專利名稱：通過抑制血管內(nèi)皮生長因子(vegf)的天然反義轉(zhuǎn)錄子治療vegf相關(guān)的疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實施方案包括調(diào)節(jié)VEGF和相關(guān)分子的表達和/或功能的寡核苷酸。背景DNA-RNA和RNA-RNA雜交對核酸功能的許多方面(包括DNA復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯) 是重要的。雜交對于檢測特定核酸或改變其表達的多種技術(shù)也很重要。例如，反義核苷酸通過和靶RNA雜交從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復制而破壞基因表達。反義DNA還具有 DNA-RNA雜交體作為核糖核酸酶H消化(大多數(shù)細胞類型中存在的活動)的底物的額外特征。反義分子可以被送入細胞(如在寡脫氧核苷酸(ODN)的例子中)，或者它們可由內(nèi)源基因表達為RNA分子。FDA最近批準了一種反義藥——VITRAVENE (用于治療巨細胞病毒視網(wǎng)膜炎)，這反映反義有治療實用性。概述本概述用于介紹本發(fā)明的概況，以簡要指明本發(fā)明的實質(zhì)和內(nèi)容。它隨著下列理解而提出，即不能將它用于解釋或限制權(quán)利要求的范圍或含義。在一個實施方案中，本發(fā)明提供通過使用反義寡核苷酸抑制天然反義轉(zhuǎn)錄子作用的方法，所述反義寡核苷酸靶向天然反義轉(zhuǎn)錄子的任何區(qū)域，導致相應(yīng)有義基因的上調(diào)。本文還預期天然反義轉(zhuǎn)錄子的抑制可以通過siRNA、核酶和小分子來實現(xiàn)，這些也被認為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一個實施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織里的VEGF多核苷酸的功能和/或表達的方法，其包括使所述細胞或組織與5-30個核苷酸長度的反義寡核苷酸接觸， 從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的VEGF多核苷酸的功能和/或表達，其中所述寡核苷酸與包含SEQ ID NO :2的核苷酸1-643或SEQ ID NO :3的核苷酸1-513 (圖3)內(nèi)的 5-30個連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補具有至少50%序列同一性。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸靶向VEGF多核苷酸的天然反義序列(例如 SEQ ID NO :2和3中展示的核苷酸)，及其任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段和互補序列。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO :4-9(圖4)所展示。另一個實施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的VEGF多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與5-30個核苷酸長度的反義寡核苷酸接觸，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的VEGF多核苷酸的功能和/或表達， 其中所述寡核苷酸與VEGF多核苷酸的反義的反向互補具有至少50%序列同一性。另一個實施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的VEGF多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與5-30個核苷酸長度的反義寡核苷酸接觸，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的VEGF多核苷酸的功能和/或表達， 其中所述寡核苷酸與VEGF反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性。在一個優(yōu)選的實施方案中，組合物包含與有義和/或反義VEGF多核苷酸結(jié)合的一種或多種反義寡核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸包含一個或多個修飾的或取代的核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸包含一個或多個修飾的鍵。在另一個實施方案中，修飾的核苷酸包含修飾的堿基，其包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’-0_甲基、氟代或碳、亞甲基或其它鎖定核酸(LNA)分子。優(yōu)選修飾的核苷酸是鎖定核酸分子，包括a-L-LNA。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸通過皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給予患
者ο在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸以藥物組合物給藥。治療方案包括給予患者至少一次反義化合物；但是，該治療可改為在一段時間內(nèi)包括多次給藥。該治療可以結(jié)合其它一種或多種類型的療法。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸包裹于脂質(zhì)體內(nèi)或依附于載體分子(例如膽固醇、TAT肽)。以下介紹其它方面。附圖簡述圖 1 圖IA和IB為實時PCR結(jié)果圖，其顯示相對于對照，！fepG2細胞用使用 Lipofectamine 2000弓丨入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理后，VEGF mRNA的倍數(shù)改變和標準差。 實時PCR結(jié)果表明，用針對vegfaas設(shè)計的siRNA之一(vefaasl_2，P = 0. 05)并可能用第二條:vefaasl_3 (P = 0. 1，

圖1A)處理后48小時，!fepG2細胞中的VEGFA mRNA的水平顯著升高。在相同的樣品中，用vefaasl_2或vefaasl_3處理后，vegfaas RNA的水平顯著降低， 但是用vefaasl_5處理后不變，vefaasl_5也對VEGFA mRNA水平?jīng)]有影響(圖1B)。標示為vegfasl_2、vegfasl_3、vegfasl_5的柱分別對應(yīng)于用SEQ ID NO 4、5和6處理的樣品。圖IC 圖1為實時PCR結(jié)果圖，其顯示相對于對照，HepG2細胞用使用 Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理后，VEGF mRNA的倍數(shù)改變和標準差。實時PCR結(jié)果表明，用針對vegRas設(shè)計的siRNA中的兩條(vegRasl_2，P = 0. 02和 vegRasl_3,P = 0. 06)處理后48小時，H印G2細胞中的VEGFA mRNA的水平顯著升高。vegRas RNA水平改變的結(jié)果待定。標示為vegRasl_2、vegRas 1_3, vegRas 1_5的柱分別對應(yīng)于用 SEQ ID NO 7、8和9處理的樣品。圖2顯示SEQ ID NO 1 人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，轉(zhuǎn)錄子變體1，mRNA (NCBI注冊號NM_001025366. 1)和SEQ ID NO :1a顯示VEGF的基因組序列(外顯子顯示為大寫字母，內(nèi)含子顯示為小寫字母)。圖3顯示SEQ ID NO 2 =VEGF 天然反義序列(NCBI 注冊號BI045995)SEQ ID NO 3 :VEGR 天然反義序列(NCBI 注冊號BF8^784)圖4顯示針對VEGF天然反義序列設(shè)計的反義寡核苷酸，SEQ ID NO :4_6。
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圖5顯示針對VEGR天然反義序列設(shè)計的反義寡核苷酸，SEQ ID NO :7_9。圖 6 顯示靴序列 VEGFA外顯子 1 (SEQ ID NO 10)；由 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay (Hs00173626_ml)設(shè)計的定制試驗的正向引物序列(SEQ ID N 0 11禾口 12)、反向引物序歹Ij (SEQ ID NO 13禾口 14)和報道序列(SEQ ID NO 15和16)。發(fā)明詳述為了說明，下面參考實例應(yīng)用來描述本發(fā)明的幾個方面。應(yīng)當理解，所闡釋的許多具體細節(jié)、關(guān)系和方法是為了提供本發(fā)明的完整理解。但是，相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易認識到本發(fā)明無需一個或多個具體細節(jié)或與其它方法一起也可以實施。本發(fā)明不受行為或事件順序的限制，因為某些行為可按不同的順序出現(xiàn)和/或與其它行為或事件一起出現(xiàn)。 另外，為了實施根據(jù)本發(fā)明的方法并不需要所有說明的行為或事件。本文公開的所有基因、基因名和基因產(chǎn)品旨在和來自本文公開的組合物和方法所適用的任何種類的同系物相應(yīng)。因此，所述術(shù)語包括但不限于來自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)品。應(yīng)當理解當來自特定物種的基因和基因產(chǎn)品被公開時，該公開旨在僅僅舉例，不應(yīng)理解為限制，除非它所在的上下文清楚指明。因此，例如，本文公開的基因(它們在某些實施方案中涉及哺乳動物核酸和氨基酸序列)旨在包括來自其它動物的同源和/或種間同源基因和基因產(chǎn)品，所述其它動物包括但不限于其它哺乳動物、魚類、兩棲類、爬行類和鳥類。在優(yōu)選的實施方案中，基因或核酸序列是人的。定義本文所用的術(shù)語只用于描述特定實施方案的目的，且不旨在限制本發(fā)明。如本文所用的單數(shù)形式"一"和"該"旨在也包括復數(shù)形式，除非上下文清楚指明。另外，在術(shù)語"包括"、“具有"或它們的變體用于發(fā)明詳述和/或權(quán)利要求書的程度內(nèi)，這些術(shù)語旨在以和術(shù)語“包含”相似的方式表示包含性。術(shù)語"大約"或"近似"意指對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員測定的特定值在可接受的誤差范圍之內(nèi)，其部分依賴于該值如何被測量或測定，即測量系統(tǒng)的限制。例如"大約" 按照本領(lǐng)域的實踐可意指在1或大于1標準差以內(nèi)。或者，“大約"可意指給定值的最高 20 %，優(yōu)選最高10 %，更優(yōu)選最高5 %，且更優(yōu)選最高1 %的范圍。或者，特別對生物系統(tǒng)或方法而言，該術(shù)語可意指在一個值的數(shù)量級范圍內(nèi)，優(yōu)選5倍內(nèi)，更優(yōu)選2倍內(nèi)。在本申請和權(quán)利要求中描述特定值時，除非另有指明，否則應(yīng)假定術(shù)語"大約"意指特定值的可接受誤差范圍之內(nèi)。本文所用的術(shù)語“mRNA“意指靶基因的目前已知的mRNA轉(zhuǎn)錄子，以及任何可被闡明的其它轉(zhuǎn)錄子?！胺戳x寡核苷酸"或"反義化合物"意指結(jié)合另一RNA或DNA (靶RNA、DNA)的 RNA或DNA分子。例如，如果它是RNA寡核苷酸，它以RNA-RNA相互作用的方式結(jié)合另一 RNA 靶，并改變靶 RNA 的活性(Eguchi 等(1991) Ann. Rev. Biochem. 60，631-652)。反義寡核苷酸能上調(diào)或下調(diào)特定多核苷酸的表達和/或功能。該定義意欲包括任何從治療、診斷或其它觀點來看有用的外源RNA或DNA分子。這樣的分子包括例如反義RNA或DNA分子、干擾 RNA(RNAi)、微小RNA、誘餌RNA (decoy RNA)分子、siRNA、酶促RNA、治療編輯RNA和激動劑以及拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部引導序列(EGQ寡核苷酸、可變剪接子、引物、探針和雜交至靶核酸至少一部分的其它寡聚化合物。因此，這些化合物可以以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)形寡聚化合物的形式導入。本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"寡核苷酸"指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA) 的寡聚體或多聚體或它們的模擬物。術(shù)語"寡核苷酸"也包含天然和/或修飾的單體或鍵合的線性或環(huán)狀寡聚體，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、它們的取代形式和α端基異構(gòu)形式、肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能以單體-單體相互作用的常規(guī)形式(例如華生-克里克(Watson-Crick)型堿基配對、Hodgsteen或反 Ho0gsteen型堿基配對等)特異性地結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是"嵌合的"，也就是由不同的區(qū)域組成。在本發(fā)明的上下文中，“ 嵌合的"化合物是包含兩個或更多個化學區(qū)域(例如DNA區(qū)域、RNA區(qū)域、PNA區(qū)域等)的寡核苷酸。每個化學區(qū)域由至少一個單體單元(即寡核苷酸化合物例子中的核苷酸)組成。這些寡核苷酸通常包含至少一個其中寡核苷酸被修飾以顯示一種或多種期望性質(zhì)的區(qū)域。寡核苷酸的所述期望性質(zhì)包括但不限于例如增大的對核酸酶降解的抗性、增大的細胞攝取和/或增大的對靶核酸的結(jié)合親和力。寡核苷酸的不同區(qū)域可以因此具有不同的性質(zhì)。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可以形成上述兩種或更多種寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸類似物的混合結(jié)構(gòu)。寡核苷酸可以由可在"寄存器(register)“中連接(即當單體被連續(xù)連接時，如在天然DNA中)或通過間隔物連接的區(qū)域組成。間隔物旨在構(gòu)成區(qū)域之間的共價"橋"， 并且在優(yōu)選的例子中其長度不超過大約100個碳原子。間隔物可以帶有不同的功能性，例如帶正電荷或負電荷、帶特殊核酸結(jié)合性質(zhì)(插入劑、槽結(jié)合劑(groove binder)、毒素、熒光體等)、親脂、誘導特殊二級結(jié)構(gòu)(例如誘導α螺旋的含丙氨酸的肽)。本文所用的"VEGF"和"血管內(nèi)皮生長因子Α"包括所有的家族成員、突變體、 等位基因、片段、種(specy)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。本文所用詞語血管內(nèi)皮生長因子A、VEGF、VEGFA在本申請中可互換使用。本文所用的術(shù)語"對…特異的寡核苷酸"或"靶向…的寡核苷酸"指具有下列序列的寡核苷酸，該序列(i)能與靶基因的一部分形成穩(wěn)定復合體，或(ii)能與靶基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄子的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體。所述復合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過理論計算和/ 或體外試驗測定。測定雜交復合體和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性試驗描述于下面的實施例。本文所用的術(shù)語“靶核酸“包括DNA、從這種DNA轉(zhuǎn)錄而來的RNA (包括前mRNA和 mRNA)、以及從這種RNA衍生而來的cDNA、編碼、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異雜交干擾核酸的正常功能。這種通過和靶核酸特異雜交的化合物調(diào)節(jié)靶核酸的功能一般稱為"反義"。被干擾的DNA的功能包括，例如復制和轉(zhuǎn)錄。被干擾的RNA的功能包括所有重要功能，例如RNA移位至蛋白翻譯的位點、從RNA翻譯蛋白、剪接 RNA產(chǎn)生一個或多個mRNA種類和由RNA參與或促進的催化活性。這種干擾靶核酸功能的總體效果是編碼產(chǎn)物或寡核苷酸的表達的調(diào)節(jié)。RNA干擾‘‘RNAi ‘‘由雙鏈RNA (dsRNA)分子(所述分子與其〃靶〃核酸序列具有序列特異性同源性)介導(CapIen, N. J.等(2001)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747)。在本發(fā)明的某些實施方案中，介質(zhì)是5_25核苷酸的"小干擾"RNA雙鏈體 (siRNA)。siRNA 來自通過稱為 Dicer 的 RNase 酶處理 dsRNA (Bernstein, E.等 Q001) Nature 409 :363-366)。siRNA雙鏈體產(chǎn)品被納入術(shù)語稱為RISC(RNA Induced Silencing Complex,RNA誘導的沉默復合體)的多蛋白siRNA復合體。不希望被任何特定理論束縛，RISC據(jù)信被指引至靶核酸(適宜mRNA)，在這里siRNA雙鏈體以序列特異方式相互作用，從而以催化形式介導切割(Bernstein, Ε.等(2001)Nature 409 :363-366 ；Boutla, Α.等(2001) Curr. Biol. 11 :1776-1780)?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的小干擾RNA可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的和普通技術(shù)人員所熟悉的程序合成和使用。用于本發(fā)明方法的小干擾RNA適合包含大約1到大約50 個之間的核苷酸(nt)。在非限制性實施方案的實施例中，siRNA可以包含大約5到大約40 個nt、大約5到大約30個nt、大約10到大約30個nt、大約15到大約25個nt或者大約 20-25個核苷酸。通過使用自動排列核酸序列和標明同一性或同源性區(qū)域的計算機程序，適合的寡核苷酸的選擇得以促進。這種程序用于比較核酸序列，所述核酸序列例如通過搜索數(shù)據(jù)庫 (例如GenBank)或通過對PCR產(chǎn)品測序而獲得。比較一系列物種之間的核酸序列可以選擇在物種之間表現(xiàn)出適當同一性程度的核酸序列。在沒有被測序的基因的例子中，進行DNA 印跡法(Southern blots)以測定目標物種和其它物種的基因之間的同一性程度。本領(lǐng)域公知，通過在不同嚴格程度進行DNA印跡法，可能獲得同一性的近似度量。這些程序可以選擇寡核苷酸，所述寡核苷酸展示出與待控制對象中的靶核酸序列的高互補度，和與其它物種中的相應(yīng)核酸序列的較低互補度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會意識到選擇用于本發(fā)明的基因的合適區(qū)域有相當大的范圍。“酶促 RNA “意指具有酶活性的 RNA 分子(Cech，(1988) J. American. Med. Assoc.沈0，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通過首先結(jié)合靶RNA而起作用。這種結(jié)合通過酶促核酸的靶結(jié)合部分而發(fā)生，所述酶促核酸與起切割靶RNA作用的分子的酶促部分保持緊密接近。因此酶促核酸首先識別靶RNA然后通過堿基配對與之結(jié)合，一旦結(jié)合到正確的位點，即以酶的形式起剪切靶RNA的作用?！罢T餌RNA"意指模擬配體的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA分子。因此誘餌RNA與天然結(jié)合靶競爭結(jié)合特異配體。例如，已顯示HIV反式激活應(yīng)答(TAR)RNA的過度表達可以充當〃誘餌〃，并且有效結(jié)合HIV tat蛋白，從而阻止其結(jié)合HIV RNA中編碼的TAR序列 (Sullenger等(1990)Cell，63，601-608)。這是一個具體的實例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到這僅是一個實例，利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)可以容易地產(chǎn)生其它實施方案。本文所用的術(shù)語"單體"通常指由磷酸二酯鍵或其類似物連接從而形成大小從幾個單體單元(例如從大約3-4個)到幾百個單體單元的寡核苷酸的單體。磷酸二酯鍵合的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，下面會做更全面的介紹。術(shù)語"核苷酸"覆蓋天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚，以前認為"非天然存在的“多種核苷酸隨后已經(jīng)在自然界找到。因此，“ 核苷酸"不僅包括已知的包含嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，也包含雜環(huán)類似物和它們的互變異構(gòu)體。其它類型核苷酸的示例性的實例是包含以下的分子腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、N4, N4-橋亞乙基胞嘧啶、N6, N6-橋亞乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、 5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷和描述于Bermer等，美國專利號5，432，272中的"非天然存在的"核苷酸。術(shù)語"核苷酸"旨在覆蓋這些實例的每個和所有以及它們的類似物和互變異構(gòu)體。特別令人感興趣的核苷酸是那些包含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，它們被認為是與人類的治療和診斷應(yīng)用相關(guān)的天然存在的核苷酸。核苷酸包含天然的2'-脫氧和2'-羥基糖(例如描述于Kornberg和Baker，DNA Implication， 第二版(Freeman，San Francisco, 1992))和它們的類似物。和核苷酸有關(guān)的"類似物"包括具有修飾的堿基部分和/或修飾的糖部分的合成核苷酸(參見例如，由Scheit總體描述的Nucleotide Analogs, John Wiley, New York,1980 ；Freier & Altmann， (1997)Nucl. Acid. Res. ,25(22),4429-4443, Toulme, J. J. , (200l)Nature Biotechnology 19 :17-18 ；Manoharan Μ. , (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 :117-139 ；Freier S.Μ. , (1997)Nucleic Acid Research,25 4429-4443, Uhlman, Ε. , (2000)Drug Discovery & Development，3 :203_213， Herdewin P.，(2000)Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.，10 :297-310) ；2' -0,3' _C_ 連接的 [3.2.0] 二環(huán)阿拉伯糖核苷(參見例如 N. K Christiensen.，等(1998) J. Am. Chem. Soc.， 120 :5458-5463 ；Prakash TP, Bhat B. (2007)Curr Top Med Chem. 7(7) :641-9 ；Cho EJ 等 (2009) Annual Review of Analytical Chemistry，2，24H64)。這樣的類似物包括被設(shè)計用于提高結(jié)合性質(zhì)(例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等)的合成核苷酸。本文所用的"雜交"意指寡聚化合物的基本互補的鏈的配對。一種配對機制包括寡聚化合物鏈的互補核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可以是華生-克里克、 Hoegs^en或反Hoiigsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過形成氫鍵而配對的互補核苷酸。雜交可以在不同環(huán)境下發(fā)生。當反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起功能和/或活性的調(diào)節(jié)，且在期望有特異性結(jié)合的條件下(即體內(nèi)試驗或治療處理情況中的生理條件下，和在體外試驗情況中進行試驗的條件下)有足夠的互補度以避免反義化合物非特異性地結(jié)合非靶核酸序列時，所述反義化合物是"能特異性雜交的"。本文所用的短語"嚴格雜交條件"或"嚴格條件"指下列條件，在該條件下，本發(fā)明的化合物將和它的靶序列雜交，但只和最少量的其它序列雜交。嚴格條件依賴于序列， 且在不同的環(huán)境中會不同，在本發(fā)明的上下文中，寡聚化合物在"嚴格條件"下和靶序列雜交，該"嚴格條件"取決于寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及研究它們的試驗。一般地，嚴格雜交條件包括低濃度(< 0. 15M)的帶有無機陽離子例如Na++或K++(即低離子強度) 的鹽，高于20°C _25°C低于寡聚化合物靶序列復合體的Tm的溫度，以及存在例如甲酰胺、 二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDQ的變性劑。例如，對于每甲酰胺，雜交率降低1. 1%。高嚴格性雜交條件的實例是0. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液 (SSC) /0. 1% (重量 / 體積)SDS，60 0C，30 分鐘。本文所用的"互補"指在一條或兩條寡聚體鏈上的兩個核苷酸之間的精確配對的能力。例如，如果反義化合物的特定位置上的核堿基(nucleobase)能與靶核酸的特定位置上的核堿基氫鍵合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，那么寡核苷酸和靶核酸之間的氫鍵合的位置就被認為是互補位置。當每個分子的足量互補位置被能彼此氫鍵合的核苷酸占據(jù)時，寡聚化合物和其它DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互補。因此，"能特異性雜交"和"互補"是用于表示足量核苷酸上足夠的精確配對或互補程度使得寡聚化合物和靶核酸之間存在穩(wěn)定和特異結(jié)合的術(shù)語。本領(lǐng)域應(yīng)當理解寡聚化合物的序列不需要100%互補于其將特異雜交的靶核酸的序列。而且，寡核苷酸可以在一個或多個片段上雜交從而在雜交事件中不包括間隔或相鄰的片段(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物與它們將靶向的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)域具有至少大約70%、或至少大約75%、或至少大約80%、或至少大約85%、 或至少大約90%、或至少大約95%或至少大約99%的序列互補性。例如，其中反義化合物的20個核苷酸中的18個與靶區(qū)域互補并因此將特異性雜交的反義化合物將代表90%的互補性。在該實例中，余下的非互補核苷酸可以集群或與互補核苷酸散布且不需要彼此鄰近或與互補核苷酸鄰近。因此，長度為18個核苷酸，有4 (四)個非互補核苷酸(它們兩側(cè)有和靶核酸完全互補的兩個區(qū)域)的反義化合物與靶核酸的總互補性將為77. 8%，因而將落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。反義化合物與靶核酸的區(qū)域的百分比互補性可常規(guī)地使用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本本地排列搜索工具)和PowerBLAST程序測定(Altschul等(1990) J. Mol. Biol.，215，403-410 ;Zhang 和 Madden，(1997)Genome Res.，7，649-656)。百分比同源性、序列同一性或互補性可以通過例如使用Smith和Waterman算法(Adv. Appl. Math.， (1981)2,482-489)白勺 Gap 禾呈· (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)用默認設(shè)置測定。本文所用的術(shù)語"熱熔點(Tm)“指在規(guī)定的離子強度、PH和核酸濃度下的溫度， 在該溫度下50%的互補于靶序列的寡核苷酸與靶序列的雜交達到平衡。通常，嚴格條件如下，其中pH7. 0到8. 3時，鹽濃度是至少大約0. 01到1. OM Na離子濃度(或其它鹽)，且對于短寡核苷酸(例如10-50個核苷酸)溫度是至少大約30°C。嚴格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺實現(xiàn)。本文所用的"調(diào)節(jié)"意指增大(刺激)或減小(抑制)基因的表達。當用于多核苷酸序列的上下文時，術(shù)語"變體"可以包含與野生型基因相關(guān)的多核苷酸序列。該定義也可以包括，例如"等位基因"、“剪接"、“種"或"多態(tài)性〃變體。剪接變體可以和參比分子有顯著同一性，但是由于mRNA處理期間外顯子的交替剪接， 將一般含有更多或更少數(shù)量的多核苷酸。相應(yīng)的多肽可以包含附加的功能結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域的缺失。種變體是在種與種之間相異的多核苷酸序列。在本發(fā)明中具有特定用途的是野生型基因產(chǎn)品的變體。變體可以由核酸序列中的至少一個突變獲得，且可以導致改變的mRNA 或者結(jié)構(gòu)或功能會或不會改變的多肽。任何給定的天然或重組基因可以含有0、1或許多等位基因形式。產(chǎn)生變體的普通突變變化一般歸因于核苷酸的天然缺失、增加或取代。這些變化類型的每一種可以在給定序列中單獨出現(xiàn)或與其它聯(lián)合出現(xiàn)一次或多次。得到的多肽一般相對于彼此將具有顯著的氨基酸同一性。多態(tài)性變體是給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態(tài)性變體也可以包括"單核苷酸多態(tài) (SNP)“，或單堿基突變體(其中多核苷酸序列中一個堿基變化)。SNP的存在可以是，例如， 對疾病狀態(tài)具有傾向性(即易感性對抵抗性)的特定種群的指示。衍生多核苷酸包含進行了化學修飾(例如，由烷基、?；虬被鶊F取代氫)的核酸。衍生物，例如衍生寡核苷酸，可以包含非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖內(nèi)鍵合。其中的示例是硫代磷酸酯和其它本領(lǐng)域已知的含硫物種。衍生核酸也可以包含標記，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等?！把苌ǘ嚯幕螂氖峭ㄟ^例如糖基化、聚乙二醇化(pegylation)、磷酸化、硫酸化、還原/烷基化、?；?、化學耦合或溫和福爾馬林處理修飾的一種多肽或肽。衍生物也可以被修飾為包含可檢測的標記，直接或間接地包括但不限于放射性同位素、熒光和酶標記。本文所用的術(shù)語"動物"或"患者"意欲包括，例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、 水貂、哺乳動物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬行動物、魚、昆蟲和蛛形綱動物?！溉閯游铩ǜ采w通常有醫(yī)療護理的溫血哺乳動物(例如人和馴養(yǎng)動物)。實例包括貓科動物、犬科動物、馬科動物、?？苿游锖腿耍约爸话ㄈ?。“進行治療"或"治療"覆蓋哺乳動物中的疾病狀態(tài)的治療，且包括(a)預防疾病狀態(tài)在哺乳動物中出現(xiàn)，特別是當這種哺乳動物對疾病狀態(tài)易感但還沒有被診斷患??；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如阻止其發(fā)展；和/或(c)減輕疾病狀態(tài)，例如引起疾病狀態(tài)的消退直至達到期望的終點。治療也包括疾病癥狀的改善(例如減輕疼痛或不適)，其中這種改善可以直接影響或可以不直接影響疾病(例如引起、傳播、表達等)。本文所用術(shù)語"癌癥"指任何惡性腫瘤，特別是在肺、腎或甲狀腺中產(chǎn)生的惡性腫瘤。癌癥自身展示為"腫瘤"或包含癌癥惡性細胞的組織。腫瘤的實例包括肉瘤和癌， 例如但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、肺癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞癌、胚胎癌、維爾姆斯氏腫瘤(Wilm’s tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細胞瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤。 如上所述，本發(fā)明特定地允許區(qū)別診斷肺、腎和甲狀腺瘤。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶在一個實施方案中，靶包含血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的核酸序列，非限制性地包括和VEGF相關(guān)的有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管再生和心血管滲透性的有力的刺激因子。有8 種功能不同或有時功能重疊的同種型。作用的機制還在研究之中，新出現(xiàn)的認識是和其它受體(例如神經(jīng)氈(neurophilin)，它們之前與血管再生無關(guān))之間的重疊通路和串擾 (cross-talk)。VEGF對胚胎發(fā)育、愈合和月經(jīng)周期有重要的生理作用。它在與自身免疫疾病相關(guān)的病理條件中扮演重要的角色。示例性的血管內(nèi)皮生長因子介導的疾病和病癥(它們可以用從反義化合物獲得的干細胞再生的細胞/組織治療)包括特征為過量血管內(nèi)壁細胞增殖的疾?。挥尚难軝C能不全導致的心血管疾病(例如冠狀動脈疾病、充血性心力衰竭和周圍性血管疾病)；特征或起因是異?；蜻^剩血管再生的病癥，包括但不限于癌癥(例如致癌基因的激活、腫瘤抑制物的損失)；感染性疾病(例如病原體表達血管基因、增強血管再生程序)；自身免疫障礙(例如肥大細胞和其它白細胞的激活)，包括類風濕性關(guān)節(jié)炎；血管畸形(例如Tie-2突變)；DiGeorge綜合癥(例如低VEGF和神經(jīng)氈(neuropilin)-1表達)；HHT (例如內(nèi)皮糖蛋白(endoglin)或LK-I的突變)、海綿狀血管瘤(例如Cx37和Cx40的損失)；動脈粥樣硬化； 移植動脈病(ateriopathy)；肥胖癥(例如由脂肪飲食誘發(fā)的血管再生、血管再生抑制因子誘發(fā)的體重減輕)；牛皮癬；疣；變應(yīng)性皮炎；疤痕疙瘩；膿性肉芽腫；發(fā)皰疾??；艾滋病患者的卡波西肉瘤；持久性增生性玻璃狀綜合癥(例如Ang-2或VEGF164的損失)；常染色體顯性多囊性腎病(ADPKD)；糖尿病視網(wǎng)膜??；早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病；年齡相關(guān)的黃斑部退化；脈絡(luò)膜新血管形成(例如TIMP-3突變)；原發(fā)性肺動脈高壓(例如種系BMPR-2突變、體細胞 EC突變)；哮喘；鼻息肉；炎性腸病、神經(jīng)損傷、腦損傷和神經(jīng)組織退化性疾病(例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化等)；牙周??；腹水；腹膜粘連；子宮內(nèi)膜異位；子宮出血；卵巢囊腫；卵巢過刺激；關(guān)節(jié)炎；滑膜炎；骨髓炎；和/或骨贅形成；潰瘍；尋常疣； 結(jié)節(jié)性腦硬化血管纖維瘤；葡萄酒色痣；斯德奇-韋伯綜合癥；Kippel-Trenaunay-Weber 綜合癥；OsIer-Weber-Rendu綜合癥和任何其它與細胞或組織中的VEGF-R水平相關(guān)的疾病或癥狀。在一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸對VEGF的多核苷酸(其非限制性地包括非編碼區(qū)域)特異。VEGF靶包含VEGF的變體、VEGF的突變體(包括SNP) ,VEGF的非編碼序列、 等位基因、片段等。優(yōu)選寡核苷酸是反義RNA分子。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，靶核酸分子不僅限于VEGF多核苷酸，還延及VEGF的任何同種型、受體、同系物、非編碼區(qū)域等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸靶向VEGF靶的天然反義序列(編碼和非編碼區(qū)域的天然反義)，非限制性地包括它的變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段和互補序列。優(yōu)選寡核苷酸是反義RNA或DNA分子。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包括在化合物的一個或多個核苷酸位置上存在不同堿基的變體。例如，如果第一個核苷酸是腺嘌呤，可產(chǎn)生在此位置含有胸苷、鳥苷、胞苷或其它天然或非天然的核苷酸的變體。這可以在反義化合物的任何位置完成。這些化合物然后使用本文描述的方法來測試，以測定它們抑制靶核酸表達的能力。在某些實施方案中，反義化合物和靶之間的同源性、序列同一性或互補性為大約 50%到大約60%。在某些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為大約60%到大約 70%。在某些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為大約70%到大約80%。在某些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為大約80 %到大約90 %。在某些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為大約90%、大約92%、大約94%、大約95%、大約96%、大約 97%、大約98%、大約99%或大約100%。當反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起活性損失，且在期望有特異性結(jié)合的條件下有足夠的互補度以避免反義化合物非特異性地結(jié)合非靶核酸序列時，所述反義化合物是能特異性雜交的。這樣的條件包括，即體內(nèi)試驗或治療處理情況中的生理條件下，和在體外試驗情況中進行試驗的條件下。當反義化合物(不論DNA、RNA、嵌合體、取代體等)與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能而引起功效損失，且在期望有特異性結(jié)合的條件下(即體內(nèi)試驗或治療處理情況中的生理條件下，和在進行試驗的條件下在體外試驗情況中)有足夠的互補度以避免反義化合物非特異性地結(jié)合非靶序列時，所述反義化合物是能特異性雜交的。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，VEGF的靶向(非限制性地包括使用例如PCR、雜交等鑒別或擴展的反義序列、SEQ ID NO. :2展示的序列中的一種或多種等)調(diào)節(jié)VEGF的表達或功能。在一個實施方案中，相對于對照，表達或功能被上調(diào)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，相對于對照，表達或功能被下調(diào)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO :4-9展示的核酸序列，這些核酸序列包含使用例如PCR、雜交等鑒別和擴展的反義序列。這些寡核苷酸可以包含一個或多個修飾的核苷酸、較短或較長的片段、修飾的鍵等。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核苷酸包含磷衍生物?？梢砸栏接诒景l(fā)明的修飾的寡核苷酸的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾的磷酸酯基團)可以是一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、烷烴磷酸酯、硫代磷酸酯等。制備上述磷酸酯類似物，和將它們導入核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸本身也是已知的，不需要在此描述。反義的特異性和靈敏性也可被本領(lǐng)域技術(shù)人員在治療用途中利用。反義寡核苷酸已經(jīng)作為治療部分用于治療動物和人的疾病狀態(tài)。反義寡核苷酸已被安全和有效地給予人，且許多臨床試驗?zāi)壳耙苍谶M行當中。因此已確定寡核苷酸可以是有用的治療手段，所述治療手段可經(jīng)設(shè)置用于治療細胞、組織和動物(尤其是人)的治療方案。在本發(fā)明的實施方案中，寡聚反義化合物，特別是寡核苷酸，結(jié)合靶核酸分子并調(diào)節(jié)由靶基因編碼的分子的表達和/或功能。待干擾的DNA的功能包括例如復制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA的功能包括所有重要的功能，例如RNA移位至蛋白翻譯的位點、從RNA翻譯蛋白、剪接RNA產(chǎn)生一個或多個mRNA種類和由RNA參與或促進的催化活性。根據(jù)期望的功能， 該功能可被上調(diào)或抑制。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部引導序列(EGQ寡核苷酸、 可變剪接子、引物、探針和雜交至靶核酸至少一部分的其它寡聚化合物。因此，這些化合物可以以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)形寡聚化合物的形式導入。在本發(fā)明的上下文中，將反義化合物靶向特定核酸分子可以是多步驟過程。該過程通常以靶核酸(其功能待調(diào)節(jié))的鑒別開始。該靶核酸可以是，例如其表達與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細胞基因(或從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或者來自傳染劑中的核酸分子。在本發(fā)明中，靶核酸編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。靶向過程通常也包括測定靶核酸內(nèi)的至少一個靶區(qū)域、片段或位點，使反義相互作用發(fā)生，從而產(chǎn)生期望的效果(例如表達的調(diào)節(jié))。在本發(fā)明的上下文內(nèi)，術(shù)語"區(qū)域" 定義為具有至少一個可鑒別結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸的區(qū)域內(nèi)是片段?！捌?定義為靶核酸內(nèi)的區(qū)域的更小部分或亞部分。本發(fā)明所用的"位點"定義為靶核酸內(nèi)的位置。在一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的天然反義序列并調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) (SEQ ID NO 1)的表達和/或功能。反義序列的實例包括SEQ ID NO 2-9 ο在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的一個或多個片段，并調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達和/或功能。所述片段包含血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有義或反義多核苷酸的至少5個連續(xù)核苷酸。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的天然反義序列特異，其中寡核苷酸和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達和/或功能。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸化合物包括SEQ ID NO :4-9展示的序列，使用例如PCR、雜交等鑒別和擴展的反義序列。這些寡核苷酸可以包含一個或多個修飾的核苷酸、較短或較長的片段、修飾的鍵等。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實例包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核苷酸包含磷衍生物。磷衍生物(或修飾的磷酸酯基團)(其可依附于本發(fā)明的修飾的寡核苷酸中的糖或糖類似物部分)可以是一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、烷烴磷酸酯、硫代磷酸酯等。制備上述磷酸酯類似物，和將它們導入核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸本身也是已知的，不需要在此描述。如本領(lǐng)域已知的，由于翻譯起始密碼子通常是5' -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中； 在相應(yīng)的DNA分子中是5' -ATG)，翻譯起始密碼子也稱作"AUG密碼子"、"起始密碼子〃或〃 AUG起始密碼子〃。少數(shù)基因具有RNA序列為5' -GUG、5' -UUG或5' -CUG的翻譯起始密碼子；且已顯示5' -AUA、5' -ACG和5' -CUG在體內(nèi)起作用。因此術(shù)語〃翻譯起始密碼子"和"起始密碼子"可包含許多密碼子序列，盡管起始氨基酸在每個例子中通常是甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可以有兩個或更多個可選的起始密碼子，它們中的任何一個可在特定細胞類型或組織中或在特定條件組合下優(yōu)先用于翻譯起始。在本發(fā)明的上下文中，“起始密碼子"和"翻譯起始密碼子"指在體內(nèi)用于啟動從編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的基因轉(zhuǎn)錄而來的mRNA的翻譯的密碼子，而不管這些密碼子的序列?；虻姆g終止密碼子(或"終止密碼子")可以具有以下三個序列中的一個，即5' -UAA、5' -UAG和5' -UGA(相應(yīng)的DNA序列分別是 5' -TAA、5' -TAG 禾口 5' -TGA)。術(shù)語"起始密碼子區(qū)域"和"翻譯起始密碼子區(qū)域"指從翻譯起始密碼子沿著任一方向(即5'或3')包含大約25到大約50個連續(xù)核苷酸的mRNA或基因的一部分。 類似地，術(shù)語"終止密碼子區(qū)域"和"翻譯終止密碼子區(qū)域"指從翻譯終止密碼子沿著任一方向(即5'或3')包含大約25到大約50個連續(xù)核苷酸的mRNA或基因的一部分。因此，“起始密碼子區(qū)域"(或"翻譯起始密碼子區(qū)域")和"終止密碼子區(qū)域"(或"翻譯終止密碼子區(qū)域")都是可以用本發(fā)明的反義化合物有效靶向的區(qū)域?？勺g框架(open reading frame, 0RF)或〃編碼區(qū)〃(它在本領(lǐng)域中已知指翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)域)也是可以被有效靶向的區(qū)域。在本發(fā)明的上下文中，靶向區(qū)域是包含基因的可譯框架(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)域。另一個靶區(qū)域包括5'非翻譯區(qū)域(5‘ UTO)，在本領(lǐng)域中已知指從翻譯起始密碼子沿著5 ‘方向的mRNA的一部分，因此包含mRNA的5 ‘帽位點和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)。另一個靶區(qū)域包含3'非翻譯區(qū)域(3' UTR)，在本領(lǐng)域中已知指從翻譯終止密碼子沿著3'方向的mRNA的一部分，因此包含mRNA的翻譯終止密碼子和3'末端之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)。mRNA的5'帽位點包含N7甲基化的鳥苷殘基，其通過5' -5'三磷酸酯鍵合與mRNA的最5' (5' -most)殘基結(jié)合。mRNA 的5'帽區(qū)域被認為包含5'帽結(jié)構(gòu)本身和與該帽位點相鄰的頭50個核苷酸。本發(fā)明的另一個靶區(qū)域是5'帽區(qū)域。
雖然某些真核mRNA轉(zhuǎn)錄子被直接翻譯，但是許多包含一個或多個稱為“內(nèi)含子"的區(qū)域，其在被翻譯之前被從轉(zhuǎn)錄子切除。余下的(因此被翻譯的)區(qū)域稱作"外顯子"并被剪接在一起形成連續(xù)的mRNA序列。在一個實施方案中，靶向剪接位點(即內(nèi)含子-外顯子接點或外顯子-內(nèi)含子接點)在疾病中牽涉異常剪接的情況，或疾病中牽涉過度產(chǎn)生特定剪接產(chǎn)物的情況時尤其有用。由重排或缺失造成的異常融合接點是靶位點的另一個實施方案。通過剪接來自不同基因來源的兩個(或更多個)mRNA的過程而產(chǎn)生的mRNA 轉(zhuǎn)錄子稱作"融合轉(zhuǎn)錄子"。使用靶向例如DNA或前mRNA的反義化合物可以有效地靶向內(nèi)含子。在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區(qū)域，并調(diào)節(jié)靶分子的表達和/或功能。在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合天然反義多核苷酸，并調(diào)節(jié)靶分子的表達和/或功能。在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合有義多核苷酸，并調(diào)節(jié)靶分子的表達和/或功能?？蛇x的RNA轉(zhuǎn)錄子可以從DNA的相同基因組區(qū)域產(chǎn)生。這些可選的轉(zhuǎn)錄子一般稱為"變體"。更具體地，“前mRNA變體"是由相同基因組DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄子，所述轉(zhuǎn)錄子與相同基因組DNA產(chǎn)生的其它轉(zhuǎn)錄子在它們的起始或終止位置不同并包含內(nèi)含子和外顯子序列兩者。在剪接的時候剪切掉一個或多個外顯子或內(nèi)含子區(qū)域、或它們的部分時，前mRNA 變體產(chǎn)生更小的“mRNA變體“。因此，mRNA變體是經(jīng)處理的前mRNA變體，每個獨特的前 mRNA變體必定總是由于剪接而產(chǎn)生獨特的mRNA變體。這些mRNA變體也稱為"可選的剪接變體“。如果不存在前mRNA變體的剪接，則前mRNA變體與mRNA變體相同。變體可通過使用可選的信號來起始或終止轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生。前mRNA和mRNA可以具有不止一個起始密碼子或終止密碼子。使用可選的起始密碼子的源自前mRNA或mRNA的變體稱為該前mRNA或mRNA的"可選的起始變體"。那些使用可選的終止密碼子的轉(zhuǎn)錄子稱為該前mRNA或mRNA的"可選的終止變體"。一種可選的終止變體的具體類型是"多聚 A(polyA)變體"，其中產(chǎn)生的多個轉(zhuǎn)錄子由轉(zhuǎn)錄機構(gòu)的"多聚A終止信號"之一的可選選擇而產(chǎn)生，因此產(chǎn)生在獨特的多聚A位點終止的轉(zhuǎn)錄子。在本發(fā)明的上下文中，本文描述的變體的類型也是靶核酸的實施方案。靶核酸上反義化合物雜交的位置定義為活性反義化合物靶向的靶區(qū)域的至少5 個核苷酸長度的部分。雖然本文展示了某些示例性靶片段的具體序列，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到這些用于說明和描述本發(fā)明范圍內(nèi)的特定實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮到本申請公開可容易地鑒別另外的靶片段。包含一段至少五( 個連續(xù)核苷酸(它們選自說明性的優(yōu)選靶片段)的靶片段 (其長度為5-100個核苷酸)也被認為適合靶向。靶片段可以包括DNA或RNA序列，所述序列包含始自說明性的優(yōu)選靶片段之一的 5'末端的至少5個連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸是相同DNA或RNA的連續(xù)段，從靶片段的5' 末端上游立即開始并延續(xù)直到DNA或RNA包含大約5到大約100個核苷酸)。類似優(yōu)選的靶片段由DNA或RNA序列代表，所述序列包含始自說明性的優(yōu)選靶片段之一的3'末端的至少5個連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸是相同DNA或RNA的連續(xù)段，從靶片段的3'末端下游立即開始并延續(xù)直到DNA或RNA包含大約5到大約100個核苷酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員在理解本文說明的靶片段后將能(無需過度試驗)鑒別進一步優(yōu)選的靶片段。一旦一個或多個靶區(qū)域、片段或位點得到鑒別，即選擇和靶充分互補(即雜交足夠好且具有足夠特異性)的反義化合物，以產(chǎn)生期望的效果。在本發(fā)明的實施方案中，寡核苷酸結(jié)合特定靶的反義鏈。寡核苷酸長度為至少5 個核苷酸，并可合成為每個寡核苷酸靶向重疊的序列，使得寡核苷酸合成為覆蓋靶多核苷酸的整個長度。靶也包括編碼和非編碼區(qū)域。在一個實施方案中，優(yōu)選由反義寡核苷酸靶向具體的核酸。使反義化合物靶向特定核酸是一個多步驟過程。該過程通常以鑒別其功能待調(diào)節(jié)的核酸序列開始。這可以是例如其表達與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細胞基因(或從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或者非編碼多核苷酸如非編碼RNA(ncRNA)。RNA可分類為(1)翻譯成蛋白的信使RNA(mRNA)，和(2)非蛋白編碼RNA(ncRNA)。 ncRNA包含微小RNA(microRNA)、反義轉(zhuǎn)錄子和其它包含高密度的終止密碼子并缺乏任何廣闊(extensive)"可譯框架"的轉(zhuǎn)錄單元(TU)。許多ncRNA似乎始于蛋白編碼場所的3 ‘ 非翻譯區(qū)域(3 ‘ UTR)中的起始位點。ncRNA通常罕見，且由FANTOM協(xié)會測序的ncRNA的至少一半似乎不是多腺苷酸化的。大多數(shù)研究人員因為顯而易見的原因聚焦于經(jīng)處理并輸送至細胞質(zhì)的多腺苷酸化的mRNA。最近已顯示非多腺苷酸化的核RNA的集合可能非常大， 且許多這樣的轉(zhuǎn)錄子由所謂的基因間區(qū)域產(chǎn)生(Cheng, J.等· (2005) Science 308(5725)， 1149-1154 ；Kapranov,P. ^ (2005). Genome Res 15 (7)，987-997)。ncRNA 可以借以調(diào)節(jié)基因表達的機制是通過與靶轉(zhuǎn)錄子的堿基配對。通過堿基配對起作用的RNA能分組為(1)順式編碼RNA，它們在與它們所作用的RNA相同的基因位置，但是在相對鏈上被編碼，因此展現(xiàn)出與它們的靶的完美互補性，和(2)反式編碼RNA，它們在與它們所作用的RNA不同的染色體位置上被編碼，且一般不會展示出與它們的靶的完美堿基配對潛力。不希望被理論束縛，通過本文描述的反義寡核苷酸干擾反義多核苷酸能改變相應(yīng)有義信使RNA的表達。但是，這種調(diào)節(jié)可以是不一致的(反義降低(knockdown)導致信使 RNA升高)或一致的(反義降低導致伴隨的信使RNA減少)。在這些情況下，反義寡核苷酸能靶向反義轉(zhuǎn)錄子的重疊或非重疊部分，導致其降低或隔絕。編碼和非編碼反義能以相同的方式被靶向，任一種類都能以一致或不一致的方式調(diào)節(jié)相應(yīng)的有義轉(zhuǎn)錄子。在鑒別新的針對靶所使用的寡核苷酸中采用的策略可以基于通過反義寡核苷酸降低反義RNA轉(zhuǎn)錄子或任何其它調(diào)節(jié)期望的靶的方式。策略1:在不一致調(diào)節(jié)的例子中，降低反義轉(zhuǎn)錄子提高常規(guī)(有義)基因的表達。如果后面的基因編碼已知或推定的藥物靶，那么可以想象，降低其反義相對部分 (counterpart)可以模擬受體激動劑或酶刺激劑的作用。策略2 在一致調(diào)節(jié)的例子中，可一致地降低反義和有義轉(zhuǎn)錄子兩者，從而實現(xiàn)常規(guī)(有義)基因表達的協(xié)同減少。如果，例如反義寡核苷酸用于實現(xiàn)降低，那么這個策略能用于施用一個靶向有義轉(zhuǎn)錄子的反義寡核苷酸和另一個靶向相應(yīng)的反義轉(zhuǎn)錄子的反義寡核苷酸，或者施用單一的積極對稱的反義寡核苷酸，它同時靶向重疊的有義和反義轉(zhuǎn)錄子。
根據(jù)本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部引導序列(EGQ寡核苷酸、siRNA化合物、單或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)和其它雜交至靶核酸的至少一部分并調(diào)節(jié)其功能的寡聚化合物。因此，它們可以是DNA、RNA、DNA樣、RNA 樣或它們的混合物，或可以是這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，并可包含結(jié)構(gòu)元素，例如內(nèi)部或末端膨脹、錯配或環(huán)。反義化合物通常線性制備，但可以被連接或者制備成環(huán)狀和/或分枝狀。反義化合物可以包括例如下面的構(gòu)建體(construet)兩條鏈雜交形成整體或部分雙鏈的化合物，或者單鏈，該單鏈具有足夠自身互補性以允許雜交和形成整體或部分雙鏈的化合物。所述兩條鏈可以內(nèi)部連接而留下自由的3'或5'末端，或可以連接而形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以在 5'或3'末端包含產(chǎn)生單鏈特征延伸的突出端。雙鏈化合物可任選在末端包含突出端。進一步的修飾可以包含綴合基團，它們依附于末端、選定的核苷酸位置、糖位置之一或依附于核苷間鍵合之一。或者，兩條鏈可以通過非核酸部分或連接基團連接。當僅由一條鏈形成時，dsRNA可以采取自身向后折回形成雙鏈體的自身互補的發(fā)夾型分子的形式。因此，dsRNA 可以整體或部分是雙鏈?；虮磉_的具體調(diào)節(jié)可通過dsRNA發(fā)夾在轉(zhuǎn)基因細胞系中的穩(wěn)定表達實現(xiàn)，但在某些實施方案中，基因表達或功能被上調(diào)。當由兩條鏈，或單鏈(它采取自身向后折回形成雙鏈體的自身互補的發(fā)夾型分子的形式)形成時，這兩條鏈(或單鏈的形成雙鏈體的區(qū)域)是以華生-克里克形式堿基配對的互補RNA鏈。一旦引入系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物可以引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用，導致對靶核酸的切割或其它修飾，或者可以通過基于占有(occupancy-based)的機制而工作。 總體上，核酸(包括寡核苷酸)可以描述為"DNA樣"(即一般具有一個或多個2'-脫氧糖，和一般為T而非U堿基)或"RNA樣"(即一般具有一個或多個2'-羥基或2'-修飾的糖，和一般為U而非T堿基)。核酸螺旋可以采用不止一種結(jié)構(gòu)類型，最常見的是A和 B型。據(jù)信，一般具有B型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是"DNA樣"的，而那些具有A型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸則是"RNA樣"的。在某些(嵌合)實施方案中，反義化合物可以包含A和B型區(qū)域兩者。在另一個優(yōu)選的實施方案中，期望的寡核苷酸或反義化合物包含以下的至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包含修飾鍵合的反義寡核苷酸、干擾 RNA(RNAi)、短干擾 RNA(siRNA)、微小的干擾 RNA(miRNA)、小的時序(temporal)RNA(stRNA) 或短的發(fā)夾RNA (shRNA)、小RNA誘導的基因激活(RNAa)、小激活RNA (saRNA)或它們的組物中。dsRNA也可以激活基因表達，機制已經(jīng)被術(shù)語稱為〃小RNA誘導的基因激活〃或 RNAa0靶向基因啟動子的dsRNA誘導相關(guān)基因的強效轉(zhuǎn)錄激活。RNAa在人細胞中利用合成 dsRNA(術(shù)語稱為"小激活RNA" (saRNA))得到證實。目前不知道RNAa是否保存于其它生物中。小雙鏈RNA (dsRNA)，例如小干擾RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA)，已被發(fā)現(xiàn)是稱為 RNA干擾(RNAi)的進化保守(conserved)機制的觸發(fā)物。RNAi總是通過改造染色質(zhì)導致基因沉默，從而抑制轉(zhuǎn)錄、降解互補mRNA或阻斷蛋白翻譯。但是，在下面的實施例部分詳細描述的例子中，顯示寡核苷酸增加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸和其編碼產(chǎn)物的表達和/或功能。dsRNA也可以充當小激活RNA(saRNA)。不希望被理論所束縛，通過靶向基因啟動子中的序列，saRNA將在稱為dsRNA誘導的轉(zhuǎn)錄激活(RNAa)的現(xiàn)象中誘導靶基因表達。在一個進一步的實施方案中，本文鑒別的“優(yōu)選靶片段"可以用于篩選調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸表達的另外的化合物?！罢{(diào)節(jié)劑"是減小或增大編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的核酸分子的表達的那些化合物，其包含與優(yōu)選的靶片段互補的至少5個核苷酸部分。篩選方法包括以下步驟使編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的優(yōu)選靶片段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，和選擇減小或增大編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的核酸分子表達的一種或多種候選調(diào)節(jié)劑，例如SEQ ID N0:4-9。一旦顯示候選調(diào)節(jié)劑能調(diào)節(jié)(例如減小或者增大)編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的核酸分子的表達，則該調(diào)節(jié)劑可用于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的功能的進一步探索性研究，或根據(jù)本發(fā)明用作研究、診斷或治療劑。靶向天然反義序列優(yōu)選調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如VEGF基因(ΝΜ_001025366. 1， 圖2)。在一個優(yōu)選的實施方案中，靶是血管內(nèi)皮生長因子A基因的反義多核苷酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸(例如注冊號 NM_001025366. 1，圖2)的有義和/或天然反義序列、它們的變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段和互補序列。優(yōu)選寡核苷酸是反義分子，且靶包括反義和/或有義 VEGF多核苷酸的編碼和非編碼區(qū)域。本發(fā)明優(yōu)選的靶片段也可以和它們各自的本發(fā)明互補反義化合物結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。本領(lǐng)域已經(jīng)顯示了這樣的雙鏈寡核苷酸部分通過反義機制調(diào)節(jié)靶表達和調(diào)節(jié)翻譯以及RNA處理。另外，雙鏈部分可以進行化學修飾(Fire等(1998)Nature，391，806-811 ； Timmons 禾口 Fire， (1998)Nature,395,854 ；Timmons 等(2001)Gene,263,103-112 ；Tabara 等(1998) kience，282，430-431 Montgomery 等(1998) Proc. Natl. Acad. ki. USA, 95， 15502-15507 ;Tuschl 等(1999)Genes Dev. ，13，3191-3197 ;Elbashir 等(2001)Nature, 411,494-498 ；Elbashir ^ (2001)Genes Dev. 15，188-200)。例如，已經(jīng)顯示了這樣的雙鏈部分通過雙鏈體反義鏈與靶的經(jīng)典雜交而抑制靶，從而觸發(fā)靶的酶促降解(Tijsterman等 (2002)Science,295,694-697)。在一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸(例如注冊號NM_001025366. 1)、其變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段和互補序列。優(yōu)選寡核苷酸是反義分子。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，靶核酸分子并不僅限于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，還延及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分子的任何同種型、受體、同系物等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸靶向VEGF多核苷酸的天然反義序列，例如 SEQ ID NO :2和3展示的多核苷酸，及其任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段和互補序列。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO :4-9所展示。在一個實施方案中，寡核苷酸和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)反義的核酸序列(非限制性地包括與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸有關(guān)的非編碼有義和/或反義序列)互補或結(jié)合，并調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分子的表達和/或功能。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸和VEGF天然反義的核酸序列(如SEQ IDNO :2和3所展示)互補或結(jié)合，并調(diào)節(jié)VEGF分子的表達和/或功能。在一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :4_9的至少5個連續(xù)核苷酸的序列，并調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分子的表達和/或功能。多核苷酸靶包括VEGF(包含其家族成員)、VEGF的變體、VEGF的突變體(包含 SNP)、VEGF的非編碼序列、VEGF的等位基因、種變體、片段等。優(yōu)選寡核苷酸是反義分子。在另一個優(yōu)選的實施方案中，靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的寡核苷酸包括反義DNA、干擾RNA (RNAi)、短干擾RNA (siRNA)、微小干擾RNA (miRNA)、小的時序RNA (stRNA)、或短的發(fā)夾RNA (shRNA)、小RNA誘導的基因激活(RNAa)或小激活 RNA(saRNA)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸(例如SEQ ID N0:2和3)調(diào)節(jié)這些靶的表達或功能。在一個實施方案中，表達或功能相對于對照被上調(diào)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，表達或功能相對于對照被下調(diào)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義化合物包括SEQ ID NO :4-9展示的序列。這些寡核苷酸可包含一個或多個修飾的核苷酸、較短或較長片段、修飾的鍵等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，SEQ ID NO :4_9包含一個或多個LNA核苷酸。期望的靶核酸的調(diào)節(jié)可按本領(lǐng)域已知的幾種方式進行。例如反義寡核苷酸、siRNA 等。酶促核酸分子(例如核酶)是能催化多種反應(yīng)中的一種或多種的核酸分子，其包括以核苷酸堿基序列特異性方式反復切割其它單獨的核酸分子的能力。這種酶促核酸分子可用于，例如實際靶向任何 RNA 轉(zhuǎn)錄子(Zaug 等，3 ，Nature 429 1986 ；Cech, 260 JAMA 3030， 1988 ；和 Jefieries 等，17 Nucleic Acids Research 1371,1989)。因為它們的序列特異性，反式切割酶促核酸分子顯示作為人疾病治療劑的希望 (Usman & McSwiggen, (1995)Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294 ；Christoffersen 禾口 Marr, (1995) J. Med. Chem. 38，2023-2037)。酶促核酸分子可設(shè)計成在細胞RNA的背景下切割具體 RNA靶。這種切割事件使mRNA無功能并取消從該RNA的蛋白表達。以這種方式，與疾病狀態(tài)相關(guān)的蛋白的合成能被選擇性地抑制?？偟膩碚f，具有RNA切割活性的酶促核酸通過首先結(jié)合靶RNA而起作用。這種結(jié)合通過酶促核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生，該酶促核酸與作用為切割靶RNA的分子的酶促部分保持緊密接近。因此，酶促核酸首先識別靶RNA然后通過互補性堿基配對與之結(jié)合，一旦結(jié)合到正確的位點，即起酶促作用切割靶RNA。策略性切割這種靶RNA將破壞其直接合成編碼蛋白的能力。酶促核酸已結(jié)合和切割它的RNA靶后，將它從該RNA釋放出來，尋找另一個靶， 并可重復結(jié)合和切割新靶。幾種方法(例如體外選擇(進化)策略(Orgel，(1979)Proc. R. Soc. London, B 205,435))已被用于進化新的能催化多種反應(yīng)(例如磷酸二酯鍵合和酰胺鍵合的切割和連接)的核酸催化劑(Joyce, (1989) Gene, 82,83-87 ；Beaudry ^ (1992) Science 257， 635-641 Joyce,(1992)Scientific American 267，90-97 ；Breaker 等(1994)TIBTECH 12， 268 ；Bartel 等(1993)Science 261 :1411-1418 ；Szostak,(1993)TIBS 17,89-93 ；Kumar 等 (1995)FASEB J. ,9,1183 ；Breaker, (1996)Curr. Op. Biotech. , 7,442) 開發(fā)催化活性最佳的核酶將顯著幫助任何出于調(diào)節(jié)基因表達的目的而采用RNA 切割核酶的策略。例如錘頭狀核酶在有飽和濃度的Mg2+(10mM)輔助因子存在下的催化速率(kcat)大約是1分鐘-1。已顯示人造"RNA連接酶"核酶以大約100分鐘-1的速率催化相應(yīng)的自修飾反應(yīng)。另外，已知某些修飾的錘頭狀核酶(它們具有由DNA構(gòu)成的底物結(jié)合臂)以接近100分鐘-1的多重周轉(zhuǎn)率(multiple turn-over rate)催化RNA切割。最后， 用特定核苷酸類似物替換錘頭的催化核心內(nèi)的具體殘基產(chǎn)生修飾的核酶，它們顯示多達10 倍的催化速率改進。這些發(fā)現(xiàn)表明核酶能促進化學轉(zhuǎn)化，其催化速率顯著大于絕大多數(shù)天然自切割核酶在體外所展示的催化速率。因此可以優(yōu)化某些自切割核酶的結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生最大催化活性，或可以制備對RNA磷酸二酯切割展示顯著更快速率的全新RNA結(jié)構(gòu)域。通過適合〃錘頭〃模型的RNA催化劑在分子間切割RNA底物首次顯示于1987年 (Uhlenbeck，0. C. (1987) Nature, 328 :596-600)。RNA催化劑被回收并與多個 RNA 分子反應(yīng)， 這表明了它真正具有催化性。通過在催化RNA中進行適當?shù)膲A基變化以保持和靶序列的必要堿基配對，已將基于“錘頭狀”結(jié)構(gòu)域設(shè)計的催化RNA用于切割具體靶序列(HaselofT和Gerlach，(1988) Nature, 334, 585 ；Walbot 禾口 Bruening， (1988)Nature,334,196 ；Uhlenbeck, 0. C. (1987) Nature, 328 :596-600 ；Koizumi,Μ.等(1988)FEBS Lett.，228 :228-230) 這已經(jīng)允許使用催化RNA切割具體靶序列，并表明根據(jù)"錘頭"模型設(shè)計的催化RNA可能可以在體內(nèi)切割具體的底物 RNA (參見 Haseloff 和 Gerlach, (1988) Nature, 334，585 ；Walbot 和 Bruening, (1988)Nature,334，196 ；Uhlenbeck, 0.C. (1987)Nature,328 :596-600)。RNA干擾(RNAi)已經(jīng)變成用于調(diào)節(jié)哺乳動物和哺乳動物細胞的基因表達的強有力工具。該方法需要使用表達質(zhì)?；虿《疽约坝糜谛“l(fā)夾RNA(它們處理成siRNA)的編碼序列，遞送作為RNA自身或作為DNA的小干擾RNA(siRNA)。該系統(tǒng)能將前siRNA有效運輸至細胞質(zhì)，在那里它們有活性并允許使用經(jīng)調(diào)節(jié)的和組織特異性的基因表達啟動子。在一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸或反義化合物包括核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或多聚體，或它們的模擬物、嵌合體、類似物或同系物。該術(shù)語包括由天然存在的核苷酸、糖和共價核苷間(骨架)鍵合組成的寡核苷酸，以及具有非天然存在部分(其功能類似)的寡核苷酸。由于期望的性質(zhì)(例如提高的細胞攝取、提高的對靶核酸的親和力、核酸酶存在下的增大的穩(wěn)定性)，這些經(jīng)修飾或取代的寡核苷酸通常相對于天然形式為人所期望。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸或"反義化合物"包括反義寡核苷酸(例如RNA、DNA、它們的模擬物、嵌合體、類似物或同系物)、核酶、外部引導序列(EGQ寡核苷酸、siRNA化合物、 單或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA和其它雜交至靶核酸的至少一部分并調(diào)節(jié)其功能的寡聚化合物。因此，它們可以是DNA、RNA、DNA樣、RNA樣、或它們的混合物、或可以是這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，并可以包含例如內(nèi)部或末端膨脹、錯配或環(huán)的結(jié)構(gòu)元素。反義化合物通常線性制備，但可以被連接或者制備成環(huán)狀和/或分枝狀。反義化合物可以包括構(gòu)建體， 例如兩條鏈雜交形成整體或部分雙鏈的化合物，或者單鏈，該單鏈具有足夠自身互補性以允許雜交和形成整體或部分雙鏈的化合物。所述兩條鏈可以內(nèi)部連接而留下自由的3'或 5'末端，或可以連接而形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以在5'或3'末端包含產(chǎn)生單鏈特征延伸的突出端。雙鏈化合物可任選在末端包含突出端。進一步的修飾可以包含綴合基團，所述綴合基團依附于末端、選定的核苷酸位置、糖位置之一或依附于核甘間鍵合之一?；蛘?，兩條鏈可以通過非核酸部分或連接基團連接。當僅由一條鏈形成時，dsRNA可以采取自身向后折回形成雙鏈體的自身互補的發(fā)夾型分子的形式。因此，dsRNA可以整體或部分是雙鏈?；虮磉_的具體調(diào)節(jié)可通過dsRNA發(fā)夾在轉(zhuǎn)基因細胞系中的穩(wěn)定表達實現(xiàn) (Hammond 等(1991) Nat. Rev. genet.，2，110-119 ；Matzke 等(2001) Curr. Opin. genet. Dev.， 11,221-227 ；Sharp, (2001)Genes Dev.，15，485-490)。當由兩條鏈，或單鏈(它采取自身向后折回形成雙鏈體的自身互補的發(fā)夾型分子的形式)形成時，這兩條鏈(或單鏈的形成雙鏈體的區(qū)域)是以華生-克里克形式堿基配對的互補RNA鏈。一旦引入系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物可以引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用，導致對靶核酸的切割或其它修飾，或者可以通過基于占有(occupancy-based)的機制而工作。 總體上，核酸(包括寡核苷酸)可以描述為"DNA樣"(即一般具有一個或多個2'-脫氧糖，和一般為T而非U堿基)或"RNA樣"(即一般具有一個或多個2'-羥基或2'-修飾的糖，和一般為U而非T堿基)。核酸螺旋可以采用不止一種結(jié)構(gòu)類型，最常見的是A和 B型。據(jù)信，一般具有B型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是"DNA樣"的，而那些具有A型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸則是"RNA樣"的。在某些(嵌合)實施方案中，反義化合物可以包含A和B型區(qū)域兩者。根據(jù)本發(fā)明的反義化合物能包含長度大約5到大約80個核苷酸(即大約5到大約80個連接的核苷)的反義部分。這指的是反義化合物的反義鏈或部分的長度。換句話說，本發(fā)明的單鏈反義化合物包含5到大約80個核苷酸，而本發(fā)明的雙鏈反義化合物(例如dsRNA)包含長度是5到大約80個核苷酸的有義和反義鏈或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解這包含長度為 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79或80個核苷酸，或它們之間的任何范圍的反義部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的反義化合物具有長度是10到50個核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解這使寡核苷酸具體化為具有長度是10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸，或它們之間的任何范圍的反義部分。在某些實施方案中，寡核苷酸長度是15個核苷酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的反義或寡核苷酸化合物具有長度是12或13到30個核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解這使反義化合物具體化為具有長度是12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸，或它們之間的任何范圍的反義部分。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包含變體，其中該化合物內(nèi)一個或多個核苷酸位置上存在不同的堿基。例如，如果第一個核苷酸是腺苷，可產(chǎn)生在此位置含有胸苷、鳥苷或胞苷的變體。這可以在反義或dsRNA化合物的任何位置完成。這些化合物然后使用本文描述的方法來測試，以測定它們抑制靶核酸表達的能力。在某些實施方案中，反義化合物和靶之間的同源性、序列同一性或互補性是大約 40%到大約60%。在某些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是大約60%到大約 70%。在某些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是大約70%到大約80%。在某些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是大約80%到大約90%。在某些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是大約90%、大約92%、大約94%、大約95%、大約96%、大約 97%、大約98%、大約99%或大約100%。在另一個優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸(例如SEQ ID NO :4_9展示的核酸分子)包含一種或多種取代或修飾。在一個實施方案中，核苷酸被鎖定核酸(LNA)取代。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸靶向與VEGF相關(guān)的編碼和/或非編碼序列以及SEQ ID NO :1-3所展示的序列的核酸分子有義和/或反義的一個或多個區(qū)域。寡核苷酸也靶向SEQ ID NO 1-3的重疊區(qū)域。本發(fā)明的某些優(yōu)選寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本發(fā)明的上下文中，“嵌合寡核苷酸"或"嵌合體"是包含兩個或更多個化學不同區(qū)域(每個由至少一個核苷酸組成) 的寡核苷酸。這些寡核苷酸通常包含至少一個修飾的核苷酸的區(qū)域(它賦予一種或多種有益性質(zhì)(例如增大的核酸酶抗性、增大的進入細胞的攝取、增大的對靶的結(jié)合親和力))，和是酶(它能切割RNA:DNA或RNA: RNA雜交體)的底物的區(qū)域。舉例來說，RNase H是切割 RNA:DNA雙鏈體的RNA鏈的細胞內(nèi)切核酸酶。因此，RNase H的激活導致RNA靶的切割，從而極大提高基因表達的反義調(diào)節(jié)的效率。因此，和雜交至相同靶區(qū)域的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，在使用嵌合寡核苷酸時用較短的寡核苷酸經(jīng)常可以獲得可比的結(jié)果。RNA靶的切割通常可由凝膠電泳檢測，必要時由本領(lǐng)域已知的關(guān)聯(lián)核酸雜交技術(shù)檢測。在一個優(yōu)選的實施方案中，嵌合寡核苷酸包含至少一個經(jīng)修飾以增大靶結(jié)合親和力的區(qū)域，且通常包含充當RNAseH的底物的區(qū)域。寡核苷酸與其靶(在這種情況下為編碼ras的核酸)的親和力通常通過測量寡核苷酸/靶配對的Tm而測定，Tm是寡核苷酸和靶分離時的溫度，分離由分光光度法檢測。Tm越高，寡核苷酸與靶的親和力越大。本發(fā)明的嵌合反義化合物可作為上述兩種或更多種寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、 寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的復合結(jié)構(gòu)而形成。這樣的化合物在本領(lǐng)域也已被稱為雜合物或間合物(gapmer)。教導制備這種雜合物結(jié)構(gòu)的代表性的美國專利包括但不限于美國專利號 5，013，830,5, 149，797,5, 220，007,5, 256，775,5, 366，878,5, 403，711,5, 491，133、 5，565，350,5, 623，065,5, 652，355,5, 652，356 和 5，700，922，通過引用將每一項并入本文。在另一個優(yōu)選的實施方案中，經(jīng)修飾的寡核苷酸的區(qū)域包含至少一個在糖的2' 位置修飾的核苷酸，最優(yōu)選2' -0烷基、2' -0-烷基-0-烷基或2’ -氟代修飾的核苷酸。 在其它優(yōu)選的實施方案中，RNA修飾包括在嘧啶核糖、脫堿基殘基或在RNA 3'末端的倒置堿基(inverted base)上的2'-氟代、2'-氨基和2' 0_甲基修飾。通常將這樣的修飾并入寡核苷酸，且已顯示這些寡核苷酸比2 ‘-脫氧寡核苷酸對給定的靶具有更高的Tm (即更高的靶結(jié)合親和力)。這種增大的親和力的效果極大地提高基因表達的RNAi寡核苷酸抑制。RNAse H是切割RNA:DNA雙鏈體的RNA鏈的細胞內(nèi)切核酸酶，因此該酶的激活導致 RNA靶的切割，因此能極大地提高RNAi抑制的效率。RNA靶的切割通?？捎赡z電泳證實。 在另一個優(yōu)選的實施方案中，嵌合寡核苷酸也被修飾以提高核酸酶抗性。細胞包含多種可以降解核酸的內(nèi)切或外切核酸酶。已顯示許多核苷酸和核苷修飾使將它們并入的寡核苷酸比天然寡脫氧核苷酸對核酸酶降解的抗性更大。核酸酶抗性通常通過用細胞提取物或分離的核酸酶溶液培養(yǎng)寡核苷酸，并測量(通常通過凝膠電泳測量)隨時間剩余的完整寡核苷酸的程度而進行測量。經(jīng)過修飾以提高它們的核酸酶抗性的寡核苷酸比未修飾的寡核苷酸
24完整存活更長的時間。已表明多種寡核苷酸修飾提高或賦予核酸酶抗性。目前更優(yōu)選包含至少一個硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸。在某些情況下，提高靶結(jié)合親和力的寡核苷酸修飾也能獨立地提高核酸酶抗性。某些期望的修飾可見于De Mesmaeker等(1995)Acc. Chem. Res. ,28 :366-374。本發(fā)明展望的某些優(yōu)選寡核苷酸的具體實例包括那些包含修飾的骨架(例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵合或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵合)的寡核苷酸。最優(yōu)選有硫代磷酸酯骨架和那些有雜原子骨架(特別是 CH2—NH—0—CH2、CH, —N (CH3) —0—CH2 [稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI骨架]、 CH2—0—N (CH3) —CH2、CH2-N (CH3) —N (CH3) —CH2 和 0—N (CH3) —CH2—CH2 骨架)的寡核苷酸，其中天然磷酸二酯骨架表示為0-P—0-CH，。也優(yōu)選被De Mesmaeker等(1995) Acc. Chem. Res. 28 :366-374公開的酰胺骨架。還優(yōu)選具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸 (Summerton和Weller，美國專利號5，034，506)。在其它優(yōu)選的實施方案中，例如寡核苷酸的肽核酸(PNA)骨架、磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架取代，核苷酸被直接或間接地結(jié)合于聚酰胺骨架上的氮雜氮原子(Nielsen等(1991)kience 254，1497)。寡核苷酸也可以包含一種或多種取代的糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2'位置包含下列之一 0H、SH、SCH3、F、0CN、 0CH3 0CH3、0CH3 0(CH2)η CH3、0(CH2)η ΝΗ2 或 0(CH2)n CH3(其中 η 是從 1 到大約 10)； Cl到ClO低級烷基、烷氧基烷氧基、取代的低級烷基、烷芳基或芳烷基；Cl ；Br ；CN ；CF3 ； 0CF3 ；0-、S-或 N-烷基；0-、S-或 N-烯基；S0CH3 ； S02 CH3 ； 0Ν02 ；Ν02 ；Ν3 ；ΝΗ2 ；雜環(huán)烷基； 雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基團；報道基團；插入基團；改進寡核苷酸藥物動力學性質(zhì)的基團；或改進寡核苷酸藥效學性質(zhì)的基團和其它具有類似性質(zhì)的取代基。優(yōu)選的修飾包括2'-甲氧基乙氧基[2 ‘ -0-CH2 CH20CH3，也稱為 2' -0- -甲氧基乙基)](Martin 等(1995)Helv. Chim. Acta，78，486)。其它優(yōu)選的修飾包括 2'-甲氧基 O' -0—CH3), 2 ‘-丙氧基 O' -0CH2 CH2CH3)和 2 ‘-氟代 O' -F)。 類似的修飾也可以在寡核苷酸的其它位置上進行，特別是在3'末端核苷酸上的糖的3' 位置和5'末端核苷酸上的5'位置。寡核苷酸也可以有糖模擬物，例如環(huán)丁基代替戊呋喃糖(pentofuranosyl)基團。寡核苷酸也可另外地或可選地包括核堿基(本領(lǐng)域經(jīng)常簡稱為"堿基")修飾或取代。本文所用的"未修飾"或"天然"核苷酸包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶 (T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核苷酸包括在天然核酸中僅僅少見或臨時見到的核苷酸，例如次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶，特別是5-甲基胞嘧啶(也稱為5-甲基-2'脫氧胞嘧啶，在本領(lǐng)域中常稱為5-Me-C)、5_羥甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龍膽二糖基(gentobiosyDHMC和合成核苷酸例如2_氨基腺嘌呤、2_(甲氨基)腺嘌呤、2_(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它雜取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、 2-硫胸腺嘧啶、5-嗅尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤和 2，6- 二氨基嘌呤(Kornberg，Α.，DNA Replication, W. H. Freeman & Co.， San Francisco,1980, pp75-77 ；Gebeyehu, G. ， (1987) ^ Nucl. Acids Res. 15 :4513)。胃包括本領(lǐng)域已知的"通用"堿基，例如肌苷。已顯示5-Me-C取代增大核酸雙鏈體的穩(wěn)定性 0. 6-1. 2°C (Sanghvi, Y. S. , in Crooke, S. Τ.禾口 Lebleu,B. , eds. ,Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993，pp. 276—278)，且是目前優(yōu)選的堿基取代。
本發(fā)明寡核苷酸的另一種修飾包括將一個或多個部分或綴合物(它們提高寡核苷酸的活性或細胞攝取)化學連接到寡核苷酸。這樣的部分包括但不限于脂部分例如膽固醇部分、膽固醇基部分(Letsinger 等(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,6553)、膽酸 (Manoharan 等(1994) Bioorg. Med. Chem. Let. 4，1053)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇 (Manoharan 等(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660,306 ；Manoharan 等(1993) Bioorg. Med. Chem. Let. 3，2765)、硫代膽固醇(Oberhauser 等(199 Nucl. Acids Res. 20，53 、脂肪族鏈，例如十二烷二醇或i^一烷基殘基(Saison-Behmoaras 等 EMBO J. 1991，10，111 ；Kabanov 等 (1990) FEBS Lett. 259, 327 ；Svinarchuk ^ (1993) Biochimie 75，49)、磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基銨1，2- 二 -0-十六烷基-rac-甘油基-3-H-膦酸酯(Manoharan 等(1995) Tetrahedron Lett. 36，3651 ;Shea 等(1990) Nucl. Acids Res. 18，3777)、多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan 等(1995)Nucleosides & Nucleotides，14，969)或金剛燒乙酸 (Manoharan等(Ig^)iTetrahedron Lett. 36，3651)。本領(lǐng)域已知包含親脂部分的寡核苷酸和制備這樣的寡核苷酸的方法，例如美國專利號5，138，045,5, 218，105和5，459，255。不必對給定的寡核苷酸的所有位點進行一致的修飾，實際上上述不止一種修飾可以并入單一寡核苷酸甚至寡核苷酸內(nèi)的單一核苷內(nèi)。本發(fā)明也包括是上文定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子綴合了另一部分，其包括但不限于脫堿基核苷酸、聚醚、多胺、聚酰胺、肽、糖、脂或聚烴化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到這些分子能在糖、堿基或磷酸酯基團的幾個位置上連接到一個或多個任意的包含核酸分子的核苷酸。根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸可以通過公知的固相合成技術(shù)方便和常規(guī)地制備。幾個供貨商出售用于這種合成的設(shè)備，包括Applied Biosystems0也可采用任何其它用于這種合成的裝置，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知寡核苷酸的實際合成。也公知使用相似技術(shù)制備其它寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。也公知使用類似技術(shù)和市售的修飾的阿米迪特(amidite)和可控孔度玻璃(CPG)產(chǎn)品(例如生物素、熒光素、吖啶或補骨脂素修飾的阿米迪特和/或CPG(G1 en Research, Sterling VA有售))，以合成熒光標記的、生物素化的或其它修飾的寡核苷酸，例如膽固醇修飾的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，使用修飾例如使用LNA單體以提高作用的潛能、特異性和持續(xù)時間并拓寬寡核苷酸的給藥路線，包括當前的化學，例如M0E、ANA、FANA、PS等(^1Iman等Q000) Current Opinions in Drug Discovery & Development Vol. 3 No 2)。這可通過由 LNA 單體取代當前寡核苷酸中的某些單體實現(xiàn)。LNA修飾的寡核苷酸的大小可以與母體化合物相似或可以更大或優(yōu)選更小。優(yōu)選這樣的LNA修飾的寡核苷酸包含小于大約70%、更優(yōu)選小于大約60%，最優(yōu)選小于大約50% LNA單體，它們的大小在大約5和25個核苷酸之間，更優(yōu)選在大約12和20個核苷酸之間。優(yōu)選的修飾的寡核苷酸骨架包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯，包括3'烯基膦酸酯和手性膦酸酯、亞膦酸酯、氨基磷酸酯，包含3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3' -5'鍵合的硼烷磷酸酯、這些的2' -5'連接的類似物和那些具有倒置極性(inverted polarity)的，其中相鄰核苷單元對3' -5'和5' -3'連接或2' -5'和5' -2'連接。也包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。教導制備上述含磷鍵合的代表性的美國專利包括但不限于美國專利號 3，687，808,4，469，863,4，476，301,5，023，243,5，177，196,5，188，897,5，264，423, 5，276，019,5，278，302,5，286，717,5, 321, 131,5, 399，676,5，405，939,5，453，496, 5，455，233、5，466，677、5，476，925、5，519，126、5，536，821、5，541，306、5，550，111、 5，563，253,5, 571，799,5, 587，361 和 5，625，050，通過引用將每一項并入本文。優(yōu)選的修飾的寡核苷酸骨架(其中不包括磷原子)具有由以下形成的骨架短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合或一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合。這些包括具有以下的那些嗎啉代鍵合(部分由核苷的糖部分形成)、硅氧烷骨架、硫化物、亞砜和砜骨架、甲酰乙酰基(Formacetyl)和硫代甲酰乙?；羌?、亞甲基甲酰乙?；土虼柞Ｒ阴；羌?、含烯骨架、氨基磺酸酯骨架、亞甲基亞氨基和亞甲基胼基骨架、磺酸酯和磺酰胺骨架、酰胺骨架和其它具有混合的N、0、S和CH2組分部分的骨架。教導制備上述寡核苷的代表性的美國專利包括但不限于美國專利號5，034，506、 5，166，315,5，185，444,5，214，134,5，216，141,5，235，033,5，264，562,5，264，564, 5，405，938,5，434，257,5，466，677,5，470，967,5，489，677,5，541，307,5，561，225, 5，596，086,5，602，240,5，610，289,5，602，240,5，608，046,5，610，289,5，618，704, 5，623，070,5, 663，312,5, 633，360,5, 677，437 和 5，677，439，通過引用將每一項并入本文。在其它優(yōu)選的寡核苷酸模擬物中，核苷酸單元的糖和核苷間鍵合(即骨架)被新的基團取代。堿基單元被保留用于與合適的核酸靶化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物 (已顯示具有優(yōu)良雜交性質(zhì)的寡核苷酸模擬物)稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架(特別是氨基乙基甘氨酸骨架)取代。核堿基被保留并直接或間接結(jié)合骨架酰胺部分的氮雜氮原子。教導制備PNA化合物的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5，539，082,5, 714，331和5，719，262，通過引用將每一項并入本文。PNA化合物的其它教導可見于 Nielsen 等(1991) Science 254，1497-1500。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸具有硫代磷酸酯骨架和寡核苷具有雜原子骨架，特別是CH2-NH-0-CH2-、稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI骨架的-CH2_N(CH3 )-0-CH2-、-CH2-0-N (CH3) -CH2-、-CH2N (CH3) -N (CH3) CH2-和-0-N (CH3) -CH2-CH2-，其中天然磷酸二酯骨架表示成上面引用的美國專利號5，489，677的-0-P-0-CH2-，和上面引用的美國專利號5，602，240的酰胺骨架。也優(yōu)選上面引用的美國專利號5，034，506的具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。修飾的寡核苷酸也可含有一種或多種取代的糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2'位置包含以下之一 0H;F ；0-、S-、或N-烷基；0-、S-、或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或0烷基-0-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C到CO烷基或C2到CO烯基和炔基(C to CO alkyl or C2 to CO alkenyl and alkynyl)。尤其優(yōu)選的是 0 (CH2) η 0mCH3、 0 (CH2) η，0CH3、0 (CH2) ηΝΗ2、0 (CH2) nCH3、0 (CH2) n0NH2 和 0 (CH2n0N (CH2) nCH3) 2，其中 η 和 m可以是1到大約10。其它優(yōu)選的寡核苷酸在2'位置包含以下之一C到CO、低級烷基、 取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或0-芳烷基、SH、SCH3、0CN, Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02CH3、0N02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團、報道基團、插入基團、改進寡核苷酸藥物動力學性質(zhì)的基團、或改進寡核苷酸藥效學性質(zhì)的基團和其它具有相似性質(zhì)的取代基。優(yōu)選的修飾包括 2'-甲氧基乙氧基O' -0-CH2CH20CH3，也稱為2' -0- -甲氧基乙基)或2 ‘ -Μ0Ε) (Martin等(199 Helv. Chim. Acta, 78,486-504)，即烷氧基烷氧基基團。其它優(yōu)選的修飾包含2' -二甲基氨基氧基乙氧基(即O(Cffi) 20N(OK) 2基團，也稱為2' -DMA0E，如本文以下實施例所述，和2' -二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域也稱為2' -0-二甲基氨基乙氧基乙基或 2 ‘ -DMAE0E)，即 2 ‘ -0-CH2—0-CH2-N (CH2) 2。其它優(yōu)選的修飾包括2 ‘-甲氧基O ‘ -0CH3)、2 ‘-氨基丙氧基 (2' -0CH2CH2CH2NH2)和2'-氟代O' -F)。類似的修飾也可以在寡核苷酸的其它位置上進行，特別是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置或2' -5'連接的寡核苷酸中和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸也可以具有糖模擬物例如環(huán)丁基部分取代戊呋喃糖基糖。 教導制備這種修飾的糖結(jié)構(gòu)的美國專利包括但不限于美國專利號4，981，957,5, 118，800、 5，319，080,5，359，044,5，393，878,5，446，137,5，466，786,5，514，785,5，519，134, 5，567，811,5, 576，427、5，591，722、5，597，909、5，610，300、5，627，053、5，639，873、 5，646，265,5, 658，873,5, 670，633 和 5，700，920，通過引用將每一項并入本文。寡核苷酸也可以包括核堿基(本領(lǐng)域經(jīng)常簡稱為"堿基")修飾或取代。本文所用的"未修飾"或"天然"核苷酸包含嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，和嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核苷酸包括其它合成和天然核苷酸，例如
5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-鹵素尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，
6-氮雜尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4_硫尿嘧啶，8-鹵素、8-氨基、 8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵素特別是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基奎寧和7-甲基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和 8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。另外，核苷酸包括那些公開于美國專利號3，687，808、那些公開于'The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering ' ,858-859 頁， Kroschwitz, J. I.編輯 John Wiley & Sons，1990、那些公開于 Englisch 等'Angewandle Chemie, International Edition ‘，1991，30，613 頁和那些公開于 Sanghvi，Y. S.，15 章，‘Antisense Research and Applications' ,289-302 頁，Crooke, S. Τ.禾口 Lebleu, B. ea. , CRC I^ress，1993中的核苷酸。這些核苷酸中特定的一些對增大本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力特別有用。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已顯示5-甲基胞嘧啶取代增大核酸雙鏈體穩(wěn)定性0. 6-1. 20C (Sanghvi, Y. S.，Crooke, S. T.和Lebleu， B.,編輯'Antisense Research and Applications' , CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)，且為目前優(yōu)選的堿基取代，當結(jié)合2' -0甲氧基乙基糖修飾時，它更被特別優(yōu)選。教導制備上述修飾的核苷酸和其它修飾的核苷酸的代表性美國專利包括但不限于美國專利號 3，687，808、以及 4，845，205,5, 130，302,5, 134，066,5, 175，273,5, 367，066、 5，432，272、5，457，187、5，459，255、5，484，908、5，502，177、5，525，711、5，552，540、 5，587，469,5, 596，091,5, 614，617,5, 750，692 和 5，681，941，通過引用將每一項并入本文。本發(fā)明寡核苷酸的另一種修飾包括將一個或多個部分或綴合物(它們提高寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取)化學連接到寡核苷酸。這樣的部分包括但不限于脂部分例如膽固醇部分(Letsinger等(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,6553-6556)、膽酸(Manoharan 等(1994) Bioorg. Med. Chem. Let. 4， 1053-1060)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan 等(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660,306-309 ；Manoharan 等(1993) Bioorg. Med. Chem. Let. 3，2765-2770)、硫代膽固醇 (Oberhauser 等(199 Nucl. Acids Res. 20，533-538)、脂肪族鏈，例如十二烷二醇或^^一烷基殘基(Kabanov 等(1990) FEBS Lett. 259，327-330 ；Svinarchuk 等(199 Biochimie 75， 49-54)、磷脂，例如二 -十六烷基-rac-甘油或三乙基銨1，2_ 二 -0-十六烷基-rac-甘油基-3-H-磷酸酯(Manoharan 等(IggS)iTetrahedron Lett. 36，3651-3654 ;Shea 等(1990) Nucl. Acids Res. 18，3777-3783)、多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan 等(1995)Nucleosides & Nucleotides，14,969-973)或金剛燒乙酸(Manoharan 等(IggS)iTetrahedron Lett. 36， 3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra 等(1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229-237)或十八烷基胺或己基氨基-羰基-叔羥膽固醇部分(Crooke等(1996) J. Pharmacol. Exp. Ther.， 277,923-937)。教導制備這些寡核苷酸綴合物的代表性美國專利包括但不限于美國專利
號 4，828，979,4, 948，882,5,218，105,5,525，465、5，541，313,5，545，730、5:’ 552,,538、5，578’ 717,5,580，731,5,580，731,5,591，584、5’ 109，124,5,118，802、5，138，045、5，414:’ 077,5,486，603,5,512，439,5,578，718、5:’ 608，046,4，587，044、4，605，735、4，667;,025,4，762，779,4,789，737,4，824，941、4:’ 835，263,4，876，335、4，904，582、4，958;,013,5,082，830,5，112，963,5，214，136、5;,082，830,5，112，963、5，214，136、5，245;,022、5，254，469,5，258，506,5,262，536、5;,272，250,5,292，873、5，317，098、5，371,,241,5,391，723,5,416，203,5，451，463、5;,510，475,5，512，667、5，514，785、5，565，552,5，567，810,5,574，142,5,585，481、5’ 587，371,5，595，726、5，597，696、5，599，923,5, 599，928 和 5，688，941，通過引用將每— 項并入本文。藥物發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物也可用于藥物發(fā)現(xiàn)和靶確認的領(lǐng)域。本發(fā)明包括在藥物發(fā)現(xiàn)努力中使用本文鑒別的化合物和優(yōu)選靶片段，進而闡述存在于血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)多核苷酸和疾病狀態(tài)、顯型或癥狀之間的關(guān)系。這些方法包括檢測或調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸，包括使樣品、組織、細胞或生物接觸本發(fā)明的化合物，測量血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或在治療后某時間的相關(guān)表型或化學終點，以及任選地將測量的值和未處理樣品或用本發(fā)明其它化合物處理的樣品比較。這些方法也可以與其它實驗平行進行或聯(lián)合進行，進而測定未知基因?qū)τ诎写_認過程的功能或者測定特定基因產(chǎn)品作為治療或預防特定疾病、癥狀或表型的靶的有效性。評價基因表達的上調(diào)或抑制將外源核酸轉(zhuǎn)入宿主細胞或生物體可以通過直接檢測細胞或生物體中該核酸的存在來評價。這種檢測可用本領(lǐng)域已知的幾種方法實現(xiàn)。例如，外源核酸的存在可通過DNA印跡法(Southern blot)或通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)(它使用特異性放大和核酸有關(guān)的核苷酸序列的引物)而檢測。外源核酸的表達也可以使用包括基因表達分析的常規(guī)方法來測量。例如，從外源核酸產(chǎn)生的mRNA可以使用DNA印跡法和反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測禾口定量。從外源核酸表達RNA也可以通過測量酶活性或報道蛋白活性來檢測。例如，反義調(diào)節(jié)活性可以間接地按照靶核酸表達的減小或增大(它作為外源核酸產(chǎn)生效應(yīng)子RNA的指示)而測量?；谛蛄斜Ｊ匦?conservation)，引物可被設(shè)計和用于放大靶基因的編碼區(qū)域。最初，來自每個基因的最高度表達的編碼區(qū)可用來建立模型對照基因，但也可以使用任何編碼或非編碼區(qū)。每個對照基因通過在報道編碼區(qū)和其多聚(A)信號之間插入每個編碼區(qū)而裝配。這些質(zhì)粒將產(chǎn)生在基因的上游部分具有報道基因和在3'非編碼區(qū)具有潛在RNAi靶的mRNA。通過調(diào)節(jié)報道基因?qū)⑹箚蝹€反義寡核苷酸的有效性得到試驗。在本發(fā)明方法中有用的報道基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、堿性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶 (LacZ)、β -葡萄糖透明質(zhì)酸酶(⑶S)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)、辣根過氧化物酶(HRP)、螢光素酶(Luc)、胭脂氨酸合成酶(N0Q、章魚堿合成酶(0CQ和它們的衍生物?？捎枚喾N可選標記，它們賦予針對氨芐青霉素、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、 氨甲喋呤、膦絲菌素、嘌呤霉素和四環(huán)素的抗性。測定報道基因的調(diào)節(jié)的方法在本領(lǐng)域是公知的，且包括但不限于熒光法(例如熒光光譜法、熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)、熒光顯微鏡術(shù))、抗生素抗性測定。試劑盒、研究試劑、診斷和治療本發(fā)明的化合物可以用于診斷、治療和預防，以及作為研究試劑和試劑盒的組件。 另外，能以精密的特異性抑制基因表達的反義寡核苷酸，經(jīng)常被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用于闡釋特定基因的功能或用于區(qū)分生物路徑的各種成員之間的功能。對于用于試劑盒和診斷以及各種生物系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物(單獨或聯(lián)合其它化合物或治療)可用作有差別的和/或組合的分析中的工具，以闡釋細胞和組織內(nèi)表達的基因的一部分或整個互補的表達模式。本文所用的術(shù)語"生物系統(tǒng)"或"系統(tǒng)"定義為表達，或使之有能力表達血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的產(chǎn)物的任何生物體、細胞、細胞培養(yǎng)物或組織。這些包括但不限于人、轉(zhuǎn)基因動物、細胞、細胞培養(yǎng)物、組織、異種移植物、移植物和它們的組合。作為一個非限制性的實例，比較用一種或多種反義化合物處理的細胞或組織和未用反義化合物處理的對照細胞或組織的表達模式，并分析產(chǎn)生的模式的不同基因表達水平，它們與被檢測基因的例如疾病關(guān)聯(lián)、信號通路、細胞定位、表達水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。這些分析可以在經(jīng)刺激或未經(jīng)刺激的細胞上和在存在或不存在影響表達模式的其它化合物時進行。本領(lǐng)域已知的基因表達分析的方法的實例包括DNA陣列或微陣列(Brazma和 Vilo, (2000) FEBS Lett.，480，17-24 ;Celis 等(2000) FEBS Lett.，480，2-16)、SAGE (基因表達的連續(xù)分析)(Madden 等 Q000)Drug Discov. Today, 5,415-425)、READS (消化的 cDNA 的限制性酶放大)(Prashar 和 Weissman，(1999)Methods Enzymo 1.，303，258-72)、TOGA (全基因表達分析)(Sutcliffe 等 Q000)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，97，1976-81)、蛋白質(zhì)陣列和蛋白組學(Celis 等(2000) FEBS Lett.，480，2-16 Jungblut 等，Electrophoresis， 1999，20，2100-10)、表達的序列標簽(EST)測序(Celis 等，F(xiàn)EBS Lett.，2000，480，2-16 ； Larsson 等，J. Biotechnol.，2000，80，143-57)、消減式 RNA指紋法(SuRF) (Fuchs 等，(2000) Anal. Biochem. 286，91-98 ；Larson 等，(2000) Cytometry 41，203-208)、消減式克隆、差異展示(DD) (Jurecic 和 Belmont, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3，316-21)、比較基因組雜交(Carulli 等，(1998) J. Cell Biochem. Suppl.，31，286-96)、FISH(熒光原位雜交)技術(shù)(Going 和 Gusterson，(1999) Eur. J. Cancer, 35,1895-904)和質(zhì)譜法(To, Comb. (2000) Chem. High Throughput Screen,3,235-41)。本發(fā)明的化合物可用于研究和診斷，因為這些化合物雜交至編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的核酸。例如，寡核苷酸(它們在本文公開的使它們成為有效的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)調(diào)節(jié)劑的效率和條件下雜交)在有利于基因放大或檢測的條件下分別是有效的引物或探針。這些引物和探針可用于需要核酸分子(它們編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)) 的特異性檢測的方法中，和用于所述核酸分子的放大(用于檢測或用于進一步研究血管內(nèi)皮生長因子(VEGF))中。本發(fā)明的反義寡核苷酸(特別是引物和探針)和編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的核酸的雜交可通過本領(lǐng)域已知的方法檢測。這樣的方法可以包括將酶綴合到寡核苷酸、放射標記寡核苷酸或任何其它適合的檢測方法。也可以制備將這樣的檢測方法用于檢測樣品中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平的試劑盒。為了治療用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員也利用反義的特異性和靈敏性。已將反義化合物用作治療動物(包括人)的疾病狀態(tài)的治療部分。反義寡核苷酸藥物已經(jīng)安全和有效地給予人，目前也在進行許多臨床試驗。因此已確定寡核苷酸可以是有用的治療手段，所述治療手段可經(jīng)設(shè)置用于治療細胞、組織和動物(尤其是人)的治療方案。對于治療，通過給予根據(jù)本發(fā)明的反義化合物來治療疑似具有疾病或病癥(其可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的表達來治療)的動物(優(yōu)選為人)。例如， 在一個非限制性實施方案中，方法包括將治療有效量的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)調(diào)節(jié)劑給予需要治療的動物的步驟。本發(fā)明的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)調(diào)節(jié)劑有效地調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的活性或調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白的表達。在一個實施方案中，相對于對照，動物中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的活性或表達被抑制大約10%。優(yōu)選動物中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的活性或表達被抑制大約30%。更優(yōu)選動物中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的活性或表達被抑制50%或更多。因此，相對于對照，寡聚化合物調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) mRNA的表達至少10 %、至少50 %、至少25 %、至少30 %、至少40 %、 至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。在一個實施方案中，相對于對照，動物中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的活性或表達增大了大約10%。優(yōu)選動物中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的活性或表達增大了大約30%。 更優(yōu)選動物中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的活性或表達增大了大約50%或更多。因此，相對于對照，寡聚化合物調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA的表達至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。例如，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表述的減少可以在血清、血液、脂肪組織、肝臟
31或動物的任何其它體液、組織或器官中測量。優(yōu)選被分析的所述液體、組織或器官中所含的細胞含有編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)肽和/或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白自身的核酸分子。通過添加有效量的化合物到適合的藥學可接受的稀釋劑或載體中，本發(fā)明的化合物可用于藥學組合物。本發(fā)明的化合物和方法的用途也可用于預防。綴合物本發(fā)明寡核苷酸的另一種修飾包括將一個或多個部分或綴合物(它們提高寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取)化學連接到寡核苷酸。這些部分或綴合物可以包括共價連接到官能團(例如初級或次級羥基)的綴合基團。本發(fā)明的綴合基團包括插入基團、 報道分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、提高寡聚體藥效性質(zhì)的基團和提高寡聚體藥物動力學性質(zhì)的基團。典型的綴合基團包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸酯、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素和染料。在本發(fā)明的上下文中，提高藥效學性質(zhì)的基團包括改進攝取、提高降解抗性和/或增強和靶核酸的序列特異性雜交的基團。在本發(fā)明的上下文中，提高藥物動力學性質(zhì)的基團包括改進本發(fā)明化合物的攝取、分布、代謝或排泄的基團。代表性的綴合基團公開于1992年10月23號提出的國際專利申請?zhí)朠CT/US92/09196， 和美國專利號6，287, 860，通過引用將它們并入本文。綴合物部分包括但不限于脂質(zhì)部分例如膽固醇部分、膽酸、硫醚，例如己基-5-三苯甲基硫醇、硫代膽固醇、脂肪族鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基、磷脂，例如二 -十六烷基-rac-甘油或三乙基銨1，2- 二 -0-十六烷基-rac-甘油基-3-H膦酸酯、多胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇部分。本發(fā)明的寡核苷酸也可以綴合到活性藥物物質(zhì)， 例如阿司匹林、華法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)_普拉洛芬、卡洛芬、丹磺酰肌氨酸、2，3，5_三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜卓 (diaz印ine)、吲哚美辛、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗菌藥或抗生素。教導制備這些寡核苷酸綴合物的代表性的美國專利包括但不限于美國專利
號4, 828,979、4，948，882,5, 218，105,5, 525，465、5，541, 313,5，545，730、5:’ 552,,538、5，578:’ 717,5,580，731,5，580，731,5，591，584,5;,109，124,5,118，802,5，138，045、5，414:’ 077,5,486，603,5，512，439,5，578，718、5:,608，046,4，587，044,4,605，735、4，667;,025,4，762，779,4,789，737,4，824，941,4:,835，263,4,876，335,4，904，582、4，958:’ 013,5,082，830,5,112，963,5，214，136、5:,082，830,5,112，963,5，214，136、5，245;,022、5，254，469,5，258，506,5，262，536,5;,272，250,5，292，873,5，317，098、5，371;,241,5,391，723,5，416，203,5，451，463,5,,510，475,5，512，667,5，514，785、5，565;,552 > 5 j567，810,5,574，142,5,585，481,5,587，371,5,595，726,5,597，696、
5，599，923,5, 599，928 和 5，688，941。制劑本發(fā)明的化合物也可以和其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、制成膠囊、 綴合或關(guān)聯(lián)，成為例如脂質(zhì)體、靶向受體的分子、口服、直腸、局部或其它制劑，以協(xié)助攝取、 分布和/或吸收。教導制備這種協(xié)助攝取、分布和/或吸收的制劑的代表性美國專利包括但不限于美國專利號 5，108，921,5, 354，844,5, 416，016,5, 459，127,5, 521，291,5, 543，165、 5，547，932,5，583，020,5，591，721,4，426，330,4，534，899,5，013，556,5，108，921,5，213，804,5，227，170,5，264，221,5，356，633,5，395，619,5，416，016,5，417，978, 5，462，854,5，469，854,5，512，295,5，527，528,5，534，259,5，543，152,5，556，948, 5，580，575和5，595，756，通過引用將每一項并入本文。雖然，為了調(diào)節(jié)靶表達和/或功能，反義寡核苷酸不需要在載體的環(huán)境中給藥，但本發(fā)明的實施方案涉及用于反義寡核苷酸的表達的表達載體構(gòu)建體，包含啟動子、雜交啟動子基因序列并具有強組成啟動子活性，或在期望的情形下能被誘導的啟動子活性。在一個實施方案中，發(fā)明實施包括用合適的核酸遞送系統(tǒng)給予前述反義寡核苷酸的至少一種。在一個實施方案中，該系統(tǒng)包含可操作地連接到多核苷酸的非病毒載體。這樣的非病毒載體的實例包括只有寡核苷酸(例如SEQ ID NO 4-9中的任一種或多種)或者寡核苷酸聯(lián)合合適的蛋白、多糖或脂質(zhì)制劑。另外合適的核酸遞送系統(tǒng)包括病毒載體，通常是來自腺病毒、腺病毒相關(guān)的病毒 (AAV)、依賴輔助的腺病毒(helper-d印endent adenovirus)、逆轉(zhuǎn)錄病毒或日本脂質(zhì)體的血細胞凝集素病毒(hemagglutinatin virus) (HVJ)復合物的至少一種的序列。優(yōu)選病毒載體包含可操作地連接到多核苷酸的強真核啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子。另外優(yōu)選的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學綴合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一個優(yōu)選的基于HIV的病毒載體包含至少兩個載體，其中g(shù)ag和pol基因來自HIV基因組，env基因來自另一個病毒。優(yōu)選DNA病毒載體。 這些載體包括諸如正痘(orthopox)或禽痘(avipox)載體的痘載體、諸如單純皰疹I(lǐng)病毒 (HSV)載體的皰疹病毒載體[Geller，Α. I.等(1995) J. Neurochem,64 :487 ；Lim, F.等，于 DNA Cloning :Mammalian Systems, D.Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995) ；Geller, A. I.等(1993)Proc Natl. Acad. Sci. :U. S. A. :90 7603 ；Geller, A. I.等 (1990)Proc Natl. Acad. Sci USA :87 :1149]、腺病毒載體(LeGal LaSalle 等，Science，259 : 988(1993) ；Davidson 等，(1993) Nat. Genet. 3 :219 ；Yang 等(1995) J. Virol. 69 :2004)和腺關(guān)聯(lián)病毒載體(Kaplitt, Μ. G.等(1994) Nat. Genet. 8 :148)。本發(fā)明的反義化合物包括任何藥學可接受的鹽、酯、或這樣的酯的鹽、或任何其它化合物，其在給予包括人的動物時能(直接或間接)提供生物活性代謝物或其剩余物。術(shù)語"藥學可接受的鹽"指本發(fā)明化合物的生理和藥學可接受的鹽，即保留母體化合物的期望的生物活性，且不使其具有不期望的毒性效果的鹽。對于寡核苷酸，優(yōu)選的藥學可接受的鹽的實例和它們的用途進一步描述于美國專利號6，觀7，860，通過引用將其并入本文。本發(fā)明也包括包含本發(fā)明的反義化合物的藥學組合物和制劑。本發(fā)明的藥學組合物可根據(jù)期望的是局部還是全身治療以及待治療的部位而用多種方式給藥。給藥可以是局部給藥(包括眼部給藥和向粘膜給藥(包括陰道和直腸遞送))、肺部給藥(例如通過吸入或吹入粉末或氣霧劑(包括通過噴霧器)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和經(jīng)皮給藥)、口服或胃腸外給藥。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或注入、或顱內(nèi)(例如鞘膜內(nèi)或心室內(nèi))給藥。據(jù)信具有至少一個2' -0-甲氧基乙基修飾的寡核苷酸對于口服給藥特別有用。用于局部給藥的藥學組合物和制劑可以包括經(jīng)皮貼劑、藥膏、洗劑、乳劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末。常規(guī)藥學載體、水性、粉末或油性基底、增稠劑等可以是必需或期望的。經(jīng)涂布的避孕套、手套等也可以是有用的。
33
本發(fā)明的藥學制劑(其可以便利地以單元劑量形式存在)可根據(jù)藥學工業(yè)公知的常規(guī)技術(shù)制備。這樣的技術(shù)包括使活性成分和藥學載體或賦形劑關(guān)聯(lián)的步驟。一般而言， 制劑通過使活性成分和液體載體或精細分開的固體載體或這兩者均勻地和密切地相關(guān)聯(lián)， 然后在必要時使產(chǎn)物成型，而制備。本發(fā)明的組合物可以配制成任意的許多可能劑型，例如但不限于片劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿劑、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物也可以配制成水性、非水性或混合介質(zhì)中的懸浮液。水性懸浮液可以進一步包含增大懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。懸浮液也可以包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥學組合物包括但不限于溶液、乳劑、泡沫和含脂質(zhì)體的制劑。本發(fā)明的藥學組合物和制劑可以包含一種或多種滲透促進劑、載體、賦形劑或其它活性或非活性成分。乳劑通常是一種液體以直徑通常超過0. 1 μ m的液滴的形式分散于另一種的非均相體系。除了分散的相和活性藥物(其可以作為水相或油相中的溶液存在或者自身作為單獨的相存在)，乳劑可以包含另外的組分。本發(fā)明的實施方案包括微乳劑。乳劑及其用途在本領(lǐng)域是公知的，并進一步描述于美國專利號6，287, 860。本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。本文所用的術(shù)語"脂質(zhì)體"意指由排列成球形雙層的兩親的脂質(zhì)組成的囊泡。脂質(zhì)體是單層或多層囊泡，其具有由親脂材料形成的膜和包含待遞送組合物的水性內(nèi)部。陽離子脂質(zhì)體是帶正電的脂質(zhì)體，據(jù)信它們與帶負電的DNA 分子互相作用形成穩(wěn)定的復合體。據(jù)信對PH敏感或帶負電的脂質(zhì)體捕獲DNA而不是與它復合。陽離子和非陽離子脂質(zhì)體都已被用于向細胞遞送DNA。脂質(zhì)體也包括"立體穩(wěn)定的"脂質(zhì)體，本文所用的該術(shù)語指包含一種或多種專門脂質(zhì)的脂質(zhì)體。當并入脂質(zhì)體時，這些專門脂質(zhì)得到相對于沒有這些專門脂質(zhì)的脂質(zhì)體具有提高的循環(huán)壽命的脂質(zhì)體。立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實例是以下那些，其中脂質(zhì)體中形成囊泡的脂質(zhì)部分的一部分包含一種或多種糖脂，或者衍生自一種或多種親水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)部分。脂質(zhì)體和它們的用途進一步描述于美國專利號6，觀7，860。本發(fā)明的藥學制劑和組合物也可以包括表面活性劑。表面活性劑在藥品、制劑和乳劑中的用途是本領(lǐng)域公知的。表面活性劑和它們的用途進一步描述于美國專利號 6，287, 860，通過引用將其并入本文。在一個實施方案中，本發(fā)明采用多種滲透促進劑進行核酸(特別是寡核苷酸)的有效遞送。除了幫助非親脂性藥物擴散穿過細胞膜，滲透促進劑也提高親脂藥物的滲透性。 滲透促進劑可以分類成屬于五個寬泛的類型(即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑)之一。滲透促進劑和它們的用途進一步描述于美國專利號6，287, 860， 通過引用將其并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到制劑通常根據(jù)它們的預期用途，即給藥途徑而設(shè)計。優(yōu)選的用于局部給藥的制劑包括那些本發(fā)明的寡核苷酸與局部遞送劑(例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑)混合的制劑。優(yōu)選的脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性(例如二油?；?磷脂?；鵇OPE乙醇胺、二肉豆蔻?；字；憠A DMPC、二硬脂?；字；憠A)、陰性(例如二肉豆蔻酰基磷脂?；视虳MPG)和陽離子性(例如二油?；募谆被鵇OTAP和二油酰基-磷脂?；掖及稤0TMA)。
對于局部或其它給藥，本發(fā)明寡核苷酸可被脂質(zhì)體包裹在內(nèi)或可與之形成復合物，特別是和陽離子性脂質(zhì)體?；蛘?，寡核苷酸可以和脂質(zhì)復合，特別是和陽離子性脂質(zhì)。優(yōu)選的脂肪酸和酯，它們的藥學可接受鹽和它們的用途進一步描述于美國專利號6，287, 860。用于口服給藥的組合物和制劑包括粉末或粒料、微顆粒、納顆粒、在水或非水性介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、囊劑、片劑或小片劑?？梢云谕龀韯?、調(diào)味劑、稀釋齊U、乳化劑、分散助劑或粘合劑。優(yōu)選的口服制劑是那些其中本發(fā)明的寡核苷酸與一種或多種滲透促進劑表面活性和螯合劑聯(lián)合給藥的制劑。優(yōu)選的表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或其鹽、膽酸和/或其鹽。優(yōu)選的膽酸/鹽和脂肪酸以及它們的用途進一步描述于美國專利號6，287, 860，通過引用將其并入本文。還優(yōu)選滲透促進劑的組合物，例如脂肪酸/鹽聯(lián)合膽酸/鹽。特別優(yōu)選的組合物是月桂酸的鈉鹽、癸酸和UDCA。其它滲透促進劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚。本發(fā)明的寡核苷酸可以粒料形式(包括噴霧的干燥顆粒或復合形成微顆?；蚣{顆粒)口服遞送。寡核苷酸復合劑和它們的用途進一步描述于美國專利號6，287, 860，通過引用將其并入本文。用于腸道外、鞘膜內(nèi)或心室內(nèi)給藥的組合物和制劑可以包括無菌水溶液，該無菌水溶液也可以包含緩沖劑、稀釋劑和其它合適添加劑例如但不限于滲透促進劑、載體化合物和其它藥學可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的某些實施方案提供包含通過一種或多種寡聚化合物和一種或多種通過非反義機制起作用的其它化學治療劑的藥學組合物。這些化學治療劑的實例包括但不限于癌癥化學治療藥物例如柔紅霉素、道諾霉素、更生霉素、阿霉素、表柔比星、伊達比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、二氯乙基-亞硝基脲 (bischloroethyl-nitrosurea)、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、普卡霉素、潑尼松、羥孕酮、睪丸酮、他莫昔芬、氮烯唑胺、甲基芐胼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、 6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧柯福霉素、4-羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿嘧啶(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙堿、泰素、 長春新堿、長春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、 順鉬和己烯雌酚(DES)。當與本發(fā)明的化合物聯(lián)用時，這些化學治療劑可單獨使用(例如 5-FU和寡核苷酸)、依序使用(例如5-FU和寡核苷酸用一段時間，接著用MTX和寡核苷酸) 或與一種或多種其它這樣的化學治療劑聯(lián)用(例如5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放射治療和寡核苷酸)。消炎藥(包括但不限于非類固醇消炎藥和皮質(zhì)激素)和抗病毒藥物(包括但不限于利巴韋林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋)也可以結(jié)合到本發(fā)明的組合物。反義化合物和其它非反義藥物的組合也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。兩種或更多種相結(jié)合的化合物可以一起使用或依序使用。在另一個相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明的組合物可以包含一種或多種靶向第一核酸的反義化合物(特別是寡核苷酸)和一種或多種靶向第二核酸靶的另外的反義化合物。 例如第一個靶可以是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的特定反義序列，且第二個靶可以是來自另一個核苷酸序列的區(qū)域?；蛘?，本發(fā)明的組合物可以包含靶向相同血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)核酸靶的不同區(qū)域的兩種或更多種反義化合物。本文說明了反義化合物的許多實例，其它可選自本領(lǐng)域已知的適合的化合物。兩種或更多種相結(jié)合的化合物可以一起使用
35或依序使用。給藥治療組合物的配方和它們的后續(xù)服藥(給藥)相信是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能之內(nèi)。給藥取決于待治療疾病狀態(tài)的嚴重性和反應(yīng)，治療過程可持續(xù)幾天到幾月，或直到治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減輕。最佳給藥方案可從患者體內(nèi)藥物累積的測量來計算。普通技術(shù)人員能容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復率。最佳劑量可以根據(jù)個別寡核苷酸的相對功效而變化，且一般可以根據(jù)在體外和體內(nèi)動物模型中發(fā)現(xiàn)有效的EC50來估算?？傮w而言， 劑量是從0. 01 μ g到IOOg每千克體重，可以每天、每周、每月或每年給藥一次或多次，甚至每2到20年給藥一次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能根據(jù)在體液或組織中測量的藥物的停留時間和濃度容易地估算給藥重復率。成功治療后，可期望讓患者經(jīng)歷持續(xù)治療以防止疾病狀態(tài)的復發(fā)，其中寡核苷酸以持續(xù)劑量給藥，劑量范圍從0. 01 μ g到IOOg每千克體重，每天一次或多次到每20年一次。盡管上面已經(jīng)描述了本發(fā)明的多個實施方案，應(yīng)當理解的是它們僅以實施例的方式展示，而非限制。根據(jù)本文的公開，不脫離本發(fā)明的精神或范圍，可對公開的實施方案進行許多改變。因此，本發(fā)明的寬度和范圍不應(yīng)該被任何上述實施方案限制。本文提到的所有文獻都通過引用并入本文。本申請中引用的所有出版物和專利文獻都出于所有目的通過引用并入本文，引用的程度和仿佛每篇單獨的出版物或?qū)＠墨I被單獨這樣指出一樣。通過在本文中引用多種參考文獻，申請人并不承認任何特定參考文獻是他們的發(fā)明的“現(xiàn)有技術(shù)”。本發(fā)明的組合物和方法的實施方案在下列實施例中加以說明。
實施例以下非限制性實施例用于說明本發(fā)明經(jīng)選擇的實施方案。應(yīng)理解的是顯示的比例的變化和組分元素的選擇對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，且在本發(fā)明實施方案的范圍內(nèi)。實施例1 設(shè)計對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的核酸分子反義和或有義鏈特異的反義寡核苷酸如上指明的，術(shù)語"對…特異的寡核苷酸"或"靶向…的寡核苷酸"指具有如下序列的寡核苷酸，所述序列(i)能與靶向的基因的一部分形成穩(wěn)定的復合體，或(ii)能與靶向的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄子的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。通過使用自動排列核酸序列和標明同一性或同源性區(qū)域的計算機程序，適合的寡核苷酸的選擇得以促進。這種程序用于比較通過例如搜索數(shù)據(jù)庫(例如GenBank)或通過測序PCR產(chǎn)品而獲得的核酸序列。比較來自一系列物種的核酸序列允許選擇在物種之間展示出合適同一性程度的核酸序列。在沒有被測序的基因的例子中，進行DNA印跡法以測定目標物種和其它物種的基因之間的同一性程度。本領(lǐng)域公知，通過在不同的嚴格程度進行 DNA印跡法，可能獲得同一性的近似度量。這些程序可以選擇寡核苷酸，所述寡核苷酸展示出與待控制對象中的靶核酸序列的高互補度，和與其它物種中的相應(yīng)核酸序列的較低互補度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會意識到選擇用于本發(fā)明的基因的合適區(qū)域有相當大的范圍。當反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起功能和/或活性的調(diào)節(jié)，且在期望有特異性結(jié)合的條件下(即體內(nèi)試驗或治療處理情況中的生理條件下，和在體外試驗情況中進行試驗的條件下)有足夠的互補度以避免反義化合物和非靶核酸序列的非特異性結(jié)合時，所述反義化合物是"能特異性雜交的"。本文描述的寡核苷酸的雜交性質(zhì)可以通過本領(lǐng)域已知的一種或多種體外試驗測定。例如，本文描述的寡核苷酸的性質(zhì)可以通過使用熔化曲線試驗測定靶天然反義和潛在藥物分子之間的結(jié)合強度而獲得。靶天然反義和潛在藥物分子(分子)之間的結(jié)合強度可以使用任何已經(jīng)建立的測量分子內(nèi)相互作用強度的方法(例如熔化曲線試驗)來估算。熔化曲線試驗測定天然反義/分子復合體出現(xiàn)從雙鏈到單鏈構(gòu)象快速轉(zhuǎn)化時的溫度。該溫度被廣泛接受為兩個分子之間的相互作用強度的可靠度量。熔化曲線試驗?zāi)苁褂煤头肿拥慕Y(jié)合位點相應(yīng)的實際天然反義RNA分子或合成DNA 或RNA核苷酸的cDNA拷貝進行。已有多種包含進行該試驗的所有必需試劑的試劑盒(例如 Applied Biosystems he. MeltDoctor試劑盒)。這些試劑盒包括合適的緩沖溶液，所述緩沖溶液含有雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合染料(例如ABI HRM染料，SYBR Green, SYTO等)之一。 dsDNA染料的性質(zhì)是它們在自由形式時幾乎不發(fā)射熒光，而當結(jié)合dsDNA時是高熒光性的。為了進行試驗，以特定制造商的操作步驟規(guī)定的濃度將cDNA或相應(yīng)的寡核苷酸和分子混合。將混合物加熱到95°C以解離所有預先形成的dsDNA復合體，然后緩慢冷卻到室溫或試劑盒制造商規(guī)定的其它較低溫度以使DNA分子退火。然后將新形成的復合體緩慢加熱到95°C，同時連續(xù)收集由反應(yīng)產(chǎn)生的熒光量數(shù)據(jù)。熒光強度與反應(yīng)中存在的dsDNA的量成反比。數(shù)據(jù)可用與試劑盒兼容的實時PCR儀器(例如ABlW M^One Plus Real Time PCR System LightTyper Χ^, Roche Diagnostics, Lewes, UK)用適當?shù)能浖?例如LightTyper (Roche)或 SDS Dissociation Curve, ABI)通過將熒光對溫度的負導數(shù)(_d (熒光)/dT)，在y軸)相對于溫度(χ-軸)作圖而構(gòu)建熔化峰。 分析數(shù)據(jù)，鑒別從dsDNA復合體到單鏈分子快速轉(zhuǎn)變的溫度。該溫度稱為Tm，且與兩個分子之間的相互作用強度成正比。通常Tm將超過40°C。實施例2 調(diào)節(jié)VEGF多核苷酸來自ATCC的!fepG2細胞(cat# HB-8065)在37 °C和5 % CO2下生長于生長培養(yǎng)基(MEM/raSS(Hyclone cat #SH30024，或 Mediatech cat # MT-IO-OIO-CV)+10 % FBS(Mediatech cat# MT35-011-CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech cat# MT30-002-CI))。 實驗的前一天，以1. 5 XlOVml的密度將細胞移植于6孔板中，并于37°C和5% CO2下培養(yǎng)。 實驗當天將6孔板中的培養(yǎng)基換成新鮮生長培養(yǎng)基。將所有的反義寡核苷酸稀釋到20 μ M 的濃度。將2 μ 1的該溶液與400 μ 1的Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco cat#31985-070)和4 μ 1 的 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)在室溫下培養(yǎng) 20 分鐘，施用于有 HepG2細胞的6孔板的每個孔。包含2 μ 1的水而不是寡核苷酸溶液的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對照。在37°C和5% CO2下培養(yǎng)3-18小時后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長培養(yǎng)基。加入反義寡核苷酸48小時后，去掉培養(yǎng)基，根據(jù)制造商的說明書，使用來自Promega的SV Total RNA Isolation System(cat# Z3105)或來自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試劑盒(cat# 74181)從細胞中提取RNA。將600ng的RNA加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用來自 Thermo Scientific 的 Verso cDNA 試劑盒(cat# AB1453B)或 High CapacitycDNA Reverse Transcription Kit(cat# 4368813)按制造商的操作步驟的描述而進行。使用 ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510)和 ABI 設(shè)計的引物 / 探針(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay :Hs00173626_ml,Applied Biosystems Inc., Foster City CA)，通過實時PCR將來自該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于監(jiān)測基因表達。使用下列 PCR循環(huán)50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，40個循環(huán)的(95°C 15秒，60°C 1分鐘)，使用M^One Plus Real Time PCR Machine(Applied Biosystems)。根據(jù)經(jīng)處理和經(jīng)模擬轉(zhuǎn)染的樣品之間的18S標準化的dCt值差異，計算用反義寡核苷酸處理后的基因表達的倍數(shù)變化。用于針對VEGF天然反義VEGFA (SEQ ID NO :10)(圖6)的用戶定制設(shè)計的Taqman 試驗的引物和探針靴序列VEGFA 外顯子 1 :ATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACC (SEQ ID NO :10)正向引物序列Vegfasl ANYf :GTAGCCTGTCCCCTTCAAGAG(SEQ ID NO :11)Vegfas2 ANYf :GCGGATAGCCTGGGAGCTA(SEQ ID NO :12)反向引物序列Vegfasl ANYR :CAGACATCCTGAGGTGTGTTCT (SEQ ID NO :13)Vegfas2 ANYR :TGTTCGGTTGCTGTGACTGT(SEQ ID NO :14)報道染料(ImporterDye) :FAMVegfasl ANYMl :ATGCCTGCCAAGCCCA (SEQ ID NO :15)Vegfas2 ANYMl :CAGCCAGCCCTCTGC(SEQ ID NO :16)結(jié)果VEGFAas RNA 下調(diào)實時PCR結(jié)果顯示，用針對vegfaas設(shè)計的siRNA中的一條(vefaasl_2，P = 0. 05) 和可能地用第二條vefaasl_3 (P = 0. 1，圖1A)處理后48小時，H印G2細胞中的VEGFA mRNA 的水平顯著升高。在相同的樣品中，用vefaasl_2或vefaasl_3處理后，vegfaas RNA的水平顯著降低，但是用vefaasl_5處理后保持不變，vefaasl_5也對VEGFA mRNA水平?jīng)]有影響(圖1 。VEGRas RNA 下調(diào)實時PCR結(jié)果顯示，用針對vegRas設(shè)計的siRNA中的兩條(vegRasl_2，P = 0. 02 和vegRasl_3，P = 0. 06，圖1C)處理后48小時，!fepG2細胞中的VEGFA mRNA的水平顯著升高。vegRas RNA水平變化的結(jié)果待定。雖然針對一個或多個實施例對本發(fā)明進行了說明和描述，在閱讀和理解本說明書和附圖后，本領(lǐng)域其他技術(shù)人員會想到等價變化和修改。另外，雖然本發(fā)明的特定特征可能只用幾個實施例中的一個進行了公開，當可能被期望時和對任何給定或特定應(yīng)用有利時， 這樣的特征可以和其它實施例的一個或多個其它特征結(jié)合。本公開的摘要將使讀者快速確定技術(shù)公開的本質(zhì)。應(yīng)當理解的是不能將它用于解釋或限制權(quán)利要求的范圍或含義。
權(quán)利要求
1.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與5-30個核苷酸長度的反義寡核苷酸接觸，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的功能和/或表達，其中所述寡核苷酸與包含SEQ ID NO :2的核苷酸1-643或SEQ ID NO :3的核苷酸1-513 (圖3)內(nèi)的 5-30個核苷酸的多核苷酸的反向互補具有至少50%序列同一性。
2.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與5-30個核苷酸長度的反義寡核苷酸接觸，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的功能和/或表達，其中所述寡核苷酸與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的反義的反向互補具有至少50%序列同一性。
3.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與5-30個核苷酸長度的反義寡核苷酸接觸，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的功能和/或表達，其中所述寡核苷酸與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性。
4.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的天然反義區(qū)域的反義寡核苷酸接觸，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的功能和/或表達。
5.權(quán)利要求4的方法，其中相對于對照，在體內(nèi)或體外增大血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 的表達和/或功能。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的天然反義序列。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸靶向包含血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸包含一種或多種修飾，所述修飾包含修飾的糖部分、修飾的核苷間鍵合、修飾的核苷酸和/或它們的組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述修飾的糖部分包含2'-0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2'-甲氧基修飾的糖部分、2' -0-烷基修飾的糖部分或二環(huán)糖部分。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述修飾的核苷間鍵合包含硫代磷酸酯、2'-0-甲氧基乙基(MOE)、2'-氟代、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯和/或它們的組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述寡核苷酸任選具有至少一個修飾的核苷酸，所述核苷酸包括肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子、阿拉伯糖核酸(FANA)、肽核酸(PNA)、它們的類似物或衍生物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述寡核苷酸包含SEQID NO :4-9展示的至少一種寡核苷酸序列。
14.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因表達和/或功能的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與5-30個核苷酸長度的短干擾RNA(SiRNA)寡核苷酸接觸，所述寡核苷酸對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的反義多核苷酸特異，其中所述寡核苷酸與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少大約5個連續(xù)核酸的互補序列具有至少50%序列同一性；和在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因表達和/或功能。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述寡核苷酸與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少大約5個連續(xù)核酸的互補序列具有至少80%序列同一性。
16.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因表達和/或功能的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與大約5-30個核苷酸長度的反義寡核苷酸接觸，所述反義寡核苷酸對編碼血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分子的多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列特異，其中反義寡核苷酸與SEQ ID NO :1-3展示的至少一種核酸序列具有至少50%序列同一性；和在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中的血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)基因表達和/或功能。
17.一種合成的，修飾的寡核苷酸，其包含至少一種修飾，其中所述修飾包含至少一個以下核苷酸間鍵合烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯或它們的組合，其中所述寡核苷酸是反義化合物，其與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分子雜交，且相對于對照在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)分子的表達和/或功能。
18.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括硫代磷酸酯核苷酸間鍵合和選自下面的至少一個核苷酸間鍵合的組合烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、 氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲酯和/或它們的組合。
19.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵合。
20.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵合的骨架。
21.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸任選包含至少一個修飾的核苷酸，所述修飾的核苷酸包含肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子、它們的類似物、衍生物和/或組合。
22.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含修飾的糖部分，所述修飾的糖部分包含2' -0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2'-甲氧基修飾的糖部分、2' -0-烷基修飾的糖部分或二環(huán)糖部分。
23.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸的長度是至少大約5-30個核苷酸，并和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的反義和/或有義的編碼和/或非編碼核酸序列的至少大約5個連續(xù)核酸的互補序列具有至少大約20%序列同一性。
24.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的反義和/或有義的編碼和/或非編碼核酸序列的至少大約5個連續(xù)核酸的互補序列具有至少大約80%序列同一性。
25.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與至少一種血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 多核苷酸雜交，且相對于對照在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)至少一種血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的表達和/或功能。
26.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQID N0:4_9展示的序列。
27.一種組合物，其包含對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸特異的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補序列、等位基因、同系物、同種型、變體、衍生物、突變體或它們的片段。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述寡核苷酸相對于SEQID NO :4_9展示的核苷酸序列中的任一種具有至少大約40 %的核苷酸序列同一性。
29.權(quán)利要求27的組合物，其中所述寡核苷酸包含SEQID NO :4_9展示的核苷酸序列。
30.權(quán)利要求四的組合物，其中SEQID NO :4-9展示的所述寡核苷酸包含一個或多個修飾的或取代的核苷酸。
31.權(quán)利要求27的組合物，其中所述修飾的核苷酸包含修飾的堿基，所述修飾的堿基包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子。
32.一種預防或治療與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸和/或其編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括給予病人治療有效劑量的至少一種反義寡核苷酸，其結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 多核苷酸的天然反義序列并調(diào)節(jié)所述血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸的表達，從而預防或治療與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸和/或其編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病。
33.權(quán)利要求32的方法，其中與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸相關(guān)的疾病包括 特征為過量血管內(nèi)壁細胞增殖的疾?。挥尚难軝C能不全導致的心血管疾病(例如冠狀動脈疾病、充血性心力衰竭和周圍性血管疾病)；特征或起因是異?；蜻^剩血管再生的病癥， 包括但不限于癌癥(例如致癌基因的激活、腫瘤抑制物的損失)；感染性疾病(例如病原體表達血管基因、增強血管再生程序)；自身免疫障礙(例如肥大細胞和其它白細胞的激活)，包括類風濕性關(guān)節(jié)炎；血管畸形(例如Tie-2突變)；DiGeorge綜合癥(例如低VEGF 和神經(jīng)氈(neuropilin)-1表達)；HHT(例如內(nèi)皮糖蛋白(endoglin)或LK-1的突變)、海綿狀血管瘤(例如Cx37和Cx40的損失)；動脈粥樣硬化；移植動脈病(ateriopathy)；肥胖癥(例如由脂肪飲食誘發(fā)的血管再生、血管再生抑制因子誘發(fā)的體重減輕)；牛皮癬；疣； 變應(yīng)性皮炎；疤痕疙瘩；膿性肉芽腫；發(fā)皰疾??；艾滋病患者的卡波西肉瘤；持久性增生性玻璃狀綜合癥(例如Ang-2或VEGF164的損失)；常染色體顯性多囊性腎病(ADPKD)；糖尿病視網(wǎng)膜??；早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜??；年齡相關(guān)的黃斑部退化；脈絡(luò)膜新血管形成(例如TIMP-3 突變)；原發(fā)性肺動脈高壓(例如種系BMPR-2突變、體細胞EC突變)；哮喘；鼻息肉；炎性腸病；神經(jīng)損傷、腦損傷和神經(jīng)組織退化性疾病(例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化等)；牙周病；腹水；腹膜粘連；子宮內(nèi)膜異位；子宮出血；卵巢囊腫；卵巢過刺激； 關(guān)節(jié)炎；滑膜炎；骨髓炎；和/或骨贅形成；潰瘍；尋常疣；結(jié)節(jié)性腦硬化血管纖維瘤；葡萄酒色痣；斯德奇-韋伯綜合癥；Kippel-Trenaunay-Weber綜合癥；Osler-Weber-Rendu綜合癥和任何其它與細胞或組織中的VEGF-R水平相關(guān)的疾病或癥狀。
34. 一種鑒別和選擇用于體內(nèi)給藥的寡核苷酸的方法，所述方法包括篩選與疾病狀態(tài)有關(guān)的靶多核苷酸；鑒別寡核苷酸，其包含與所鑒別的多核苷酸互補或成反義方向的至少5個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸；和在嚴格雜交條件下測量所述反義寡核苷酸和靶多核苷酸的結(jié)合之間的熱熔點；以及鑒別和選擇用于體內(nèi)給藥的寡核苷酸。
全文摘要
寡核苷酸化合物調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多核苷酸和其編碼產(chǎn)物的表達和/或功能。治療與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有關(guān)的疾病的方法包括給予患者為抑制VEGF天然反義轉(zhuǎn)錄子而設(shè)計的一種或多種寡核苷酸化合物。
文檔編號C12N15/63GK102341498SQ200980156394
公開日2012年2月1日 申請日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者J·科拉德, O·霍爾科瓦謝爾曼 申請人:歐科庫爾納有限責任公司