專利名稱：能同時降解果酒中蘋果酸和檸檬酸菌株的篩選方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能同時降解果酒中蘋果酸及檸檬酸菌株的篩選方法及應(yīng)用，是一 種利用微生物一陸生伊薩酵母降低果酒中蘋果酸和檸檬酸含量的方法，屬于食品加工領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
果酒的質(zhì)量主要取決于水果質(zhì)量，在氣候條件不良的年份(低溫、高濕)或由于采 收過早往往導(dǎo)致水果原料的質(zhì)量不能充分體現(xiàn)，造成水果成熟度不夠、含酸量高。水果中 含量較高的酸主要是蘋果酸和檸檬酸。蘋果酸，學(xué)名羥基丁二酸，主要有三種存在形式，即 D-蘋果酸、DL-蘋果酸、L-蘋果酸，自然界存在的蘋果酸都是L-蘋果酸。L-蘋果酸主要存 在于不成熟的山楂、蘋果和葡萄果實的漿汁中。檸檬酸，學(xué)名2-羥基丙烷-1，2，3-三羧酸， 天然檸檬酸在自然界分布很廣，主要存在于植物如檸檬、柑橘、菠蘿、山楂等果實中。檸檬酸 含量隨著不同的栽培品種和植物的生長情況而有所變化。游離酸的存在，不僅使果酒具有酸味，而且可以防止果酒被有害微生物污染和發(fā) 生化學(xué)變化，保持果酒品質(zhì)的穩(wěn)定。但是有機酸并不是越多越好，適度的酸度給人帶來清 新、爽口和愉悅的感覺，酸度過高會使山葡萄酒有酸澀感、酒味粗硬、品質(zhì)下降。所以在果酒 生產(chǎn)過程中往往會面臨降酸的問題。常見的降酸微生物主要包括粟酒裂殖酵母(Schisosaccharomyces pombe)和蘋 果酸-乳酸菌。粟酒裂殖酵母在厭氣條件下分解蘋果酸生成乙醇和C02。該酵母有較強的 耐SO2的性能，但繁殖與發(fā)酵速度較慢，發(fā)酵最適溫度偏高，并且使用粟酒裂殖酵母純種發(fā) 酵得到的果酒品質(zhì)有股霉味，酒質(zhì)不佳。蘋果酸-乳酸發(fā)酵細(xì)菌是利用乳酸菌的代謝作用， 將酸味尖銳的蘋果酸轉(zhuǎn)化成口感柔和的乳酸，從而降低酒的酸度。這種方法可以提高果酒 對微生物的穩(wěn)定性，改變酒中微量組分的含量和比例，改變呈香物質(zhì)的濃度，有利于提高酒 的風(fēng)味。但這種方法在生產(chǎn)實際應(yīng)用中也面臨著許多困難，例如操作不易控制，并且乳酸菌 易引起果酒的多種病害。本發(fā)明利用篩選得到的陸生伊薩酵母來降低蘋果酸和檸檬酸的酸 度，目前尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種能同時降解果酒中蘋果酸及檸檬酸菌株的篩選方法；通 過以蘋果酸為唯一碳源做培養(yǎng)基從葡萄園的土壤中篩選得到一株能降解蘋果酸和檸檬酸 的微生物——陸生伊薩酵母。本發(fā)明的另一目的在于提供一種菌株——陸生伊薩酵母在降解果酒中蘋果酸及 檸檬酸的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的能同時降解果酒中蘋果酸及檸檬酸菌株，其特 征在于以蘋果酸為唯一碳源做培養(yǎng)基從葡萄園的土壤中篩選降酸菌，具體篩選方法如 下
采集葡萄園土壤2g加到盛有100mL無菌生理鹽水的三角瓶中，并加入8 12粒 無菌玻璃珠，充分振蕩后靜置，取上清液再分別加入到以濃度為2g/L的蘋果酸為唯一碳源 的液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28°C，150r/min，搖床振蕩培養(yǎng)，以24h為 一個周期，每個周期結(jié)束后，按照以上的操作，依次將所培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接入新鮮的富集培養(yǎng) 基中，同時蘋果酸濃度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐漸遞增到10g/L ；選出生長較好的菌株， 將篩選得到的降酸菌用平板劃線法進(jìn)行多次分離純化后，挑取單菌落接入到Y(jié)PD斜面培養(yǎng) 基上于28°C培養(yǎng)24h后4°C保存。陸生伊薩酵母在降解果酒中蘋果酸及檸檬酸的應(yīng)用的實驗例如下將果實原料進(jìn)行破碎后加入0. 05%的果膠酶和100mg/L的S02，浸汁12小時后用 汁渣分離機進(jìn)行分離壓榨出汁，在30°C條件下接入降酸有效菌進(jìn)行降酸發(fā)酵，發(fā)酵48h后 進(jìn)行酒精發(fā)酵，酒精發(fā)酵是在20 25°C條件下接入釀酒酵母菌，酒精發(fā)酵結(jié)束后再進(jìn)行過 濾、澄清，最后進(jìn)入陳釀工序。酸度檢測方法采用NaOH滴定法(以蘋果酸或檸檬酸計)。菌種鑒定通過對篩選出的高效降酸菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特性和分子生物學(xué) 鑒定。最終確定篩選得到一株具有高效降解蘋果酸和檸檬酸能力的菌株(命名為S8)屬于 伊薩酵母屬(Issatchenkia)中的陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola)種。菌株的生長特性研究以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，0D■值為縱坐標(biāo)，確定菌體生長曲 線。對培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的起始PH值及搖床轉(zhuǎn)速設(shè)計不同水平的數(shù)值進(jìn)行試驗，最終確定 菌株的最適培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)基的最適起始PH值及最適搖床轉(zhuǎn)速。菌株的耐受性研究對S02濃度、酒精度及pH值設(shè)計不同水平的數(shù)值進(jìn)行試驗，最 終確定了菌株對S02濃度、酒精度及pH值的耐受性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下本發(fā)明中篩選得到的陸生伊薩酵母具有同時降解蘋果酸和檸檬酸的效果，且降解 率達(dá)80%以上，并且該菌株耐受S02濃度達(dá)450mg/L，最適培養(yǎng)溫度為30°C，發(fā)酵溫度適中。


圖1麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖2菌株S8細(xì)胞的顯微形態(tài)圖3菌株S8的生長曲線圖4菌株S8的最適溫度確定圖5菌株S8的最適pH的確定圖6菌株S8最適搖床轉(zhuǎn)速的確定圖7菌株S8對S02濃度的耐受性圖8菌株S8對酒精度的耐受性
具體實施例方式實施例1 利用從葡萄園土壤中篩選得到的陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola)進(jìn)行 降解蘋果酸和檸檬酸。
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本發(fā)明利用的主要培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基(NH4)2S042g, KH2P042. 5g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. lg，酵母膏 0. 5g，蘋果酸按需 加入，用于IL蒸餾水中，取IOOmL配制溶液分裝于250mL三角瓶中，115°C濕熱滅菌30min。固體分離培養(yǎng)基(NH4)2S042g，KH2P042. 5g, FeSO4 ·7Η20 0. lg，酵母膏 0. 5g，瓊脂粉 20g，溶于800mL蒸餾水中，蘋果酸按需加入200mL蒸餾水中，115°C濕熱滅菌30min，冷卻到 50 60°C，將二者混合，倒平板。麥芽汁培養(yǎng)基由干麥芽制的，具體方法參照現(xiàn)代食品微生物學(xué)實驗技術(shù)劉慧 主編，中國輕工業(yè)出版社，2006 :265。YPD培養(yǎng)基葡萄糖2%，酵母浸粉1%，蛋白胨1%，自然pH，121°C濕熱滅菌 20minoWL營養(yǎng)培養(yǎng)基酵母浸粉0.4%，胰蛋白胨0. 5 %，葡萄糖5 %，KH2PO4O. 055 %，KCl 0. 0425%，無水 CaCl2O. 0125%, FeCl3O. 00025%, MgSO4O. 0125%, MnSO4O. 00025%。1、菌種篩選(1)富集培養(yǎng)將采集到的土壤定量加到無菌生理鹽水中，加數(shù)粒玻璃珠，充分振 蕩后靜置，取上清液分別加入到以蘋果酸(蘋果酸濃度為2g/L)為唯一碳源的液體富集培 養(yǎng)基中，280C，150r/min,搖床振蕩培養(yǎng)24h。24h為一個周期，每個周期結(jié)束后，按照以上的 操作，依次取一定量培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接入新鮮的富集培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)多次。同時蘋果 酸濃度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐漸遞增到10g/L。(2)初篩在富集培養(yǎng)后取一定量的富集菌液，用生理鹽水稀釋到10_5，選擇10_3、 10_4、10_5稀釋度，分別吸取0. 5mL稀釋液涂布于含蘋果酸濃度為10g/L的瓊脂平板培養(yǎng)基 上，28°C恒溫培養(yǎng)24h。將所得的典型單菌落點植于分離培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)。(3)復(fù)篩將初篩所得到的單菌落用平板劃線法進(jìn)行多次分離純化，挑取單菌落 接入YPD斜面培養(yǎng)基于28°C培養(yǎng)24h后4°C保存。2、降酸特性研究以WL培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用5g/L蘋果酸或檸檬酸代替葡萄糖做唯一碳源進(jìn)行 培養(yǎng)，測定降酸率，得到一株降酸率最高的菌株，其降解蘋果酸和檸檬酸率均高達(dá)80%以 上。3、菌種鑒定(1)菌落形態(tài)觀察將得到的降酸率最高的菌株接種于麥芽汁培養(yǎng)基上，在30°C 下培養(yǎng)1 2d，對形成的菌落特征進(jìn)行觀察，如圖1所示。(2)細(xì)胞形態(tài)觀察采用光學(xué)顯微鏡觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)，如圖2所示。(3)生化試驗鑒定對菌株做淀粉水解試驗、明膠液化試驗、M R試驗、硝酸鹽還原 試驗等各種生化鑒定試驗，觀察菌株對各種碳源和氮源的利用情況。(4)分子生物學(xué)鑒定測定該菌株的ITS保守序列組成，并與Genbank中的相關(guān)序 列進(jìn)行比對，以確定該菌的具體種類。結(jié)果得出該菌株的ITS基因序列與陸生伊薩酵母的 ITS基因序列的同源性達(dá)到100%，因此鑒定該菌株為伊薩酵母屬(Issatchenkia)中的陸 生伊薩酵母(Issatchenkia terricola)種，命名為S8。 4、菌株S8的生長特性研究(1)生長曲線的測定
將活化的菌株接種到滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，于28°C，150r/min下?lián)u床培養(yǎng)12h 后，以2%接種量轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，測定0D,值，然后于28°C，150r/min下?lián)u床培 養(yǎng)，每隔2h測定0D,值(以未接菌的YPD培養(yǎng)液做空白試驗)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，0D_ 值為縱坐標(biāo)，確定菌體生長曲線，如圖3所示。(2)最適生長溫度的確定將活化的菌株接種到滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，取處于對數(shù)生長期的菌懸液，以 2%接種量轉(zhuǎn)接到50mLYPD液體培養(yǎng)基中，分別在24°C、26°C、28°C、30°C、32°C、34°C，150r/ min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后取菌液測定0D_ (以未接菌的YPD培養(yǎng)液做空白)，最大0D6(1(1值 下的培養(yǎng)溫度即為最適生長溫度，如圖4所示。(3)最適生長起始pH值的確定用NaOH或HC1調(diào)節(jié)YPD液體培養(yǎng)基的pH值分別為3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0，取 處于對數(shù)生長期的菌懸液，以2%的接種量接種于50mL上述不同pH值的YPD液體培養(yǎng)基 中，置于最適生長溫度，150r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后取菌液測定0D6QQ(以未接菌的YPD 培養(yǎng)液做空白)，最大0D,值下的pH即為最適生長pH。由圖5可知，最適培養(yǎng)溫度為30°C。(4)最適搖床轉(zhuǎn)速的確定取處于對數(shù)生長期的菌懸液，以2%接種量轉(zhuǎn)接到50mLYPD液體培養(yǎng)基中，在最 適生長溫度、最適生長 pH 下，分別在 110r/min、130r/min、150r/min、170r/min、190r/min、 210r/min下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后取菌液測定0D_(以未接菌的YPD培養(yǎng)液做空白對照)， 最大0D_值下的搖床轉(zhuǎn)速可以得到最適搖床轉(zhuǎn)速。由圖6可知，最適搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。5、菌株S8的耐受性試驗(1)菌株對S02的耐受性取處于對數(shù)生長期的菌懸液，以相同接種量分別接種于S02添加量為350mg/L， 400mg/L，450mg/L，500mg/L、550mg/L、600mg/L 的 50mL YPD 液體培養(yǎng)基中，30°C，150r/min 下振蕩培養(yǎng)24h，取菌液測定0D_ (以未接菌的YPD培養(yǎng)液做空白對照)，確定菌株對S02的 耐受性。由圖7可知，菌株最大耐S02濃度為450mg/L。(2)菌株對酒精度的耐受性取處于對數(shù)生長期的菌懸液，以相同接種量分別轉(zhuǎn)接入無水乙醇含量分別為2%、 4%,5%,6%,8%U0% (v/v)的 50mL YPD 液體培養(yǎng)基中，30°C，150r/min 下振蕩培養(yǎng) 24h， 取菌液測定0D_(以未接菌的YPD培養(yǎng)液做空白對照)，確定菌株對酒精的耐受性，由圖8 可知，菌株最大耐酒精度為5%。
權(quán)利要求
一種能同時降解果酒中蘋果酸和檸檬酸菌株的篩選方法，其特征在于降解果酒中蘋果酸和檸檬酸的有效菌為伊薩酵母屬(Issatchenkia)的陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola)種，具體的篩選方法如下采集葡萄園土壤2g定量加到盛有100mL無菌生理鹽水的三角瓶中，并加入8～12粒無菌玻璃珠，充分振蕩后靜置，取上清液再分別加入到以濃度為2g/L的蘋果酸為唯一碳源的液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃，150r/min，搖床振蕩培養(yǎng)，以24h為一個周期，每個周期結(jié)束后，按照以上的操作，依次將所培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接入新鮮的富集培養(yǎng)基中，同時蘋果酸濃度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐漸遞增到10g/L；再通過初篩和復(fù)篩后選出對蘋果酸具有較好降酸效果的菌株；將篩選得到的降酸菌——陸生伊薩酵母用平板劃線法進(jìn)行多次分離純化后，挑取單菌落接入到Y(jié)PD斜面培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)24h后4℃保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所示的一種能同時降解果酒中蘋果酸和檸檬酸菌株的篩選方法， 其特征在于所述的初篩過程如下在富集培養(yǎng)后取一定量的富集菌液，用生理鹽水稀釋到 10_5，選擇10_3、10_4、10_5稀釋度，分別吸取0. 5mL稀釋液涂布于含酒石酸濃度為10g/L的瓊 脂平板培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)72h。將所得的典型單菌落點植于分離培養(yǎng)基上，相同條件 下培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所示的一種能同時降解果酒中蘋果酸和檸檬酸菌株的篩選方法，其 特征在于所述的復(fù)篩過程如下將初篩所得到的單菌落用平板劃線法進(jìn)行多次分離純化， 挑取單菌落接入YEPD斜面培養(yǎng)基于28°C培養(yǎng)72h后4°C保存。
4.一種菌株——陸生伊薩酵母在降解果酒中蘋果酸及檸檬酸的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能同時降解果酒中蘋果酸和檸檬酸菌株的篩選方法及應(yīng)用，其特征在于具體的篩選方法如下采集葡萄園土壤2g定量加到盛有100mL無菌生理鹽水的三角瓶中，并加入8～12粒無菌玻璃珠，充分振蕩后靜置，取上清液再分別加入到以濃度為2g/L的蘋果酸為唯一碳源的液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃，150r/min，搖床振蕩培養(yǎng)，以24h為一個周期，每個周期結(jié)束后，按照以上的操作，依次將所培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接入新鮮的富集培養(yǎng)基中，同時蘋果酸濃度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐漸遞增到10g/L；再通過初篩和復(fù)篩后選出對蘋果酸具有較好降酸效果的菌株；具有較高的降酸率，并且能夠耐受較高濃度的SO2，發(fā)酵溫度適宜。且降解率達(dá)80％以上，并且該菌株耐受SO2濃度達(dá)450mg/L，最適培養(yǎng)溫度為30℃，發(fā)酵溫度適中。
文檔編號C12N1/16GK101870955SQ20101020206
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者文連奎, 王治國, 王立芳, 王貴珍 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)