專利名稱：：一種glyA基因工程菌構(gòu)建和固定化使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因工程菌構(gòu)建和固定化使用方法，尤其是一種glyA基因工程菌構(gòu)建和固定化使用方法。屬于食品包裝
技術(shù)領(lǐng)域：
。屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：L-絲氨酸雖屬人體非必需氨基酸，但在生物體氨基酸代謝過程中，L-絲氨酸處于氨基酸代謝的中間環(huán)節(jié)，參與多種重要物質(zhì)(如甘氨酸、蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸等氨基酸、嘌呤、胸腺嘧啶類等核酸的堿基、磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂等磷脂)的合成，因此又稱半必需氨基酸。近來，L-絲氨酸作為一種生化試劑和藥劑，在飼料、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及化妝品等行業(yè)中被廣泛的應(yīng)用，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域，被應(yīng)用于配置復(fù)方氨基酸輸液以及營養(yǎng)增補劑，用于合成多種絲氨基酸衍生物，包括抗癌、愛滋病新藥及基因工程用保護(hù)氨基酸等。L-絲氨酸的制備方法主要有蛋白質(zhì)水解提取法、發(fā)酵法、化學(xué)法和酶法。蛋白質(zhì)水解法提取L-絲氨酸操作較為復(fù)雜，需要大量的洗脫液，所得的氨基酸通常是混合型氨基酸，還需要后續(xù)的分離、精制，提取L-絲氨酸后的剩余液往往被浪費，所以該法提取L-絲氨酸不但不經(jīng)濟(jì)，而且會對環(huán)境造成極大的危害。發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸主要是通過傳統(tǒng)的遺傳育種提高菌種產(chǎn)L-絲氨酸的能力。目前，利用發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的菌種產(chǎn)酸率較低，提取率也較低，因而成本高，價格較貴?；瘜W(xué)法合成L-絲氨酸雖然不受原料的限制，可以有多種合成途徑，但合成產(chǎn)物具有消旋性，需要對產(chǎn)物進(jìn)行拆分才能得到L-絲氨酸。所以該法在生產(chǎn)L-絲氨酸中也不常用。酶法生產(chǎn)L-絲氨酸主要是以現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為手段，利用基因工程菌高效特異的表達(dá)基因glyAglyA，即絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因，并利用該基因的表達(dá)產(chǎn)物在體外特定的環(huán)境下對底物進(jìn)行酶學(xué)催化得到目的產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸的一種方法。由于酶促反應(yīng)具有高效、特異、溫和等特點，故一直受到人們的青睞。常見的酶促反應(yīng)主要是利用游離的酶對底物進(jìn)行催化，得到產(chǎn)物后，酶隨分離過程的進(jìn)行而作為殘液排出，未能實現(xiàn)酶的連續(xù)或重復(fù)使用，造成了成本的增加并對環(huán)境產(chǎn)生了不利的影響。因此，本發(fā)明擬從構(gòu)建高效的工程菌入手，通過固定化技術(shù)解決酶的重復(fù)利用的問題。固定化技術(shù)的研究和應(yīng)用起源于二十世紀(jì)60年代，包括細(xì)胞固定化技術(shù)和酶固定化技術(shù)。酶固定化技術(shù)是通過物理或化學(xué)的方法將酶連接在一定的固相載體上成為固定化酶，從而發(fā)揮催化作用。固定化后的酶在保持酶原有催化活性的同時，又可以同一般催化劑一樣能回收和反復(fù)使用，不僅減少了分離的困難，而且實現(xiàn)了酶生產(chǎn)工藝上連續(xù)化和自動化，滿足了工業(yè)化生產(chǎn)的需要。細(xì)胞固定化技術(shù)是將完整的細(xì)胞連接在固相載體上，免去破碎細(xì)胞提取酶的程序，保持了酶的完整性和活性的穩(wěn)定。一般來說，固定化細(xì)胞制備的成本比固定化酶低。隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，作為固定化的對象已從酶擴展到微生物、動植物細(xì)胞以及各種細(xì)胞器。1973年，日本的千田一朗博士首次在工業(yè)上成功地應(yīng)用固定化微生物細(xì)胞連續(xù)生成L一天冬氨酸。進(jìn)入20世紀(jì)80年代，固定化技術(shù)發(fā)展到了固定化活細(xì)胞，利用固定化活細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品。
發(fā)明內(nèi)容要解決的問題本發(fā)明的目的是從構(gòu)建高效的工程菌入手，通過固定化技術(shù)解決酶法生產(chǎn)L-絲氨酸中酶的重復(fù)利用的問題。技術(shù)方案本發(fā)明的一種基因工程菌，其保藏編號中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCCNO:M209295。保藏日期2009年12月7日，該培養(yǎng)物的存活性本保藏中心于2009年12月10日檢測完畢，結(jié)果為存活。培養(yǎng)物名稱及注明的鑒別特征大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a(+)-glyA，EscherichiacoliBL21(DE3)/pET28a(+)-glyA。該培養(yǎng)物的存活性本保藏中心于2009年12月10日檢測完畢，結(jié)果為存活，菌落菌落邊緣整齊，表面具有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，革蘭氏染色為陰性，MViC試驗為"+、+、-、-"。上述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其中，包括如下步驟1)設(shè)計引物；根據(jù)genbank中提供的E.colik_12glyA的結(jié)構(gòu)基因的序列(GenBank:AAC75604.1)，利用DNAclub軟件設(shè)計引物，引物序列為primer1:GATCCATGGTAAAGCGTGAAATGAACAT(劃線處為Ncol酶切位點)，Primer2:CCCAAGCTTTTATGCGTAAACCGGGTAA(劃線處為HindIII酶切位點)；2)培養(yǎng)大腸桿菌E.colik-12到對數(shù)期，用試劑盒(購自Generay公司)抽提大腸桿菌k-12的基因組；3)根據(jù)設(shè)計的引物以提取的E.colik-12基因組為模板進(jìn)行PCR擴增；4)PCR產(chǎn)物經(jīng)(Nco1、HindIII雙酶切)切回收后連接于表達(dá)載體pET28a(+)(購自Novagen公司)，并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)(購自Novagen公司)；5)隨機挑選IO個不同的轉(zhuǎn)化子，命名為TIT10，這些轉(zhuǎn)化子個數(shù)可以是成千上萬，其遺傳特性都為EscherichiacoliBL21(DE3)/pET28a(+)-glyA，T1-T10只是這成千上萬的轉(zhuǎn)化子中的10個；6)分別在盛有50mL的250mL三角瓶中，于180rpm、37t:培養(yǎng)，進(jìn)入對數(shù)期后用IPTG(P-半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì))誘導(dǎo)3h，測定工程菌逆向酶活，以未轉(zhuǎn)化的宿主菌BL21(DE3)作為對照，比較兩者的酶活；7)挑選出酶活最高的轉(zhuǎn)化子T7，酶活為宿主菌的50IOO倍，并對該工程菌進(jìn)行100次傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如步驟6，該工程菌酶活保持在0.35左右；8)對該工程菌在5L全自動發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度37t:，pH7.O，到達(dá)對數(shù)期后用乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，乳糖終濃度為0.22g/L，再次培養(yǎng)7h后通過離心收集游離細(xì)胞。游離細(xì)胞酶法生產(chǎn)L-絲氨酸的使用方法對離心后的游離細(xì)胞重懸、破碎，利用破細(xì)胞液對底物甘氨酸、甲醛進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化，酶促轉(zhuǎn)化條件甘氨酸22.8mol/L，PLP0.20.4mmol/L，THFA35mmol/L，甲醛813mmol/L，pH:6.08.0。上述步驟1)中g(shù)enebank中E.colik_12glyA的登錄號為GenBank:AAC75604.1。上述步驟3)的擴增條件為5步驟1:94。C，30sec;步驟2:94。C，30sec;步驟3:58。C，45sec;步驟4:72。C，110sec;步驟5:重復(fù)步驟24，循環(huán)2530次步驟6:72。C，延伸300sec。上述步驟7)的培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速200rpm，溫度37°C。上述的基因工程菌的固定化使用方法，其特征在于包括如下步驟1)對轉(zhuǎn)化子T7重新培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，用卡拉膠與明膠復(fù)合載體對其進(jìn)行固定。具體配制過程按比例分別稱取一定量的卡拉膠與明膠(卡拉膠明膠質(zhì)量比為2:33:2)加入到O.1M的磷酸緩沖液中，其終濃度為3-5X，滅菌后冷卻至45-5(TC，然后加入離心后的菌體混勻(菌體終濃度為150-200g/L)，緩慢流加到2%的KC1溶液中，制備成2-3mm的小球，于4t:固定38h。得到固定化細(xì)胞球，也可以說成固定化后細(xì)胞；2)固定化后的固定化細(xì)胞球于4"用13%的戊二醛處理1030min;3)在同一條件下分別測定固定化后工程菌的酶活與游離細(xì)胞的酶活，結(jié)果顯示固定化工程菌的酶活是游離細(xì)胞的73%;4)用固定化后的工程菌與游離細(xì)胞在同樣條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的酶促轉(zhuǎn)化，條件為甘氨酸22.8mol/L，PLP0.20.4mmol/L，THFA35mmol/L，甲醛813mmol/L，pH:6.08.0。結(jié)果顯示，游離細(xì)胞只能做一個批次的轉(zhuǎn)化，而固定化后的工程菌能轉(zhuǎn)化57批次，轉(zhuǎn)化效率為游離細(xì)胞的90%。有益效果具體地說，本發(fā)明的優(yōu)點如下1.本發(fā)明的基因工程菌酶活效率較高，傳代穩(wěn)定。本發(fā)明基因工程菌酶活為宿主菌的50100倍，對該工程菌進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，該工程菌酶活保持穩(wěn)定。該工程菌用于酶法生產(chǎn)L-絲氨酸的甘氨酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)到7080%。2.本發(fā)明的基因工程菌的構(gòu)建和使用方法簡便，其活細(xì)胞便于進(jìn)行固定，固定化方法簡便，轉(zhuǎn)化效率高。用卡拉膠與明膠復(fù)合載體固定后進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的酶促轉(zhuǎn)化時，固定化工程菌的酶活是游離細(xì)胞的73%，轉(zhuǎn)化效率為游離細(xì)胞的90%，而且，游離細(xì)胞只能做一個批次的轉(zhuǎn)化，而固定化后的工程菌能轉(zhuǎn)化5IO批次。達(dá)到了利用固定化活細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)L-絲氨酸產(chǎn)品的目的。3.利用本發(fā)明的固定化技術(shù)，在酶促轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-絲氨酸的過程中可以節(jié)約20-30%的成本。具體實施例方式在同一條件下分三批測定固定化后工程菌的酶活與游離細(xì)胞的酶活，比較酶活的方法采用先測兩者的逆向酶活，然后比較兩者的逆向酶活。逆向酶活測定反應(yīng)液中含50mmol/LD-苯基絲氨酸、0.5mmol/LPLP、0.lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)，分別加入lml0D6。。=1工程菌懸液或相應(yīng)的固定化細(xì)胞，3(TC振蕩反應(yīng)30min，離心所得上清適當(dāng)稀釋后于279nm處測定吸光值。結(jié)果如表1:6表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果顯示固定化酶的酶活是游離細(xì)胞的73%。用固定化后的工程菌進(jìn)行7個批次的酶促轉(zhuǎn)化，游離細(xì)胞在同樣條件下對應(yīng)進(jìn)行一個批次的轉(zhuǎn)化，并進(jìn)行比較，轉(zhuǎn)化條件在1000L的不銹鋼轉(zhuǎn)化罐中，甘氨酸投料為170kg，離心后的菌體為60kg或相應(yīng)的固定化細(xì)胞，PLP為20g，THFA為400g，甲醛177kg，pH控制6.08.0，溫度控制3742"，轉(zhuǎn)速80130rpm。結(jié)果如表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果顯示固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率為游離細(xì)胞的89%。在第8IO個批次時，固定化細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)化率略有下降。IO個批次以后固定化細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)化率大幅下降?；蚬こ叹臉?gòu)建方法實施例1包括如下步驟1)設(shè)計引物；根據(jù)genbank中提供的E.colik_12glyA的結(jié)構(gòu)基因的序列GenBank:AAC75604.1(利用DNAclub軟件)設(shè)計引物，引物序列為primer1:GATCCATGGTAAAGCGTGAAATGAACAT(劃線處為Ncol酶切位點)，Primer2:CCCAAGCTTTTATGCGTAAACCGGGTAA(劃線處為HindIII酶切位點)；2)培養(yǎng)大腸桿菌E.colik-12到對數(shù)期，用試劑盒(購自Generay公司)抽提大腸桿菌k-12的基因組；3)根據(jù)設(shè)計的引物以提取的E.colik-12基因組為模板進(jìn)行PCR擴增；4)PCR產(chǎn)物經(jīng)(Nco1、HindIII雙酶切)切回收后連接于表達(dá)載體pET28a(+)(購自Novagen公司)，并轉(zhuǎn)化BL21(DE3(購自Novagen公司)；5)隨機挑選10個不同的轉(zhuǎn)化子，命名為TlT10。這些轉(zhuǎn)化子個數(shù)可以是成千上萬，其遺傳特性都為EscherichiacoliBL21(DE3)/pET28a(+)-glyA，T1-T10只是這成千上萬的轉(zhuǎn)化子中的IO個；6)分別在盛有50mL的250mL三角瓶中，于180rpm、37t:培養(yǎng)，進(jìn)入對數(shù)期后用IPTG(P-半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì))誘導(dǎo)3h，測定工程菌逆向酶活，以未轉(zhuǎn)化的宿主菌BL21(DE3)作為對照，比較兩者的酶活；7)挑選出酶活最高的轉(zhuǎn)化子T7，酶活為宿主菌的50100倍，并對該工程菌進(jìn)行100次傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如步驟6，該工程菌酶活保持在0.35左右；8)對該工程菌在5L全自動發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度37。C，pH7.O，到達(dá)對數(shù)期后用乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，乳糖終濃度為0.22g/L，再次培養(yǎng)7h后通過離心收集游離細(xì)胞?；蚬こ叹墓潭ɑ瘜嵤├?包括如下步驟1)對轉(zhuǎn)化子T7重新培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，用卡拉膠與明膠復(fù)合載體對其進(jìn)行固定。具體配制過程按比例分別卡拉膠明膠質(zhì)量比為2:3加入到0.1M的磷酸緩沖液中，其終濃度為5X，滅菌后冷卻至45t:，然后加入離心后的菌體混勻(菌體終濃度為150g/L)，緩慢流加到2%的KC1溶液中，制備成2-3mm的小球，于4°C固定3h。得到固定化細(xì)胞球，也可以說成固定化后細(xì)胞；2)固定化后的固定化細(xì)胞球于fC用1%的戊二醛處理30min;3)在同一條件下分別測定固定化后工程菌的酶活與游離細(xì)胞的酶活，結(jié)果顯示固定化工程菌的酶活是游離細(xì)胞的73%;4)用固定化后的工程菌與游離細(xì)胞在同樣條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的酶促轉(zhuǎn)化，條件為甘氨酸2.8mol/L，PLP0.4mmol/L，THFA5mmol/L，甲醛13mmol/L，pH:8.0。結(jié)果顯示，游離細(xì)胞只能做一個批次的轉(zhuǎn)化，而固定化后的工程菌能轉(zhuǎn)化57批次，轉(zhuǎn)化效率為游離細(xì)胞的90%?；蚬こ叹墓潭ɑ瘜嵤├?包括如下步驟1)對轉(zhuǎn)化子T7重新培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，用卡拉膠與明膠復(fù)合載體對其進(jìn)行固定。具體配制過程按比例分別稱取一定量的卡拉膠與明膠(卡拉膠明膠質(zhì)量比為3:2)加入到O.1M的磷酸緩沖液中，其終濃度為3-5^，滅菌后冷卻至5(TC，然后加入離心后的菌體混勻(菌體終濃度為150g/L)，緩慢流加到2X的KCl溶液中，制備成2-3mm的小球，于4t:固定8h。得到固定化細(xì)胞球，也可以說成固定化后細(xì)胞；2)固定化后的固定化細(xì)胞球于4t:用3%的戊二醛處理10min;3)在同一條件下分別測定固定化后工程菌的酶活與游離細(xì)胞的酶活，結(jié)果顯示固定化工程菌的酶活是游離細(xì)胞的73%;4)用固定化后的工程菌與游離細(xì)胞在同樣條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的酶促轉(zhuǎn)化，條件為甘氨酸2mol/L，PLP0.2mmol/L，THFA5mmol/L，甲醛13mmol/L，pH:6.0。結(jié)果顯示，游離細(xì)胞只能做一個批次的轉(zhuǎn)化，而固定化后的工程菌能轉(zhuǎn)化57批次，轉(zhuǎn)化效率為游離細(xì)胞的90%?；蚬こ叹墓潭ɑ瘜嵤├?包括如下步驟1)對轉(zhuǎn)化子T7重新培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，用卡拉膠與明膠復(fù)合載體對其進(jìn)行固定。具體配制過程按比例分別稱取一定量的卡拉膠與明膠(卡拉膠明膠質(zhì)量比為2:2)加入到O.lM的磷酸緩沖液中，其終濃度為4X，滅菌后冷卻至48t:，然后加入離心后的菌體混勻(菌體終濃度為180g/L)，緩慢流加到2X的KCl溶液中，制備成2-3mm的小球，于4t:固定5h。得到固定化細(xì)胞球，也可以說成固定化后細(xì)胞；2)固定化后的固定化細(xì)胞球于4t:用2%的戊二醛處理20min;3)在同一條件下分別測定固定化后工程菌的酶活與游離細(xì)胞的酶活，結(jié)果顯示固定化工程菌的酶活是游離細(xì)胞的73%;4)用固定化后的工程菌與游離細(xì)胞在同樣條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的酶促轉(zhuǎn)化，條件為甘氨酸2.3mol/L，PLP0.3mmol/L，THFA35mmol/L，甲醛11mmol/L，pH:7.0。結(jié)果顯示，游離細(xì)胞只能做一個批次的轉(zhuǎn)化，而固定化后的工程菌能轉(zhuǎn)化57批次，轉(zhuǎn)化效率為游離細(xì)胞的90%。上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對本發(fā)明的一個可行性實施例的具體說明，但是該實施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施例或變更，例如，變化的等效性實施例，均應(yīng)包含于本案的專利范圍之內(nèi)。權(quán)利要求一種基因工程菌，其特征在于保藏編號中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCCNOM209295。2.如權(quán)利要求l所述的基因工程菌，其特征在于培養(yǎng)物名稱及注明的鑒別特征大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a(+)-glyA，EscherichiacoliBL21(DE3)/pET28a(+)-glyA。3.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于該培養(yǎng)物的存活性本保藏中心于2009年12月10日檢測完畢，結(jié)果為存活，菌落菌落邊緣整齊，表面具有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，革蘭氏染色為陰性，MViC試驗為"+、+、-、-"。4.如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟1)設(shè)計引物，根據(jù)genbank中提供的E.colik_12glyA的結(jié)構(gòu)基因的序列(GenBank:AAC75604.1)，利用DNAclub軟件設(shè)計引物。引物序列為primer1:GATCCATGGTAAAGCGTGAAATGAACAT(劃線處為NcoI酶切位點)，Primer2:CCCAAGCTTTTATGCGTAAACCGGGTAA(劃線處為HindIII酶切位點)；2)培養(yǎng)大腸桿菌E.colik-12到對數(shù)期，用試劑盒(購自Generay公司)抽提大腸桿菌k-12的基因組；3)根據(jù)設(shè)計的引物以提取的E.colik-12基因組為模板進(jìn)行PCR擴增；4)PCR產(chǎn)物經(jīng)(Nco1、HindIII雙酶切)切回收后連接于表達(dá)載體pET28a(+)(購自Novagen公司)，并轉(zhuǎn)化BL21(DE3(購自Novagen公司)；5)隨機挑選10個不同的轉(zhuǎn)化子，命名為TlT10，分別在盛有50mL的250mL三角瓶中，于180rpm、37t:培養(yǎng)，進(jìn)入對數(shù)期后用IPTG(P-半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì))誘導(dǎo)3h，測定工程菌逆向酶活，以未轉(zhuǎn)化的宿主菌BL21(DE3)作為對照，比較兩者的酶活；6)挑選出酶活最高的轉(zhuǎn)化子T7，酶活為宿主菌的50IOO倍，并對該工程菌進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，該工程菌酶活保持穩(wěn)定，得到保藏編號中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCCNO:M209295的基因工程菌。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟1)中g(shù)enebank中E.colik-12glyA的登錄號為GenBank:AAC75604.1。6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟3)的擴增條件為1)步驟1:94。C，30sec;2)步驟2:94。C，30sec;3)步驟3:58。C，45sec;4)步驟4:72。C，110sec;5)步驟5:重復(fù)步驟24，循環(huán)2530次6)步驟6:72。C，延伸300sec。7.如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的基因工程菌的固定化使用方法，其特征在于包括如下步驟1)對該工程菌在全自動發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，對數(shù)期后用乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，乳糖終濃度為0.22g/L，再次培養(yǎng)7h后通過離心收集游離細(xì)胞2)對離心后的游離細(xì)胞重懸、破碎，利用破細(xì)胞液對底物甘氨酸、甲醛進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化，酶促轉(zhuǎn)化條件甘氨酸22.8mol/L，PLPO.20.4mmol/L，THFA35mmol/L，甲醛8‘13,1/L，pH:6.08.0。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟l)的培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速200rpm，溫度37。C。9.如權(quán)利要求7-8中任意一項所述的基因工程菌的固定化使用方法，其特征在于包括如下步驟1)對該工程菌在全自動發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，對數(shù)期后用乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，乳糖終濃度為0.22g/L，再次培養(yǎng)7h后通過離心收集游離細(xì)胞；2)用卡拉膠與明膠復(fù)合載體對游離細(xì)胞進(jìn)行固定，卡拉膠明膠質(zhì)量比為2:33:2，固定化溫度為4t:，時間38h;3)固定化后的細(xì)胞于4t:用13%的戊二醛處理1030min，得到固定化細(xì)胞球；4)用固定化細(xì)胞球?qū)Φ孜锔拾彼?、甲醛進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化，條件為甘氨酸22.8mol/L，PLP0.20.4mmol/L，THFA35mmol/L，甲醛813mmol/L，pH:6.08.0。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述步驟1)的培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速200rpm，溫度37t:，其中所述具體的配置過程如下按比例分別稱取(m)卡拉膠(m)明膠比為2:33:2，加入到0.1M的磷酸緩沖液中，其終濃度為3-5X，滅菌后冷卻至45-5(TC，然后加入離心后的菌體混勻(菌體終濃度為150-200g/L)，緩慢流加到2%的KC1溶液中，制備成2-3mm的小球，于4t:固定38h，得到固定化細(xì)胞球。全文摘要本發(fā)明涉及一種基因工程菌構(gòu)建和使用方法，尤其是一種glyA基因工程菌構(gòu)建和固定化使用方法。屬于食品包裝
技術(shù)領(lǐng)域：
。屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的一種基因工程菌，其特征在于保藏編號中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCCNOM209295。本發(fā)明的基因工程菌酶活效率較高，傳代穩(wěn)定。本發(fā)明基因工程菌酶活為宿主菌的50～100倍，對該工程菌進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，該工程菌酶活保持穩(wěn)定。該工程菌用于酶法生產(chǎn)L-絲氨酸的甘氨酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)到70～80％。文檔編號C12P13/06GK101787356SQ201010107650公開日2010年7月28日申請日期2010年2月3日優(yōu)先權(quán)日2010年2月3日發(fā)明者杜祖國,楊顯林,梅運軍,汪大順,熊早生,田秀魏申請人:湖北省八峰藥化股份有限公司