專利名稱：：紫色葉脈融合基因及其作為可視篩選標(biāo)記基因在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用的制作方法紫色葉脈融合基因及其作為可視篩選標(biāo)記基因在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體地說是用擬南芥的葉脈特異性VS啟動(dòng)子與番茄花氰苷合成途徑的調(diào)節(jié)基因構(gòu)建PL2融合基因及其作為可視篩選標(biāo)記基因在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用重組DNA技術(shù)將克隆的優(yōu)良目的基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，并在其中進(jìn)行表達(dá)，從而使植物獲得新的性狀。轉(zhuǎn)基因作物可提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，提高植物中有益成分的含量，改變植物的顏色，減少除草劑、殺蟲劑等農(nóng)藥的使用量等，并節(jié)省大量人力，因而給人類社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。但同時(shí)轉(zhuǎn)基因植物的安全性也在全球范圍內(nèi)引起了激烈的爭論與普遍關(guān)注，其中由于目前的轉(zhuǎn)基因技術(shù)常通過使用抗抗生素類或抗除草劑類選擇性篩選標(biāo)記來進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的篩選，這些選擇性篩選標(biāo)記基因最終會(huì)與目的基因一同整合到植物的基因組中，成為影響轉(zhuǎn)基因植物安全性的主要因素之一。解決轉(zhuǎn)基因植物中抗性標(biāo)記基因安全性問題有兩個(gè)途徑(1)轉(zhuǎn)化時(shí)仍使用抗性標(biāo)記基因，獲得轉(zhuǎn)基因植物以后，再將其基因組中的抗性標(biāo)記基因刪除。但這種方法步驟繁瑣、獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的周期較長；(2)發(fā)展安全性標(biāo)記基因用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，而利用顏色作為安全性可視篩選標(biāo)記將是一個(gè)很有前景的研究方向。另一方面，各國在世界貿(mào)易活動(dòng)中為保證本國經(jīng)濟(jì)利益不被侵害，對轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品的檢測是必不可少的。同樣，在對轉(zhuǎn)基因生物安全管理過程中，是否發(fā)生基因漂移等是生態(tài)環(huán)境安全檢測的一個(gè)重要方面。目前這些方面的檢測多使用轉(zhuǎn)基因成分分析方法，主要有DNA檢測法和蛋白質(zhì)檢測法兩類(楊建霞，2004)。此外，基因芯片技術(shù)已開始應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物的檢測。而這些方法無疑都需要投入較大的人力物力成本。如果能在轉(zhuǎn)基因植物中引入安全、持久、可視的篩選標(biāo)記，將可以利用顯著可視的性狀直接區(qū)分轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物，以及判斷是否發(fā)生基因漂移等，將可以大大降低轉(zhuǎn)基因生物安全檢測的投入和成本。在整個(gè)植物界幾乎所有的植物的葉片都表現(xiàn)出綠色，而花和果實(shí)則呈現(xiàn)出五顏六色，這和植物的葉片、花、果實(shí)中的色素成分以及含量不同有關(guān)，葉綠素在葉片中占主導(dǎo)地位，而在花和果實(shí)中，花氰苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過葉綠素，從而賦予植物花和果實(shí)各種各樣的顏色?；ㄇ柢帐腔ㄇ嗨嘏c各種單糖結(jié)合而形成的黃酮多酚類化合物。它是植物合成的一類次生代謝物，能控制植物從紅到紫甚至是藍(lán)的一系列變化，主要積累在植物表皮細(xì)胞的液泡內(nèi)。前期研究表明，一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對植物花氰苷的合成具有調(diào)控作用。例如=Elomaa等(Elomaaetal.,2003)將大丁草轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因GMYBlO置于CaMV35S啟動(dòng)子之下轉(zhuǎn)入煙草中，轉(zhuǎn)基因植株徑、葉、花萼、花粉囊、子房壁均較對照積累大量花色素苷，顏色發(fā)生改變。Quattrocchio等(Quattrocchioetal.，1999)將玉米的Cl和Lc基因轉(zhuǎn)入矮牽牛之后，得到紅色的愈傷組織和粉紅色花冠。這些結(jié)果表明花氰苷合成的控制因子可以異源發(fā)揮對花氰苷合成的調(diào)控作用。組織或器官特異性啟動(dòng)子能夠調(diào)控目的基因在特定的組織或器官表達(dá)，在植物基因工程技術(shù)中，可以利用組織或器官特異性啟動(dòng)子有針對性地、特異、高效地調(diào)控目的基因的表達(dá)。葉脈位于植物地上部的葉片內(nèi)，由貫穿在葉肉內(nèi)的維管組織組成，是葉的輸導(dǎo)和支4持結(jié)構(gòu)。我們設(shè)想如果獲得能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在葉脈中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，在植物基因工程技術(shù)中利用此類啟動(dòng)子有針對性地在葉脈中特異性表達(dá)導(dǎo)致或促進(jìn)花氰苷合成的關(guān)鍵基因，則可以將因花氰苷的特異性積累所呈現(xiàn)的葉脈顏色變化特征(如紫色葉脈)，作為植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的一種可視性篩選標(biāo)記。據(jù)此建立的新型植物轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，不但能夠解決傳統(tǒng)的篩選標(biāo)記可能給轉(zhuǎn)基因植物帶來的安全性問題，還可以把這種可視的篩選標(biāo)記應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全等檢測工作中，以是否具有有色葉脈作為轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物的區(qū)分標(biāo)記，簡單易行，將大大降低轉(zhuǎn)基因植物檢測的成本，勢必在轉(zhuǎn)基因植物新品種的實(shí)際應(yīng)用過程中發(fā)揮巨大作用。此外，花氰苷屬于類黃酮類化合物，也屬于多酚類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的清除氧自由基、抗氧化功能(林曉霞等，2005)，具有提高植物抗逆性的作用。同時(shí)，花氰苷作為一種天然抗氧化成分物質(zhì)，也是人類食品與健康研究中的熱點(diǎn)。大量的流行病學(xué)研究證明食物中的花氰苷對人類許多疾病有預(yù)防和治療作用，例如研究證明花色素苷有降低冠狀動(dòng)脈心臟病發(fā)病率的作用(丁銳，2004)；又如在番茄果實(shí)中特異性表達(dá)金魚草的花氰苷合成調(diào)控基因Del和R0S1，可以使番茄果實(shí)內(nèi)積累高水平的花氰苷，以這種積累花氰苷的紫色番茄飼喂易患癌小鼠(Trp53-/-)，能夠顯著延長小鼠的生命(Butellietal.，2008)。因此，適度積累花氰苷還可以提高轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。綜上所述，基于花氰苷積累調(diào)控所產(chǎn)生的可視性顏色變化，無論作為植物轉(zhuǎn)化過程中的一種安全性篩選標(biāo)記還是作為一種轉(zhuǎn)基因植物的可視檢測標(biāo)記，都具有很高的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)又可以使轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)積累一定量的抗氧化成分-花氰苷，達(dá)到了一舉三得的理想結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是利用擬南芥的葉脈特異性VS啟動(dòng)子和番茄花氰苷合成途徑的調(diào)節(jié)基因構(gòu)建融合基因，用作植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的可視性篩選標(biāo)記基因。本發(fā)明所述的葉脈特異性啟動(dòng)子(vein-specificpromoter)，簡稱VS啟動(dòng)子是我們以一個(gè)擬南芥多器官表達(dá)基因的啟動(dòng)子改造創(chuàng)制的一種維管束特異性啟動(dòng)子，它能驅(qū)動(dòng)目的基因在不同植物的葉脈中特異性表達(dá)。本發(fā)明利用該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)控制花氰苷合成的相關(guān)基因在葉脈中特異性表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因植物的葉脈呈現(xiàn)出紫色。利用本發(fā)明提供的融合基因進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化時(shí)，可以紫色葉脈作為轉(zhuǎn)基因植物的篩選標(biāo)記，使轉(zhuǎn)基因植物的篩選達(dá)到了可視化，與傳統(tǒng)的抗生素抗性篩選方法相比，具有操作簡便、低成本、安全可視，且無需進(jìn)行后續(xù)的標(biāo)記刪除等優(yōu)點(diǎn)，對于解決傳統(tǒng)的抗性標(biāo)記基因可能帶來的潛在的安全性問題具有重要意義。同時(shí)由于VS啟動(dòng)子的活性在葉片發(fā)育過程中特異、穩(wěn)定、持久，其驅(qū)動(dòng)葉脈中花氰苷的合成具有穩(wěn)定性，不會(huì)隨葉齡的增加而消減，在植物生長發(fā)育的大部分時(shí)期都可以利用是否具有紫色葉脈作為轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物的區(qū)分標(biāo)記。這將為轉(zhuǎn)基因植物推廣種植過程中的環(huán)境安全檢測帶來極大的便利，工作人員可以直接從植物葉脈的顏色來判斷出是否是轉(zhuǎn)基因植物，這無疑將節(jié)省大量的人力、物力和財(cái)力，大大降低了轉(zhuǎn)基因植物檢測的成本。本發(fā)明提供了一種新的紫色葉脈融合基因，其核酸序列如序列表1所示。本發(fā)明是利用擬南芥的葉脈特異性啟動(dòng)子簡稱VS啟動(dòng)子和番茄花氰苷合成途徑調(diào)節(jié)基因構(gòu)建而成，將其命名為PL2融合基因(來自purpleleaf首字母)。本發(fā)明還包括與上述核酸序列有85%以上的同源性的核酸分子。利用本發(fā)明所述方法，還可以將任意葉脈或維管束特異性啟動(dòng)子與導(dǎo)致或促進(jìn)紫色產(chǎn)生的功能基因融合，獲得可使轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生紫色葉脈的融合基因。本發(fā)明同時(shí)提供了一種所述的紫色葉脈融合基因作為可視的安全篩選標(biāo)記基因在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用，即利用該融合基因作為可視篩選標(biāo)記基因進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化，可使轉(zhuǎn)基因植物的葉脈呈現(xiàn)紫色，將其作為可視篩選標(biāo)記，可獲得陽性的轉(zhuǎn)基因植物。同時(shí)，是否具有紫色葉脈也可以作為轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物的可視區(qū)分標(biāo)記，大幅度降低對轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全檢測相關(guān)的檢測成本。作為具體應(yīng)用的實(shí)例，本發(fā)明提供了這種紫色葉脈融合基因的一種構(gòu)建方法以及作為可視篩選標(biāo)記基因在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用。操作過程如下所述應(yīng)用中的PL2融合基因的構(gòu)建方法，包括如下步驟第一、以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增VS啟動(dòng)子部分，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行TA克隆；第二、用KpnI/BglII雙酶切上述第一步所獲得的含有VS啟動(dòng)子的TA克隆質(zhì)粒和pCAMBIA1301質(zhì)粒，分別回收啟動(dòng)子片段和大的載體片段；第三、將上述兩個(gè)片段混合，在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得中間構(gòu)建“VS啟動(dòng)子-GUS”融合基因；第四、以番茄基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增PL2融合基因結(jié)構(gòu)基因部分，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行TA克?。坏谖?、用SalI/BstEII雙酶切上述第四步所獲得的含有PL2融合基因結(jié)構(gòu)基因的TA克隆質(zhì)粒和上述第三步所獲得的含有“VS啟動(dòng)子-GUS”融合基因的中間構(gòu)建質(zhì)粒，分別回收該結(jié)構(gòu)基因片段和大的載體片段；第六、將上述上述第五步回收的兩個(gè)片段混合，在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)，完成在pCAMBIA1301(購自CAMBIA公司，是目前常用的商品化載體)載體上的PL2融合基因的構(gòu)建。其中所設(shè)計(jì)的VS啟動(dòng)子部分的PCR擴(kuò)增引物如下，其中上游引物引入KpnI酶切位點(diǎn)，下游引物引入BglII和SalI酶切位點(diǎn)上游引物5，-GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3，下游引物5，-AGATCTGTCGACATTTGCTGTGTCAATTCTCACTTC-3，所設(shè)計(jì)的PL2融合基因結(jié)構(gòu)基因部分的PCR擴(kuò)增引物如下，上游引物引入SalI酶切位點(diǎn)，下游引物引入BstEII酶切位點(diǎn)上游引物5，-GTCGACCATGAACAGTACATCTATGTCTTCAT-3，下游引物5，-GGTCACCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3，所述應(yīng)用中的PL2融合基因在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用，操作過程如下用PL2融合基因轉(zhuǎn)化微型番茄Micro-Tom用普通YEP液體培養(yǎng)基培養(yǎng)帶有PL2融合基因的農(nóng)桿菌，至0D_為1.0左右離心收集菌體，然后用同體積的液體MS培養(yǎng)基(含lOOmmol/L乙酰丁香酮)重新懸浮菌體；取微型番茄Micro-Tom無菌幼苗的葉片，在上述菌液中侵染10分鐘，然后放至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天；將上述外植體移至脫菌培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)3天，移至不定芽分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)生芽，利用紫色葉脈作為可視標(biāo)記篩選出陽性芽；當(dāng)陽性芽長至約2厘米高時(shí)轉(zhuǎn)入不定根分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根；將生根較好的植物移土培養(yǎng)至開花結(jié)實(shí)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明利用擬南芥的VS啟動(dòng)子與番茄花氰苷合成途徑的調(diào)節(jié)基因構(gòu)建了PL2融合基因；將該融合基因轉(zhuǎn)化植物，以紫色葉脈作為可視標(biāo)記，篩選出陽性轉(zhuǎn)基因植株，并且此紫色葉脈的表型在轉(zhuǎn)基因植株的生長發(fā)育過程中穩(wěn)定持久。該融合基因與傳統(tǒng)的抗抗生素或抗除草劑等抗性基因相比，具有安全、可視的優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)的安全性標(biāo)記基因相比，具有持久、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。該融合基因作為安全可視的篩選標(biāo)記基因應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，不僅避免了使用傳統(tǒng)選擇標(biāo)記基因可能帶來的食品安全和環(huán)境安全等方面的潛在危險(xiǎn)，而且避免了使用常用的安全性標(biāo)記基因可能出現(xiàn)的不穩(wěn)定、易沉默等問題，使轉(zhuǎn)基因植物的檢測更加方便、快捷。將紫色葉脈作為可視標(biāo)記應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全等檢測工作中，還可以大大降低檢測的成本。因此，本發(fā)明必將為植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用提供強(qiáng)有力的支持。圖1是PL2融合基因在微型番茄轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用，目的基因?yàn)槌泵顾乜剐曰騢pt。圖Ia轉(zhuǎn)化后誘導(dǎo)生芽階段，具有紫色葉脈的轉(zhuǎn)化芽在含潮霉素的生芽培養(yǎng)基上旺盛生長；圖Ib具有紫色葉脈的轉(zhuǎn)化芽經(jīng)持續(xù)生長、誘導(dǎo)生根后的生長情況；圖Ic具有紫色葉脈的轉(zhuǎn)化芽經(jīng)誘導(dǎo)生根后移土生長初期，轉(zhuǎn)基因植株的葉片葉脈紫色清晰可見；圖Id:野生型誘導(dǎo)芽(非轉(zhuǎn)化芽)只能在不含潮霉素的生芽培養(yǎng)基上生長，可以看到非轉(zhuǎn)化芽不具有紫色葉脈的表型；圖Ie轉(zhuǎn)基因植株移土生長后期，可以觀察到由具有紫色葉脈的轉(zhuǎn)化芽長成的轉(zhuǎn)基因植株在土培生長過程中，紫色持續(xù)存在于葉脈，植株生長發(fā)育正常。圖If野生型植株移土后的生長情況，不具有紫色葉脈的表型。圖2是PL2融合基因轉(zhuǎn)基因微型番茄植株的PCR鑒定；泳道M:plus2000Marker；泳道1用野生型番茄的基因組DNA為模板的負(fù)對照；泳道2-5:PL2融合基因轉(zhuǎn)基因番茄植株的基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物。泳道6:PL2融合基因質(zhì)粒為模板的PCR的正對照；泳道7=H2O為模板的PCR的負(fù)對照。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:PL2融合基因的VS啟動(dòng)子的克隆第一、以擬南芥基因組DNA為模板利用PCR方法擴(kuò)增1109bp的VS啟動(dòng)子，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行TA克隆。(I)PCR擴(kuò)增目的片段根據(jù)擬南芥的VS啟動(dòng)子區(qū)的序列設(shè)計(jì)特異引物，在上游引物中引入KpnI酶切位點(diǎn)，在下游引物中引入BglII和SalI酶切位點(diǎn)。上游引物5，GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3’(引入KpnI切點(diǎn))下游引物5’-AGATCTGTCGACATTTGCTGTGTCAATTCTCACTTC-3’(引入BglII和SalI切點(diǎn))按常規(guī)方法提取擬南芥基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備VS啟動(dòng)子片段。PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)程序94°C5分鐘；94"C30秒，60°C1分30秒，30個(gè)循環(huán)；72"C10分鐘；4°C保溫。(2)目的片段的克隆和陽性克隆的鑒定①目的片段的回收通過瓊脂糖凝膠電泳回收目的DNA片段，回收方法采用大連寶生物(TaKaRa)公司的DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒，具體操作步驟見商品說明書。②連接加入下列反應(yīng)體系的試劑，16°C反應(yīng)過夜，實(shí)現(xiàn)目的片段與pGEM-T-Easy(購自Promega公司)載體的連接。③轉(zhuǎn)化和陽性克隆的鑒定按常規(guī)的CaCl2誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化方法，制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，然后均勻涂布到含有Amp、X-gal和IPTG的平板上，37°C倒置培養(yǎng)12-14小時(shí)。挑選轉(zhuǎn)化平板上的白色菌落，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，用KpnI和BalII雙酶切，產(chǎn)生3kb的pGEM-T-Easy載體片段和包含PL2融合基因的VS啟動(dòng)子的1109bp片段。按前面所述的PCR引物和擴(kuò)增條件，以質(zhì)粒提取物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)生1109bp的VS啟動(dòng)子片段，即為含有該啟動(dòng)子序列的陽性克隆。④測序驗(yàn)證經(jīng)過鑒定的陽性克隆，送交菌穿刺培養(yǎng)物到Sangon(上海生工生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行DNA測序。實(shí)施例2以實(shí)施例1所克隆的VS啟動(dòng)子替代pCAMBIA1301載體上的CaMV35S啟動(dòng)子，獲得中間構(gòu)建“VS啟動(dòng)子-GUS”融合基因(1)從大腸桿菌中提取載體質(zhì)粒pCAMBIA1301(購自CAMBIA公司)，用KpnI/BglII雙酶切后回收大的載體片段(其中包含有GUS報(bào)告基因序列)。(2)從實(shí)施例1所制備的TA克隆中提取質(zhì)粒，用KpnI/BglII雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳回收(同實(shí)施例Dvs啟動(dòng)子片段。(3)將上述2個(gè)片段在連接酶催化下于16°C連接過夜，完成pCAMBIA1301載體上的“VS啟動(dòng)子-GUS”融合基因構(gòu)建。連接體系(4)用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，方法同實(shí)施例1。(5)挑選轉(zhuǎn)化平板(Kan抗性)上的白色菌落，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，用KpnI和BstEII雙酶切質(zhì)粒DNA產(chǎn)生兩個(gè)片段，一個(gè)是8979bp的pCAMBIA1301載體片段，另一個(gè)是3179bp的‘‘VS啟動(dòng)子-GUS”融合基因。(6)以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，鑒定質(zhì)粒中的‘‘VS啟動(dòng)子-GUS”融合基因，擴(kuò)增片段的大小是1405bp。所用引物如下上游引物5，-GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3，下游引物5，-TCGCGATCCAGACTGAATGCC-3，(7)經(jīng)過酶切和PCR鑒定的陽性克隆，送交測序公司測序。實(shí)施例3:PL2融合基因的結(jié)構(gòu)基因的克隆根據(jù)番茄花氰苷合成途徑調(diào)節(jié)基因cDNA的序列信息設(shè)計(jì)特異引物，在5’端分別引入SalI和BstEII酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物的大小應(yīng)是825bp。上游引物5，-GTCGACCATGAACAGTACATCTATGTCTTCAT-3，下游引物5，-GGTCACCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3，按常規(guī)方法提取番茄基因組DNA，以基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增PL2融合基因的結(jié)構(gòu)基因，然后用PUCm-T載體進(jìn)行TA克隆。PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件、目的片段的回收、克隆和測序，同實(shí)施例1。實(shí)施例4在pCAMBIA1301載體上構(gòu)建PL2融合基因(1)提取實(shí)施例2制備的含有“VS啟動(dòng)子-GUS”融合基因的質(zhì)粒，用Sall/BstEII雙酶切后回收大的載體片段(其中不含有GUS報(bào)告基因序列)。(2)從實(shí)施例3所制備的TA克隆中提取質(zhì)粒，用SalI/BstEII雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳回收(同實(shí)施例1)PL2融合基因結(jié)構(gòu)基因片段。(3)將上述2個(gè)片段在連接酶催化下于16°C連接過夜，完成pCAMBIA1301載體上的PL2融合基因構(gòu)建。連接體系及轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法同實(shí)施例2。(4)挑選轉(zhuǎn)化平板(Kan抗性)上的白色菌落，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，用KpnI和BstEII雙酶切質(zhì)粒DNA產(chǎn)生兩個(gè)片段，一個(gè)是8979bp的pCAMBIA1301載體片段，另一個(gè)是1933bp的PL2融合基因。(6)以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，鑒定質(zhì)粒中的PL2融合基因，擴(kuò)增片段的大小是1933bp。所用引物如下上游引物5，-GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3，下游引物5，-GGTCACCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3，(7)經(jīng)過酶切和PCR鑒定的陽性克隆，送交測序公司測序，其核酸序列如序列表1所示。(8)從陽性克隆中提取質(zhì)粒，用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，獲得工程化農(nóng)桿菌，用于植物轉(zhuǎn)化。實(shí)施例5:PL2融合基因在微型番茄轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用(1)以實(shí)施例4制備的PL2融合基因轉(zhuǎn)化微型番茄Micro-Tom，以pCAMBIA1301載體上所帶有的潮霉素抗性基因hpt為轉(zhuǎn)化的目的基因，檢測PL2融合基因作為可視篩選標(biāo)記基因的可行性和實(shí)用性。具體轉(zhuǎn)化方法采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Meissner，1997)，轉(zhuǎn)化過程中既有具有紫色葉脈的芽產(chǎn)生，也有不具有紫色葉脈的芽產(chǎn)生，但是經(jīng)過10mg/L潮霉素抗性篩選后，不具有紫色葉脈的芽全部被篩死，而具有紫色葉脈的芽全部具有潮霉素抗性，能在含潮霉素抗性培養(yǎng)基上持續(xù)旺盛生長(圖la)，說明為hpt基因的轉(zhuǎn)化芽。將這些具有紫色葉脈的轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根(圖lb)，隨后移土培養(yǎng)至開花結(jié)實(shí)。可以觀察到由具有紫色葉脈的轉(zhuǎn)化芽長成的轉(zhuǎn)基因植株在土培生長過程中，葉脈紫色持續(xù)存在，植株生長發(fā)育正常(圖Ic和Ie)。(2)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測分別剪取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的葉片，參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》(黃培堂等，2002)方法提取葉片基因組DNA，用如下引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系同實(shí)施例1:上游引物5，-GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3，下游引物5，-GGTCACCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3，然后PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)1933bp的PL2融合基因條帶，非轉(zhuǎn)基因植株未出現(xiàn)融合基因條帶，證明目的片段已整合到植物基因組中(見圖2)(3)PL2融合基因在轉(zhuǎn)基因微型番茄的生長發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)被含有PL2融合基因的農(nóng)桿菌侵染的微型番茄外植體在誘導(dǎo)生芽培養(yǎng)基上，既有具有紫色葉脈的芽產(chǎn)生，也有不具有紫色葉脈的芽產(chǎn)生，但是經(jīng)過抗生素篩選后，不具有紫色葉脈的芽全部被篩死，而具有紫色葉脈的芽全部是有抗性的，具有紫色葉脈的芽被誘導(dǎo)生根后，葉脈的紫色略有減弱但仍清晰可見(圖lb)，移土后植株生長發(fā)育正常，成熟葉片的葉脈呈現(xiàn)穩(wěn)定的淡紫色(圖Ic和Ie)。這充分證明了用帶有PL2融合基因的載體轉(zhuǎn)化植物時(shí)，以紫色葉脈作為轉(zhuǎn)基因植物的可視篩選標(biāo)記的可行性和實(shí)用性。本發(fā)明利用擬南芥的葉脈特異性VS啟動(dòng)子與番茄花氰苷合成途徑的調(diào)節(jié)基因構(gòu)建了PL2融合基因；以PL2融合基因作為植物轉(zhuǎn)化的可視篩選標(biāo)記基因，與傳統(tǒng)的安全性標(biāo)記基因相比，具有持久、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。該融合基因作為安全可視的篩選標(biāo)記，不僅避免了使用傳統(tǒng)選擇標(biāo)記可能帶來的食品安全和環(huán)境安全等方面的潛在危險(xiǎn)，而且避免了使用常用的安全性標(biāo)記可能出現(xiàn)的不穩(wěn)定、易沉默等問題，使轉(zhuǎn)基因植物的檢測更加方便、快捷。將10紫色葉脈作為可視標(biāo)記應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全等檢測工作中，還可以大大降低檢測的成本。因此，本發(fā)明必將為植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用提供強(qiáng)有力的支持。參考文獻(xiàn)丁銳.國外花色素苷的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展.漢中師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，22:73-78黃培堂，等譯.《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)，北京科學(xué)出版社，2002林曉霞，朱壽民.中藥花色素類成分抗癌研究進(jìn)展.中國中藥雜志，2005，30:1147-1150楊建霞.轉(zhuǎn)基因植物安全性及檢測技術(shù)研究進(jìn)展.甘肅農(nóng)業(yè)，2004，4:34-35AlbaniDL,RobertS，DonaldsonPA,etal.Characterizationofapollen-specificgenefamilyfromBrassicanapuswhichisactivatedduringearlymicrosporedevelopment.PlantMolBiol,2000,15(4)605-622BlumeB，GriersonD.ExpressionofACCoxidasepromoter-gusfusionsintomatoandnicotianaplumbaginifoliaregulatedbydevelopmentalandenvironmentalstimuli.PlantJ，1997，12:731_746ButelliE，TittaL，GiorgioM，etal.Enrichmentoftomatofruitwithhealth-promotinganthocyaninsbyexpressionofselecttranscriptionfactors.NatBiotechnol，2008，26(ll):1301_8EbinumaH，SugitaK，MatsunagaE，etal.Selectionofmarker-freetransgenicplantsusingtheisopentenyltransferasegene.ProcNatlAcadSci，1997，942117-2121ElomaaPiUimariAiMehtoM，etal.ActivationofAnthocyaninBiosynthesisinGerberahybrida(Asteraceae)SuggestsConservedProtein-ProteinandProtein-PromoterInteractionsbetweentheAncientlyDivergedMonocotsandEudicots.PlantPhysiol，2003，133(4):1831_42GoldsbroughAP，LastrellaCN，YoderJI.Transpositionmediatedre-positioningandsubsequenteliminationofmarkergenesfromtransgenictomato.NatBiotechnol，1993，11:1286_1292KumpatlaSP，ChandrasekharanMB，LyerLM，etal.Genomeintruderscanningandmodulationsystemsandtransgenesilencing.TrendsinPlantScience，1998，3(3)97-104LudwigSR，HaberaLF，DellaportaSL，etal.AmemberofthemaizeRgenefamilyresponsiblefortissue-specificanthocyaninproduction,encodesaproteinsimilartotranscriptionalactivatorsandcontainsthemyc-homologyregion.ProcNatlAcadSci，1989，86:7092_7096MeissnerR，JacobsonY，MelamedS，etal.Anewmodelsystemfortomatogenetics.PlantJ,1997，121465-1472NitzI，BerkefeldH，PuzioPS，etal.PyklO,aseedlingandrootspecificgeneandpromoterfromArabidopsisthaiiana.PlantSci，2001，161:337_346QuattrocchioF，WingJ，WoudeKvander，etal.Molecularanalysisoftheanthocyanin2geneofpetuniaanditsroleintheevolutionofflowercolor.PlantCell，1999，11:1433-1444SandhuJS，KrasnyanskiSF，DomierLL，etal.Oralimmunizationofmicewithtransgenictomatofruitexpressingrespiratorysyncytialvirus-Fproteininducesasystemicimmuneresponse.TransgenicRes，2000，9:127_135SinghM，BhallaPL，XuH，etal.Isolationandcharacterizationofafloweringplantmalegameticcell-specificpromoter.FEBSLett，2003，542:47_52TsuchisakaA，TheologisA.UniqueandoverlappingexpressionpatternsamongtheArabidopsisl-Amino-Cyclopropane-I-CarboxylateSynthasegenefamilymembers.PlantPhysiol，2004，136:2982_3000ZubkoE，ScuttC，MeyerP.Intrachromosomalrecombinationbetweenattpregionsasatooltoremoveselectablemarkergenesfromtobaccotransgenes.NatBiotechnol，2000，18442-445.1權(quán)利要求一種紫色葉脈融合基因，簡稱PL2融合基因，其核酸序列如序列表1所示；該融合基因是利用擬南芥的葉脈特異性啟動(dòng)子簡稱VS啟動(dòng)子與番茄花氰苷合成途徑的調(diào)節(jié)基因構(gòu)建而成的。2.一種紫色葉脈融合基因，其特征在于，是與權(quán)利要求1所述核酸序列有85%以上的同源性的核酸分子。3.一種紫色葉脈融合基因，其特征在于，利用如權(quán)利要求1所述方法，將葉脈或維管束特異性啟動(dòng)子與導(dǎo)致或促進(jìn)紫色產(chǎn)生的功能基因融合所獲得的、可使轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生紫色葉脈的融合基因。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫色葉脈融合基因，其特征在于，所設(shè)計(jì)的VS啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增引物如下，其中上游引物中引入KpnI酶切位點(diǎn)，下游引物中引入BglII和SalI酶切位點(diǎn)上游引物5’-GGTACCTCGACGCGTGAGAGTTTCCGGC-3，下游引物5’-AGATCTGTCGACATTTGCTGTGTCAATTCTCACTTC-3’其中上、下游引物所引入酶切位點(diǎn)可根據(jù)所選擇的雙元表達(dá)載體上的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行更換；本發(fā)明所選用雙元表達(dá)載體為PCAMBIA1301，是目前常用的商品化載體。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫色葉脈融合基因，其特征在于，所設(shè)計(jì)的PL2融合基因的結(jié)構(gòu)基因部分的PCR擴(kuò)增引物如下，其中上游引物中引入SalI酶切位點(diǎn)，下游引物中引入BstEII酶切位點(diǎn)上游引物5’-GTCGACCATGAACAGTACATCTATGTCTTCAT-3，下游引物5’-GGTCACCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTCA-3’其中上、下游引物所引入酶切位點(diǎn)可根據(jù)所選擇的雙元表達(dá)載體上的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行更換；本發(fā)明所選用雙元表達(dá)載體為PCAMBIA1301，是目前常用的商品化載體。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫色葉脈融合基因，其特征在于，構(gòu)建PL2融合基因的具體操作步驟如下(1)以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增VS啟動(dòng)子部分，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行TA克??；(2)用KpnI/BglII雙酶切上述(1)步所獲得的含有VS啟動(dòng)子的TA克隆質(zhì)粒和PCAMBIA1301質(zhì)粒，分別回收啟動(dòng)子片段和載體大片段；(3)將上述兩個(gè)片段混合，在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得中間構(gòu)建“VS啟動(dòng)子-GUS”融合基因；(4)以番茄基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增PL2融合基因的結(jié)構(gòu)基因部分，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行TA克?。?5)用SalI/BstEII雙酶切上述(4)步所獲得的含有PL2融合基因結(jié)構(gòu)基因的TA克隆質(zhì)粒和上述(3)步所獲得的含有“VS啟動(dòng)子-GUS”融合基因的中間構(gòu)建質(zhì)粒，分別回收結(jié)構(gòu)基因片段和大的載體片段；(6)將上述(5)步回收的兩個(gè)片段混合，在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)，即完成在PCAMBIA1301載體上的擬南芥VS啟動(dòng)子-番茄花氰苷合成途徑調(diào)節(jié)基因，即PL2融合基因的構(gòu)建。7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的紫色葉脈融合基因作為可視篩選標(biāo)記基因在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用，其特征在于，用帶有PL2融合基因的載體轉(zhuǎn)化植物，用紫色葉脈作為可視篩選標(biāo)記，可獲得含有本發(fā)明融合基因序列及載體上同時(shí)含有的其他目的片段的轉(zhuǎn)基因植物。全文摘要一種紫色葉脈融合基因及其作為可視篩選標(biāo)記基因在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用，具體地說本發(fā)明利用擬南芥葉脈特異性的VS啟動(dòng)子與番茄花氰苷合成途徑的調(diào)節(jié)基因構(gòu)建了融合基因，將其命名為PL2基因，其核酸序列如序列表1所示。該融合基因可以作為一種可視篩選標(biāo)記基因，在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中代替抗生素抗性基因等傳統(tǒng)篩選標(biāo)記基因，以轉(zhuǎn)化芽具有紫色葉脈為特征進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的篩選。與傳統(tǒng)的抗性篩選標(biāo)記相比，具有可視、穩(wěn)定、持久等優(yōu)點(diǎn)。此外，在帶有該可視標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因品種推廣使用后，可以紫色葉脈為標(biāo)記進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物的區(qū)分，將大幅降低轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全檢測的成本。本發(fā)明還提供了該融合基因應(yīng)用于微型番茄轉(zhuǎn)化的實(shí)施例。文檔編號(hào)C12N15/10GK101892224SQ20101020212公開日2010年11月24日申請日期2010年6月18日優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日發(fā)明者黨利潔,李鵬麗,柴文婷,王寧寧,金鳳申請人:南開大學(xué)