等量TiO2 (粒徑16nm，比表面280m2/g)粉體12份，分別加入 不同pH Tris-HCl緩沖溶液(pH = 5. 0 10. 0)，超聲分散30min，加入一定量酶液于37°C 時(shí)搖床中振蕩吸附lh，取出在8000rpm下離心lOmin，下層沉淀用Tris-HCl緩沖溶液洗滌 至上清液無蛋白后，合并洗滌液及上清液用于分析不同PH條件下酶的負(fù)載率。兩個(gè)平行樣 取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。表2不同pH負(fù)載工藝對(duì)納米凝膠載體負(fù)載甘油脫氫酶負(fù)載率的影響 實(shí)施例二以甘油為分散劑，對(duì)比了不同pH條件對(duì)TiO2凝膠負(fù)載酶分子負(fù)載率的 影響。結(jié)果表明，PH條件對(duì)固定化酶的負(fù)載率影響較大，pH8-9負(fù)載率較高?？赡苁荰iO2 與酶分子表面都帶有羥基、氨基等官能團(tuán)，在不同PH條件下會(huì)發(fā)生兩性解離，所以TiO2凝 膠顆粒負(fù)載酶分子時(shí)，不同PH條件會(huì)影響帶電微粒間的靜電相互作用，影響載體吸附性能寸。實(shí)施例三納米凝膠固定化多酶體系的熱穩(wěn)定性菌種克雷伯肺炎桿菌(K. pneumoniae)甘油脫氫酶GDH 酶活測定5mL GDH 反應(yīng)液(含 30mmol/L (NH4) 2S04，0. 2mol/L 甘 油，2mmol/L NAD+, 1 μ mol/L(NH4)2Fe (SO4)2，用 pH = 11 的碳酸鉀緩沖溶液配制)在 37°C條 件下加入實(shí)驗(yàn)用酶啟動(dòng)反應(yīng)，在搖床中恒溫反應(yīng)40分鐘，轉(zhuǎn)移到離心管中于8000r/min離 心10分鐘，上清液于340nm下測定吸光度A。一個(gè)酶活力單位(U)是在該條件下一分鐘內(nèi) 消耗Imol底物所需要的酶量。多酶體系溶液制備同實(shí)施例一。稱取一定量TiO2粉體，以甘油為分散劑，用Tris-HCl緩沖溶液超聲分散30min，得 納米凝膠懸浮液，向其中加入一定量酶液于37°C時(shí)搖床中振蕩吸附約lh，離心洗滌得納米 凝膠固定化多酶體系。取等量的游離酶液和納米凝膠固定化多酶各6組，分別放在4、20、 37、50、60和70°C下保溫2h，測其甘油脫氫酶GDH酶活力，結(jié)果如圖1。實(shí)施例三比較了游離酶液和納米凝膠固定化多酶在不同溫度條件下相對(duì)酶活 情況。結(jié)果表明，酶蛋白經(jīng)固定后，提高了熱穩(wěn)定性。游離酶在70°C保溫2h，酶活力僅剩 11. 7%，此時(shí)酶蛋白基本都變性失活，而納米凝膠固定化多酶在70°C保溫2h保持了 77. 5% 的酶活力，且納米凝膠固定化多酶比游離酶具有了更寬的適宜反應(yīng)條件范圍。這可能由于 分散劑醇羥基與酶分子形成了氫鍵，提高酶的熱變性溫度，或醇分子包裹在酶分子周圍，穩(wěn) 定了酶的空間結(jié)構(gòu)，對(duì)酶分子二硫鍵的三維結(jié)構(gòu)具有一定的保護(hù)作用，從而提高了固定化 酶的熱穩(wěn)定性。實(shí)施例四納米凝膠-多酶組裝體系偶聯(lián)催化1，3-丙二醇合成多酶體系溶液制備同實(shí)施例一。以甘油為分散劑，稱取適量TiO2 (粒徑16nm，比表面280m2/g)，加入Tris-HCl緩沖 溶液(pH = 5. 0 10. 0)，超聲分散30min，加入一定量酶液于37°C時(shí)搖床中振蕩吸附lh， 離心洗滌得納米凝膠固定化多酶體系。
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取制備好的納米凝膠固定化多酶體系1. 5g與50mL反應(yīng)液混合，反應(yīng)液的組成為 甘油 0. 50mol/L, NAD+2mmol/L, VB1215 μ mol/L, (NH4) 2S0430mmol/L, (NH4) 2Fe (SO4) 21 μ mol/L, Mg2+L 7mmol/L，檸檬酸1. lmmol/L, Tris-HCl緩沖溶液(pH = 7. 0)。多酶偶聯(lián)催化反應(yīng)在 搖床中進(jìn)行，經(jīng)搖床反應(yīng)2 12小時(shí)，離心取上清液用氣相色譜法測定1，3-丙二醇濃度， 結(jié)果如表3。表3納米凝膠固定化多酶體系偶聯(lián)催化產(chǎn)1，3-丙二醇情況
多酶偶聯(lián)催化反應(yīng)時(shí)間/h 產(chǎn)物1,3-丙二醇濃度(mmol/L) 2 18.2 6 86.1 10126.3以上結(jié)果表明，采用分散-吸附固定化技術(shù)，構(gòu)建納米凝膠-多酶組裝體系，該納 米凝膠固定化多酶體系能實(shí)現(xiàn)NADH2/NAD+自身循環(huán)再生，偶聯(lián)催化合成1，3_丙二醇。使用納米凝膠分散-吸附固定化多酶體系，催化甘油合成1，3_丙二醇，充分發(fā)揮 納米凝膠高比表面等優(yōu)異性能，既反應(yīng)簡單，無細(xì)胞污染，又為同時(shí)偶聯(lián)多種生物酶即多酶 固定提供場所，方法簡便、成本低。
權(quán)利要求
一種納米凝膠固定化多酶體系的制備，其特征在于用含親水基的多醇基團(tuán)，分散納米載體，抑制納米粒子團(tuán)聚，獲得水中分散的納米凝膠懸浮液，充分發(fā)揮納米載體高比表面等優(yōu)異性能，以分散 吸附固定化方法，制備納米凝膠固定化多酶體系，具體為1)無細(xì)胞抽提液制備將克雷伯桿菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)后，離心收集菌體；洗滌并稱重，加入2～10倍質(zhì)量的生理鹽水，混勻后，冰浴環(huán)境下超聲破碎，離心后獲得粗酶液，再經(jīng)飽和度30％～70％的硫酸銨分級(jí)沉淀，透析脫鹽，用pH＝6.5～10.0的Tris HC1緩沖溶液配制成濃度為5.0～100g/L的多酶體系溶液；2)納米載體的分散將分散劑醇用Tris HCl緩沖溶液溶解，按的質(zhì)量配比與TiO2納米載體混合，超聲分散30～60min，得到水中分散的納米TiO2凝膠懸浮液；3)納米凝膠吸附負(fù)載固定化多酶體系將多酶體系溶液與納米TiO2凝膠懸浮液混勻，體積比1∶1～10，于37 50℃時(shí)搖床中振蕩吸附0.5～6h，離心混合體系，保留上清液測定酶含量，下層沉淀用緩沖溶液洗滌至上清液無蛋白檢測出，獲得納米凝膠固定化多酶體系，低溫保存。FSA00000181005700011.tif,FSA00000181005700012.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米凝膠固定化多酶體系的制備，其特征在于在納米載體的 分散中，所述的分散劑醇為一元或多元醇分散劑，是聚乙二醇、乙二醇、甘油、檸檬酸、二硫 蘇糖醇或β-巰基乙醇中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米凝膠固定化多酶體系的制備，其特征在于所制備得到的 納米凝膠固定化多酶體系包括甘油脫氫酶、甘油脫水酶和1，3_丙二醇氧化還原酶。
4.一種如權(quán)利要求1所述的納米凝膠固定化多酶體系在1，3_丙二醇合成中的應(yīng)用，其 特征在于多酶偶聯(lián)催化1，3-丙二醇合成方法為反應(yīng)液的組成為甘油100 650mmol/L， NAD+ 0. 5 5mmol/L，VB12 5 30 μ mol/L, (NH4) 2S04 20 50mmol/L，(NH4) 2Fe (SO4) 2 0· 5 2 μ mol/L, Mg2+ 0. 5 2mmol/L，檸檬酸 0. 2 2mmol/L，pH = 6. 5 10. 0 緩沖溶液；加入 納米凝膠固定化酶10 100g/L，30 45°C條件下?lián)u床振蕩，反應(yīng)2 12小時(shí)，離心取上清 液測定1，3-丙二醇含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用納米凝膠分散-吸附固定化酶技術(shù)，構(gòu)建納米凝膠-多酶組裝體系，自身偶聯(lián)，多酶催化合成1，3-丙二醇。通過制備在水溶液中均勻分散的納米凝膠懸浮液，直接吸附固定多酶體系。該方法能有效抑制團(tuán)聚，提高分散性；充分發(fā)揮納米凝膠載體高比表面等優(yōu)異性能，既為同時(shí)偶聯(lián)多種生物酶即多酶固定提供場所，又減小載體對(duì)底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散影響；較微生物發(fā)酵法等具有成本低，反應(yīng)簡單，無細(xì)胞污染，不易被微生物降解等優(yōu)點(diǎn)。是一種有效的納米凝膠固定化酶催化合成的新方法。
文檔編號(hào)C12N11/14GK101914520SQ20101022237
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者何琴, 倪恨美, 卜長飛, 吳敏, 張玲 申請(qǐng)人:東南大學(xué)