專利名稱：通過(guò)抑制針對(duì)沉默調(diào)節(jié)蛋白1的天然反義轉(zhuǎn)錄物來(lái)治療沉默調(diào)節(jié)蛋白1(sirt1)相關(guān)的疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)SIRTl和相關(guān)分子的表達(dá)和/或功能的寡核苷酸。
背景技術(shù)：
DNA-RNA和RNA-RNA雜交對(duì)于核酸功能的許多方面(包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯) 而言為重要的。雜交對(duì)于探測(cè)特定核酸或者改變其表達(dá)的各種技術(shù)而言亦為主要的。反義核苷酸例如通過(guò)雜交到靶RNA來(lái)擾亂基因表達(dá)，從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制。 反義DNA具有附加的特征，該特征為DNA-RNA雜合體充當(dāng)核糖核酸酶H消化的底物，該活性存在于大多數(shù)細(xì)胞類型中?？蓪⒎戳x分子遞送到細(xì)胞中，這與寡脫氧核苷酸(ODN)的情況一樣，或者它們?nèi)鏡NA分子一樣可由內(nèi)源基因表達(dá)。FDA最近批準(zhǔn)了一種反義藥物， VITRAVENETM(用于治療巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎)，這反映了反義物具有治療應(yīng)用。發(fā)明概述提供本概述以呈現(xiàn)本發(fā)明的概述，從而簡(jiǎn)要地指出本發(fā)明的性質(zhì)和實(shí)質(zhì)。在理解以下的情況下提出本概述其不會(huì)用于解釋或限制權(quán)利要求的范圍或含義。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)使用靶定天然反義轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域的反義寡核苷酸來(lái)抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物的作用，引起相應(yīng)有義基因的增量調(diào)節(jié)的方法。本文也考慮天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可通過(guò)siRNA、核酶和小分子來(lái)達(dá)到，認(rèn)為所述siRNA、核酶和小分子在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。一個(gè)實(shí)施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的SIRTl多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括用長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細(xì)胞或組織，從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的SIRTl多核苷酸的功能和/或表達(dá)，其中所述寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO 2的核苷酸1-10 或SEQ ID NO 3的核苷酸1-429、或SEQ ID NO 4 的核苷酸1-156或SEQ ID NO 5的核苷酸1-593(

圖11)之內(nèi)的5_30個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸靶定SIRTl多核苷酸的天然反義序列，例如如SEQ ID NO :2-5所列的多核苷酸，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、 片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID NO :6-47所列。另一個(gè)實(shí)施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中SIRTl多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括用長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細(xì)胞或組織，其中所述寡核苷酸與SIRTl多核苷酸的反義物的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中SIRTl多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
另一個(gè)實(shí)施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中SIRTl多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括用長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細(xì)胞或組織，其中所述寡核苷酸與SIRTl反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%的序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中SIRTl多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種組合物，所述組合物包含一種或多種與有義和/或反義SIRTl多核苷酸結(jié)合的反義寡核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾或取代的核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的鍵。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾核苷酸包含經(jīng)修飾的堿基，該堿基包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸或鎖定核酸(LNA)分子。優(yōu)選地，所述修飾核苷酸為鎖定核酸分子， 包括 α -L-LNA。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述寡核苷酸經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給予
^^ ο在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述寡核苷酸以藥物組合物形式給予。一種治療方案，所述方案包括至少一次向患者給予反義化合物；然而，可將此治療修改成在一段時(shí)間內(nèi)包含多次給藥。所述治療可與一種或多種其它類型的療法組合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述寡核苷酸封裝到脂質(zhì)體中。其它方面描述于下文。通過(guò)引用的結(jié)合此說(shuō)明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)書都通過(guò)引用結(jié)合于本文中，其程度如同具體且單獨(dú)地指出將各個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)書都通過(guò)引用來(lái)結(jié)合一樣。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的新穎特征在所附權(quán)利要求中具體地陳述。對(duì)本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)的更好理解通過(guò)參考列舉說(shuō)明性實(shí)施方案的以下詳細(xì)描述來(lái)獲得，其中利用了本發(fā)明的原理，以及其附圖圖1顯示針對(duì)SIRT反義物CV396200設(shè)計(jì)的寡核苷酸的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果。該結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平在用針對(duì)sirtas設(shè)計(jì)的siRNA之一(sirtas_5，P = 0. 01)處理后4 顯著增加。在相同的樣品中sirtas RNA的水平在用sirtas_5處理后顯著減少，但在用sirtas_6和sirtas_7處理后不變，其也不影響SIRTl mRNA水平(圖1B)。 sirtas_5、sirtas_6 和 sirtas_7 分別對(duì)應(yīng) SEQ ID NO :29、30 和 31。圖2顯示針對(duì)SIRT反義物CV396200的寡核苷酸步移(walk)的結(jié)果。實(shí)時(shí)PCR 結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平在用針對(duì)sirtas設(shè)計(jì)的其中三種反義寡核苷酸處理后48h顯著增加。CUR-0292至CUR-309分別對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :6_23。圖3顯示!fepG2 (圖3A)和Vero76細(xì)胞(圖3B)中PS、LNA禾口 2，0 Me修飾的寡核苷酸的結(jié)果。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，!fepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平在用針對(duì)SIRTl反義物的PS、LNA、2，0 Me和2，0 Me mixmer設(shè)計(jì)反義核苷酸處理后48h顯著增加。Vero細(xì)胞中 SIRTl mRNA的水平在用針對(duì)SIRTl反義物的PS和LNA修飾反義寡核苷酸處理后48小時(shí)也增加。表示為 CUR-0M5、CUR-0736、CUR-0688、CUR-0740 和 CUR-0664 的條分別對(duì)應(yīng) SEQ ID 24-28。圖4顯示猴脂肪活檢的PCR結(jié)果。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在來(lái)自施用以⑶R_963(針對(duì)SIRTl反義物CV396200. 1設(shè)計(jì)的寡核苷酸)的猴的脂肪活檢中，SIRTl mRNA水平增加。 CUR-963 對(duì)應(yīng) SEQ ID 25。圖5顯示原代猴肝臟肝細(xì)胞的PCR結(jié)果。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，用⑶R_0245(針對(duì) SIRTl反義物的寡核苷酸)處理后SIRTl mRNA水平增加。表示為⑶R-0245的條對(duì)應(yīng)SEQ ID 24。圖6顯示針對(duì)SIRT反義物CV396200設(shè)計(jì)的寡核苷酸的結(jié)果。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示， 在針對(duì)SIRTl反義物CV396200設(shè)計(jì)的寡核苷酸之一中，IfepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加。表示為 CUR-1230、CUR-1231、CUR-1232 和 CUR-1233 的條對(duì)應(yīng) SEQ ID NO :32-35。圖7顯示針對(duì)SIRT反義物CV428275設(shè)計(jì)的寡核苷酸的結(jié)果。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示， 在針對(duì)SIRTl反義物CV428275設(shè)計(jì)的其中兩種寡核苷酸中，IfepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加。表示為 CUR-1302、CUR-1304, CUR-1303 和 CUR-1305 的條對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 36-39。圖8顯示實(shí)時(shí)PCR結(jié)果。結(jié)果顯示在用針對(duì)SIRT反義物BE717453設(shè)計(jì)的寡核苷酸之一處理后48h，在H印G2細(xì)胞中SIRTl mRNA水平顯著增加。表示為CUR_1264、CURU65 和 CUR-1266 條分別對(duì)應(yīng) SEQ ID NO. :40_42。圖9顯示實(shí)時(shí)PCR結(jié)果。結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平，在用針對(duì) SIRTl反義物AV718812設(shè)計(jì)的其中三種寡核苷酸處理后4 顯著增加。表示為⑶R-1294、 CUR-U97、CUR-U95、CUR-1296 和 CUR-1298 的條分別對(duì)應(yīng) SEQ ID NO. :43-47。圖10顯示SEQ ID NO 1 人類(Homo sapiens)沉默調(diào)節(jié)蛋白(沉默交配型信息調(diào)節(jié) 2 同源物)1 (釀酒酵母(S. cerevisiae)) (SIRTl)、mRNA(NCBI 檢索號(hào):NM_012238. 3) 以及SEQ ID NO :1a顯示SIRT的基因組序列(外顯子用大寫字母顯示，內(nèi)含子用小寫字母顯不)。圖11顯示SEQ ID NO 2 擴(kuò)展的天然反義序列(CV396200擴(kuò)展)SEQ ID NO 3 天然反義序列(CV428275)SEQ ID NO 4 天然反義序列(BE717453)SEQ ID NO 5 天然反義序列(AV718812)圖12顯示SEQ ID NO :6-23, *指硫代磷酸酯鍵。圖13顯示SEQ ID NO =24-28, *指硫代磷酸酯鍵，+指LNA而m指2，0 Me。圖14顯示SEQ ID NO :四_31，針對(duì)SIRT反義物CV396200設(shè)計(jì)的雙鏈測(cè)試寡核苷酸的反義序列，其分別對(duì)應(yīng)sirtas_5、sirtas_6禾口 sirtas_7。圖 15 顯示針對(duì) SIRTl 反義物 CV396200 設(shè)計(jì)的 SEQ ID NO :32、33、34 和；35。圖 16 顯示針對(duì) SIRTl 反義物 CV428275 設(shè)計(jì)的 SEQ ID NO :36、37、38 和 39。圖 17 顯示針對(duì) SIRTl 反義物 BE717453 設(shè)計(jì)的 SEQ ID NO :40、41 和 42。圖 18 顯示針對(duì) SIRTl 反義物 AV718812 設(shè)計(jì)的 SEQ ID NO :43、44、45、46 和 47。圖 19 顯示 SEQ ID NO :48-51 SEQ ID NO :38 對(duì)應(yīng) SIRTl 天然反義物 CV396200 的外顯子4，SEQ ID NO 49,50和51分別對(duì)應(yīng)正向引物序列、反向引物序列和報(bào)道序列。圖20顯示對(duì)應(yīng)⑶R 962的SEQ ID NO 52，*指硫代磷酸酯鍵而+指LNA。發(fā)明詳述參考用于說(shuō)明的示例應(yīng)用在下文中描述本發(fā)明的數(shù)個(gè)方面。應(yīng)當(dāng)理解的是，陳述許多具體細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的充分理解。然而，在相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，可在不含一個(gè)或多個(gè)具體細(xì)節(jié)的情況下實(shí)施本發(fā)明或者可用其他方法來(lái)實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明不受行為或事件的排序限制，因?yàn)橐恍┬袨榭梢圆煌捻樞蜻M(jìn)行和/ 或與其他行為或事件同時(shí)進(jìn)行。此外，并非所有說(shuō)明性的行為或事件對(duì)實(shí)施本發(fā)明的方法都為必需的。本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物意圖對(duì)應(yīng)來(lái)自任何物種的同源物，對(duì)其而言本文公開的組合物和方法為適用的。因此，該術(shù)語(yǔ)包括但不限于來(lái)自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。理解的是，當(dāng)公開來(lái)自具體物種的基因或基因產(chǎn)物時(shí)，意圖此公開僅為示范性的，并且除非其出現(xiàn)的文段中明確指示，否則不應(yīng)理解為限制。因此，例如，對(duì)于本文公開的在一些實(shí)施方案中有關(guān)哺乳動(dòng)物核酸和氨基酸序列的基因而言，意圖包括來(lái)自其他動(dòng)物 (包括但不限于其他哺乳動(dòng)物、魚類、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物和鳥類)的同源和/或直向同源基因和基因產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基因或核酸序列為人的。定義本文所用的術(shù)語(yǔ)僅以描述具體的實(shí)施方案為目的而不意圖限制本發(fā)明。除非文段另有明確指示，否則本文所用的單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“所述”也意圖包括復(fù)數(shù)形式。此外，就術(shù)語(yǔ)“包括的”、“包括”、“具有的”、“具有”、“含有”或其變型在詳述和/或權(quán)利要求中所用的程度而言，這類術(shù)語(yǔ)意圖以類似于術(shù)語(yǔ)“包含”的方式是包括在內(nèi)的。術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”意為在由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定的具體值的可接受誤差范圍之內(nèi)，這部分取決于該值是如何測(cè)定或確定的，即，測(cè)量系統(tǒng)的限制。例如，按照本領(lǐng)域的實(shí)踐，“約”可意為在1之內(nèi)或大于1的標(biāo)準(zhǔn)偏差。或者，“約”可意為高達(dá)給定值的20%， 優(yōu)選10%，更優(yōu)選5%，和還更優(yōu)選1 %的范圍?；蛘撸唧w地關(guān)于生物系統(tǒng)或過(guò)程，該術(shù)語(yǔ)可意為在值的一個(gè)數(shù)量級(jí)之內(nèi)，優(yōu)選在值的5倍之內(nèi)，更優(yōu)選在2倍之內(nèi)。在本申請(qǐng)和權(quán)利要求所描述的具體值之處，除非另作說(shuō)明，應(yīng)假設(shè)術(shù)語(yǔ)“約”意為在具體值的可接受誤差范圍之內(nèi)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“mRNA”意為目前已知的靶定基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物，以及任何可闡明的其它轉(zhuǎn)錄物?！胺戳x寡核苷酸”或“反義化合物”意為與另一個(gè)RNA或DNA (靶RNA、DNA)結(jié)合的 RNA或DNA分子。例如，如果其為RNA寡核苷酸，則其通過(guò)RNA-RNA相互作用結(jié)合另一個(gè)RNA 靶標(biāo)并改變靶RNA的活性(Eguchi等，1991 Ann. Rev. Biochem. 60，631-652)。反義寡核苷酸可增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)特定多核苷酸的表達(dá)和/或功能。該定義意在包括從治療、診斷或其他觀點(diǎn)來(lái)看有用的任何外源RNA或DNA分子。這類分子包括例如反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微小RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治療用編輯RNA以及激動(dòng)劑和拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGQ寡核苷酸、可變剪接物 (alternate splicer)、引物、探針以及其他與靶核酸的至少一部分雜交的寡聚化合物。因此，可將這些化合物以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。
在本發(fā)明的文段中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA) 或其模擬物的寡聚物或聚合物。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”，也包括天然和/或經(jīng)修飾單體或鍵的線性或環(huán)狀寡聚體，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-異頭物形式、肽核酸(PNA)、 鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過(guò)單體與單體相互作用的規(guī)
律模式(例如沃森-克里克(Watson-Crick)型堿基配對(duì)、Hedgsteeii或反Hodgsteeii型堿
基配對(duì)等)特異地結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可為“嵌合的”，即，由不同的區(qū)組成。在本發(fā)明的文段中，“嵌合的”化合物為寡核苷酸，其包含兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)區(qū)，例如，DNA區(qū)、RNA區(qū)、PNA區(qū)等。每個(gè)化學(xué)區(qū)由至少一個(gè)單體單元(即，在寡核苷酸化合物的情況下為核苷酸)組成。這些寡核苷酸典型地包含至少一個(gè)區(qū)，其中所述寡核苷酸為經(jīng)修飾的以表現(xiàn)出一種或多種所需特性。寡核苷酸的所需特性包括但不限于，例如增強(qiáng)的對(duì)核酸酶降解的抗性、增強(qiáng)的細(xì)胞攝取和/或增強(qiáng)的對(duì)靶核酸的結(jié)合親和力。因此寡核苷酸的不同區(qū)可具有不同的特性。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種如上所述的寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸類似物的混合結(jié)構(gòu)。寡核苷酸可由可“全符合狀態(tài)(in “register”)”地連接或通過(guò)間隔物連接的區(qū)組成，所述全符合狀態(tài)”地連接即此時(shí)單體像在天然DNA—樣序貫地連接。所述間隔物意在構(gòu)成區(qū)之間的共價(jià)“橋”，并在優(yōu)選的情況下具有不超過(guò)約100個(gè)碳原子的長(zhǎng)度。所述間隔物可攜帶不同的官能團(tuán)，例如具有正或負(fù)電荷的、具有特殊的核酸結(jié)合特性的(嵌入劑、溝黏合劑、毒素、熒光團(tuán)等)、親脂的、誘導(dǎo)特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)的如例如誘導(dǎo)α -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的“SIRT1”和“沉默調(diào)節(jié)蛋白Ksirtuin 1) ”包括所有家族成員、突變體、等位基因、片段、種類、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。本文所用的“SIRT1”應(yīng)指沉默交配型信息調(diào)節(jié)子2同源物且為沉默調(diào)節(jié)蛋白脫乙酰酶蛋白家族的成員。SIRTl的氨基酸序列可在Genbank檢索號(hào)NP. sub. —08509中找到。 SIRTl為酵母Sir2蛋白的人同源物并表現(xiàn)出NAD-依賴的脫乙酰酶活性。本文所用的措詞沉默調(diào)節(jié)蛋白1、SIRT1、沉默調(diào)節(jié)蛋白、沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同源物1、hSIR2, hSIRTl、NAD-依賴的脫乙酰酶沉默調(diào)節(jié)蛋白_1、SIR2LU SIR2樣蛋白1，在文獻(xiàn)中都被認(rèn)為相同且在本申請(qǐng)中可交換地使用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)……特異的寡核苷酸”或“靶定……的寡核苷酸”是指具有以下序列寡核苷酸，該序列(i)能夠與靶定基因的一部分形成穩(wěn)定的復(fù)合體，或(ii)能夠與靶定基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過(guò)理論計(jì)算和/或體外測(cè)定來(lái)確定。用于確定雜交復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測(cè)定法描述于下文實(shí)施例中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“靶核酸”包括DNA、從這類DNA轉(zhuǎn)錄的RNA (包括前mRNA和mRNA)， 以及從這類RNA衍生的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。這種通過(guò)特異地與靶核酸雜交的化合物對(duì)該靶核酸功能的調(diào)節(jié)，一般稱為“反義”。會(huì)受干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。會(huì)受干擾的RNA功能，包括所有的生活機(jī)能，例如，RNA向蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)的易位、蛋白質(zhì)自RNA的翻譯、產(chǎn)生一種或多種mRNA種類的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進(jìn)的催化活性。對(duì)靶核酸功能的這類干擾的整體效果為對(duì)編碼產(chǎn)物或寡核苷酸表達(dá)的調(diào)節(jié)。RNA干擾“RNAi ”由雙鏈RNA (dsRNA)分子介導(dǎo)，該分子具有與其“靶”核酸序列的序列特異性同源性(Caplen，N. J.，等 Q001)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :9742-9747)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，介體為5-25個(gè)核苷酸的“小干擾”RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA通過(guò)稱為切酶的 RNA 酶對(duì) dsRNA 的加工得到(Bernstein，Ε.，等 Q001)Nature 409 :363-366)。 將siRNA雙鏈體產(chǎn)物募集到叫做RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)的多蛋白siRNA復(fù)合體中。不希望受任何具體理論所約束，認(rèn)為隨后會(huì)將RISC引向靶核酸(適當(dāng)?shù)貫閙RNA)，其中siRNA雙鏈體以序列特異性的方式相互作用來(lái)介導(dǎo)催化方式的裂解(Bernstein，Ε.，等 (2001)Nature 409 :363-366 ；Boutla，Α·，等(2001) Curr. Biol. 11 :1776-1780)?？梢勒毡景l(fā)明使用的小干擾RNA可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知和普通技術(shù)人員熟悉的程序來(lái)合成和使用。 用于本發(fā)明的方法中的小干擾RNA適當(dāng)?shù)匕s1-約50個(gè)核苷酸(nt)。在非限制性實(shí)施方案的實(shí)例中，siRNA可包含約5-約40nt、約5-約30nt、約10-約30nt、約15-約25nt、 或約20-25個(gè)核苷酸。適當(dāng)寡核苷酸的挑選通過(guò)使用電腦程序來(lái)協(xié)助，該程序自動(dòng)比對(duì)核酸序列并指出具有同一性或同源性的區(qū)。將這類程序用于比較通過(guò)例如搜索諸如GenBank等的數(shù)據(jù)庫(kù)或通過(guò)測(cè)序PCR產(chǎn)物而獲得的核酸序列。對(duì)來(lái)自一系列物種的核酸序列的比較，允許選擇在物種之間顯示適度同一性的核酸序列。在未測(cè)序基因的情況下，進(jìn)行DNA印跡來(lái)確定在靶物種和其他物種的基因之間的同一性程度。如本領(lǐng)域眾所周知的，通過(guò)在不同的嚴(yán)格程度下進(jìn)行DNA印跡，可能獲得同一性的近似衡量。這些程序允許選擇以下寡核苷酸，其對(duì)待控制的受試者中的靶核酸序列表現(xiàn)出高度的互補(bǔ)性，并且對(duì)其他物種中的相應(yīng)核酸序列表現(xiàn)出較低程度的互補(bǔ)性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在挑選用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)幕騾^(qū)上具有相當(dāng)大的自由。“酶促 RNA"意為具有酶活性的 RNA 分子(Cech，(1988) J. American. Med. Assoc.沈0，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通過(guò)首先結(jié)合靶RNA來(lái)起作用。這類結(jié)合通過(guò)酶促核酸的靶結(jié)合部分進(jìn)行，所述靶結(jié)合部分保持緊密靠近進(jìn)行切割靶RNA的分子的酶部分。因此，酶促核酸首先識(shí)別而后通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合靶RNA，且一旦結(jié)合到正確的位點(diǎn)，即進(jìn)行酶促切割靶RNA?！罢T餌RNA”意為模擬配體的天然結(jié)合域的RNA分子。因此誘餌RNA與天然結(jié)合靶競(jìng)爭(zhēng)與特異性配體結(jié)合。例如，已顯示HIV反式激活應(yīng)答(TAR)RNA的過(guò)表達(dá)可充當(dāng)“誘餌” 并有效地結(jié)合HIV tat蛋白，從而阻止其結(jié)合到在HIV RNA中編碼的TAR序列(Sullenger 等(1990)Cell，63，601-608)。這應(yīng)成為一個(gè)具體的實(shí)例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這只是一個(gè)實(shí)例，而其他的實(shí)施方案可使用本領(lǐng)域一般已知的技術(shù)容易地產(chǎn)生。本文所用的術(shù)語(yǔ)“單體”通常指以下單體，其通過(guò)磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小范圍從少量單體單元(例如從約3-4)到約數(shù)百個(gè)單體單元的寡核苷酸。磷酸二酯鍵的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”涵蓋天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，先前認(rèn)為“非天然存在”的多種核苷酸后來(lái)已在自然中發(fā)現(xiàn)。因此，“核苷酸”不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，也包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。其他類型的核苷酸的說(shuō)明性實(shí)例為以下分子，其含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N4, N4-橋亞乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6, N6-橋亞乙基_2，6_ 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷和在Bermer等美國(guó)專利第5，432，272號(hào)中描述的“非天然存在的”核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”意在涵蓋這些實(shí)例以及其類似物和互變異構(gòu)體中的每一個(gè)和全部。尤其令人關(guān)注的核苷酸為含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，其被認(rèn)為是有關(guān)人中的治療和診斷應(yīng)用的天然存在核苷酸。核苷酸包括天然2，-脫氧和2，-羥基糖，例如，如Kornberg和Baker，DNA復(fù)制(DNA R印lication)，第2 版(Freeman，San Francisco, 1992)中所述的以及其類似物。提及核苷酸的“類似物”包括具有經(jīng)修飾的堿基部分和/或經(jīng)修飾的糖部分的合成核苷酸(參見例如，由Scheit，核苷酸類似物(Nucleotide Analogs), John Wiley, New York，1980 ;Freier 禾口 Altmann， (1997)Nucl. Acid. Res. ,25(22), 4429-4443, Toulme, J. J. , (2001)Nature Biotechnology 19 17-18 ；Manoharan Μ. , (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 117-139 ；Freier S. Μ. , (1997)Nucleic Acid Research,25 4429-4443,Uhlman,Ε. ， (2000)Drug Discovery & Development，3 203-213,Herdewin P.， (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.，10 :297_310—般描述的)；2，-0，3，-C-連接的[3. 2. 0] 二環(huán)阿糖核苷(參加例如 N. K Christiensen.，等，(1998) J. Am. Chem. Soc.， 120 5458-5463 ；Prakash TP, Bhat B. (2007)Curr Top Med Chem. 7(7) :641_9 ；Eun Jeong Cho, Joo-Woon Lee, Andrew D. Ellington，作為傳感器的適配體的應(yīng)用(Applications of Aptamers as Sensors) Annual Review of Analytical Chemistry, 2009 年 7 月，第 2 卷， 241-264頁(yè))。這類類似物包括設(shè)計(jì)以增強(qiáng)結(jié)合特性的合成核苷酸，所述結(jié)合特性為例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等。本文所用的“雜交”意為寡聚化合物的基本上互補(bǔ)鏈的配對(duì)。一種配對(duì)的機(jī)理涉及寡聚化合物的鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可為沃森-克里
克、Hc^gsteen或反Hoijgsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶為互補(bǔ)的核苷酸，其通過(guò) 形成氫鍵配對(duì)。雜交可在各種環(huán)境下發(fā)生。反義化合物為“可特異地雜交的”，如果所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而導(dǎo)致功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補(bǔ)性來(lái)避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，所述條件即在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況中的生理?xiàng)l件下，以及其中在體外測(cè)定情況下進(jìn)行測(cè)定的條件下。本文所用的短語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”或“嚴(yán)格條件”是指以下條件，在該條件下本發(fā)明的化合物與其靶序列雜交，但與最少數(shù)量的其他序列雜交。嚴(yán)格條件為序列依賴的且在不同環(huán)境下將不同，在本發(fā)明的文段中，在其下寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴(yán)格條件”由寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及正在其中研究它們的試驗(yàn)來(lái)確定。一般而言，嚴(yán)格雜交條件包括低濃度(< 0. 15M)的含有諸如Na++或K++等無(wú)機(jī)陽(yáng)離子的鹽(即，低離子強(qiáng)度)、溫度高于20°C _25°C、低于寡聚化合物靶序列復(fù)合體的Tm，以及存在變性劑，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜，或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，雜交率對(duì)于每甲酰胺減少1. 1%。高嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例為0. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC)/0. 1% (w/v)SDS、60°C下達(dá)30分鐘。 本文所用的“互補(bǔ)的”是指在一個(gè)或兩條寡聚鏈上兩個(gè)核苷酸之間精確配對(duì)的能力。例如，如果在反義化合物的某個(gè)位置上的核堿基能夠與在靶核酸的某個(gè)位置上的核堿基氫鍵合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則認(rèn)為所述寡核苷酸和所述靶核酸之間氫鍵合的位置為互補(bǔ)位置。當(dāng)可彼此氫鍵合的核苷酸占據(jù)了每個(gè)分子中足夠數(shù)量的互補(bǔ)位置時(shí)，聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子為彼此互補(bǔ)的。因此，“可特異性雜交的”和“互補(bǔ)的”為以下術(shù)語(yǔ)，其用于表示在足夠數(shù)量的核苷酸上有足夠程度的精確配對(duì)或互補(bǔ)性，使得穩(wěn)定和特異的結(jié)合發(fā)生在寡聚化合物和靶核酸之間。據(jù)本領(lǐng)域了解，寡聚化合物的序列不需要與其靶核酸的序列100%互補(bǔ)以可特異地雜交。此外，寡核苷酸可在一個(gè)或多個(gè)區(qū)段上雜交，使得插入或鄰近的區(qū)段不涉及雜交事件(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物包含與其靶定的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%的序列互補(bǔ)性。例如，其中反義化合物的20個(gè)核苷酸中有18個(gè)與靶區(qū)互補(bǔ)且因而會(huì)特異地雜交的反義化合物，表示90%互補(bǔ)性。在此實(shí)例中，余下的非互補(bǔ)核苷酸可聚簇或用互補(bǔ)核苷酸間斷且不需要彼此鄰接或鄰接互補(bǔ)核苷酸。因此，長(zhǎng)度為 18個(gè)核苷酸的反義化合物具有4 (四)個(gè)非互補(bǔ)核苷酸，該非互補(bǔ)核苷酸位于與靶核酸完全互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)的側(cè)面，所述反義化合物會(huì)具有與靶核酸77. 8%的總互補(bǔ)性，因此落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。反義化合物與靶核酸區(qū)的互補(bǔ)性百分比可使用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本局部比對(duì)搜索工具)和PowerBLAST程序常規(guī)地確定(Altschul等，(1990) J. Mol. Biol.， 215,403-410 ；Zhang和Madden，(1997)Genome Res. ,7,649-656) 同源性、序列同一性或互補(bǔ)性百分比可通過(guò)例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix操作系統(tǒng)版本8，Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)使用默認(rèn)設(shè)置來(lái)石角定，該禾呈序使用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. Appl. Math.，(1981)2,482-489)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“解鏈溫度(Tm) ”是指以下溫度，在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下，在該溫度下50%與靶序列互補(bǔ)的寡核苷酸在平衡狀態(tài)下與靶序列雜交。典型地， 對(duì)于短寡核苷酸(例如，10-50個(gè)核苷酸)而言嚴(yán)格條件為以下條件，其中鹽濃度至少為約 0. 01-1. OMNa離子濃度(或其他鹽)，pH 7. 0-8. 3且溫度至少為約30°C。嚴(yán)格條件也可通過(guò)外加諸如甲酰胺等去穩(wěn)定劑來(lái)達(dá)到。本文所用的“調(diào)節(jié)”意為在基因表達(dá)方面的增加(刺激)或減少(抑制)。術(shù)語(yǔ)“變體”，當(dāng)用于多核苷酸序列的情況下時(shí)，可包括有關(guān)野生型基因的多核苷酸序列。此定義也可包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)的”變體。剪接變體可具有與參比分子顯著的同一性，但因?yàn)樵趍RNA加工期間外顯子的交替剪接而通常具有更多或更少數(shù)量的多核苷酸。對(duì)應(yīng)的多肽可具有附加的功能域或不存在域。物種變體為在不同物種之間不同的多核苷酸序列。本發(fā)明中尤其實(shí)用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可由核酸序列中的至少一個(gè)突變產(chǎn)生并可導(dǎo)致產(chǎn)生改變的mRNA或者其結(jié)構(gòu)或功能可能改變或不變的多肽。任何給定的天然或重組基因可不具有、具有一個(gè)或許多等位基因形式。 產(chǎn)生變體的常見突變變化一般歸因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。這些變化類型中的每一個(gè)可單獨(dú)或與其他類型聯(lián)合發(fā)生，在給定序列中發(fā)生一次或多次。產(chǎn)生的多肽一般將具有相對(duì)于彼此的顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體為在給定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態(tài)變體也可包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)或單堿基突變，其中多核苷酸序列因一個(gè)堿基而不同。SNP的存在可指示例如具有疾病狀態(tài)傾向(即與抗性相對(duì)的易感性)的某個(gè)種群，。 衍生多核苷酸包括經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的核酸，例如用烷基、?；虬被脫Q氫。衍生物 (例如，衍生寡核苷酸)可包含非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵。這些中示例性的是硫代磷酸酯及本領(lǐng)域已知的其他含硫的種類。衍生核酸也可含有標(biāo)記，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒，等等?！把苌摹倍嚯幕螂臑榻?jīng)修飾的多肽或肽，例如，通過(guò)糖基化、聚乙二醇化、磷酸化作用、硫酸鹽化作用、還原/烷基化、?；⒒瘜W(xué)偶聯(lián)或溫性福爾馬林處理。也可將衍生物修飾以含有可檢測(cè)標(biāo)記(直接地或間接地)，包括但不限于放射性同位素、熒光和酶標(biāo)記。本文所用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”或“患者”意在包括例如人、棉羊、麋鹿、鹿、長(zhǎng)耳鹿、貂、哺乳動(dòng)物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬行動(dòng)物、魚、昆蟲和蜘蛛類。“哺乳動(dòng)物”涵蓋通常在醫(yī)療護(hù)理下的溫血哺乳動(dòng)物(例如，人和馴養(yǎng)動(dòng)物)。實(shí)例包括貓科動(dòng)物、犬、馬、牛科動(dòng)物和人，以及僅僅人?！疤幚怼被颉爸委煛焙w對(duì)哺乳動(dòng)物中疾病狀態(tài)的治療，并包括(a)防止疾病狀態(tài)出現(xiàn)于哺乳動(dòng)物中，特別是當(dāng)這類哺乳動(dòng)物傾向于疾病狀態(tài)但尚未診斷為患有該疾病狀態(tài)時(shí)；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如，阻止其發(fā)展；和/或(c)減輕疾病狀態(tài)，例如，引起疾病狀態(tài)的退行直到達(dá)到所需的終末點(diǎn)。治療也包括改善疾病的癥狀(例如，減少疼痛或不適)，其中這類改善可直接或可非直接地影響疾病(例如，原因、傳遞、表達(dá)等)?！吧窠?jīng)變性疾病”是指大范圍的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的疾病和病癥，包括例如帕金森病、亨廷頓舞蹈病(Huntington's Disease)、阿爾茨海默氏病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、癡呆、多發(fā)性硬化和其他與神經(jīng)元細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病或病癥?！按x病”是指大范圍的內(nèi)分泌系統(tǒng)的疾病和病癥，包括例如胰島素抵抗、糖尿病、 肥胖癥、葡萄糖耐量降低、高膽固醇血癥、高血糖癥、血脂障礙(dyslipidemia)和高脂血癥。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子"SIRT1蛋白”是指沉默調(diào)節(jié)蛋白脫乙酰酶的sir2家族的成員。在一個(gè)實(shí)施方案中，SIRTl蛋白包括酵母Sir2 (GenBank檢索號(hào)P53685)、秀麗隱桿線蟲(C. elegans) Sir-2. 1 (GenBank 檢索號(hào) NP. sub. —501912)、人 SIRTl (GenBank 檢索號(hào) NM. sub. —012238 和 NP. sub. —036370 (或 AF083106))。SIRTl “沉默調(diào)節(jié)蛋白”為包含SIR2域的蛋白，該域定義為在Pfam家族 “SIR2”-PF02146(附于附錄)中得分為命中(hits)的氨基酸序列。此家族在INTERPR0 數(shù)據(jù)庫(kù)中提及為INTERPR0描述(條目IPR003000)。為了在蛋白序列中鑒定“SIR2”域的存在，以及確定目標(biāo)多肽或蛋白具有特定圖譜，可針對(duì)HMMs的Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(例如， Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)，版本9)使用默認(rèn)參數(shù)搜索蛋白的氨基酸序列(http://WWW. sanger.ac.uk/ Software/Pfam/HMM_search)。SIR2 域在 Pfam 中索引為 PF02146 以及在 INTERPR0 中為 INTERPR0 描述(條目 IPR003000)。Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)的描述可在 “The Pfam Protein Families Database (Pfam ^ ^MMWiMf^ ) " Bateman k 等(2002) Nucleic Acids Research 30(1) 276-280 和 Sonhammer 等(1997)Proteins 28(3) 405-420 中找到，HMMs 的詳細(xì)描述可參考例如 Gribskov 等( 1990)Meth. Enzymol. 183 146-159 ；Gribskov 等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :4355_4358 ；Krogh 等(1994) J. Mol. Biol. 235 1501-1531 ；和 Stultz 等 (1993)Protein Sci. 2 :305_314。靶標(biāo)在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包括沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的核酸序列，包括但不限于與SIRTl有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將反義寡核苷酸用于預(yù)防或治療與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl) 有關(guān)的疾病或病癥。沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)為廣泛分布于所有生物體中的蛋白修飾酶。 SIRTl為酵母煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴型脫乙酰酶沉默信息調(diào)節(jié)子2 (稱為Sir2)的哺乳動(dòng)物同源物，其為最佳表征的SIRT家族成員。SIRTl調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞譜系的細(xì)胞生理學(xué)。 SIRTl活性的調(diào)節(jié)劑可用于改善、治療或預(yù)防與脂肪生理學(xué)有關(guān)的疾病和病癥，例如，肥胖癥，肥胖相關(guān)的疾病，或脂肪相關(guān)的代謝病癥。SIRTl在數(shù)種模式生物體中調(diào)節(jié)壽命且涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的數(shù)個(gè)過(guò)程，包括細(xì)胞存活、分化和代謝。經(jīng)由諸如白藜蘆醇等SIRT激活化合物或與熱量限制有關(guān)的代謝條件作用的SIRTl誘導(dǎo)，可具有神經(jīng)保護(hù)特性，因而延遲神經(jīng)變性過(guò)程，從而提高壽命(Han SH, (2009) J Clim Neurol. Sep ；5 (3) 120-5. ；Michan S，等(2007) Biochem J. 404(1) :1_13·)。有數(shù)個(gè)報(bào)道支持SIRTl在神經(jīng)元系統(tǒng)中的軸突保護(hù)作用。軸突變性為在周圍神經(jīng)病變和神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默氏病(AD)和肌萎縮側(cè)索硬化中均觀察到的主要形態(tài)特征(Fischer LR，等(2004) Exp Neurol 185 232-240 ；Stokin GB，等(2005) Science 307 1282-1288)。軸突變性通常發(fā)生于變性過(guò)程的早期階段且常常早于或密切關(guān)聯(lián)于諸如認(rèn)知功能減退等臨床癥狀(Yamamoto H，等(2007)Mol Endocrinol. 21(8) :1745_1755)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸對(duì)于SIRTl的多核苷酸(其包括但不限于非編碼區(qū))而言為特異的。SIRTl靶標(biāo)包括SIRTl的變體；SIRTl的突變體，包括SNP ；SIRTl 的非編碼序列；等位基因、片段等。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義RNA分子。依照本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不單獨(dú)限于SIRTl多核苷酸，而是擴(kuò)展到 SIRTl的任何同種型、受體、同源物、非編碼區(qū)等。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸靶定SIRTl靶標(biāo)的天然反義序列(針對(duì)編碼和非編碼區(qū)的天然反義)，包括但不限于其變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義RNA或DNA分子。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包括變體，其中在所述化合物的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上存在不同的堿基。例如，如果第一個(gè)核苷酸為腺苷，則可產(chǎn)生在此位置含有胸苷、鳥苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸的變體。這可在所述反義化合物的任何位置上完成。然后使用本文所述的方法來(lái)檢測(cè)這些化合物以確定其抑制靶核酸的表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，反義化合物與靶標(biāo)之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約 50%-約60%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約60% -約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約70% -約80%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約80% -約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。反義化合物在以下情況時(shí)為可特異性雜交的所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起活性損失，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。這類條件包括，即，在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況中的生理?xiàng)l件，以及其中在體外測(cè)定情況下進(jìn)行測(cè)定的條件。反義化合物，不論DNA、RNA、嵌合的、取代的等等，在以下情況時(shí)為可特異性雜交的所述化合物與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能而引起效用損失， 并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免所述反義化合物與非靶序列的非特異性結(jié)合，所述條件即在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況中的生理?xiàng)l件下，以及在體外測(cè)定情況下在其中進(jìn)行測(cè)定的條件下。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶定SIRTl調(diào)節(jié)SIRTl的表達(dá)或功能，SIRTl包括但不限于使用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列、一個(gè)或多個(gè)如SEQ ID N0:6-47所述的序列，等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)或功能與對(duì)照相比為增量調(diào)節(jié)的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)或功能與對(duì)照相比為減量調(diào)節(jié)的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO :6_47所述的核酸序列， 包括使用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸、較短或較長(zhǎng)的片段、經(jīng)修飾的鍵等。經(jīng)修飾的鍵或核苷酸間鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物?？蛇B接到本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或經(jīng)修飾的磷酸基)，可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，以及它們摻入到核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身也為已知的且無(wú)需在此描述。反義物的特異性和敏感性也被本領(lǐng)域的技術(shù)人員用于治療用途。已將反義寡核苷酸用作在動(dòng)物和人的疾病狀態(tài)治療中的治療部分。已將反義寡核苷酸安全和有效地施用給人，并且目前正在進(jìn)行許多臨床試驗(yàn)。因此已確定寡核苷酸可為有用的治療形式，其可將經(jīng)配置以在用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物尤其人的治療方案中有用。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，寡聚反義化合物(具體地寡核苷酸)結(jié)合到靶核酸分子并調(diào)節(jié)由靶基因編碼的分子的表達(dá)和/或功能。會(huì)受到干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。會(huì)受到干擾的RNA功能包括所有的生活機(jī)能，例如RNA向蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)的易位、蛋白質(zhì)自RNA的翻譯、產(chǎn)生一種或多種mRNA種類的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進(jìn)的催化活性。所述功能可被增量調(diào)節(jié)或受抑制，這取決于所需的功能。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、 可變剪接物、引物、探針和與靶核酸的至少一部分雜交的其他寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。
在本發(fā)明的情況下，將反義化合物靶定到特定的核酸分子可為多步過(guò)程。所述過(guò)程通常以鑒定待調(diào)節(jié)其功能的靶核酸開始。此靶核酸可為，例如其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)有關(guān)的細(xì)胞基因(或從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或來(lái)自傳染劑的核酸分子。在本發(fā)明中，所述靶核酸編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白1 (SIRTl)。靶定過(guò)程通常也包括確定靶核酸內(nèi)的至少一個(gè)靶區(qū)、區(qū)段或位點(diǎn)以用于發(fā)生反義相互作用，使得產(chǎn)生所需的效應(yīng)，例如，表達(dá)的調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的文段中，術(shù)語(yǔ)“區(qū)”定義為具有至少一個(gè)可識(shí)別結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸區(qū)內(nèi)為區(qū)段?！皡^(qū)段”定義為在靶核酸內(nèi)區(qū)的較小或亞部分。本發(fā)明所用的“位點(diǎn)”定義為靶核酸內(nèi)的位置。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的天然反義序列并調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl) (SEQ ID NO 1)的表達(dá)和/或功能。反義序列的實(shí)例包括 SEQ ID NO :2-5。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到沉默 調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段并調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的表達(dá)和/或功能。所述區(qū)段包含沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)有義或反義多核苷酸的至少五個(gè)連續(xù)的核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸對(duì)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的天然反義序列而言為特異的，其中所述寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID N0:6-47所述的序列、使用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸、較短或較長(zhǎng)的片段、經(jīng)修飾的鍵等。經(jīng)修飾的鍵或核苷酸間鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物?？蛇B接到本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或經(jīng)修飾的磷酸基)，可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸鏈烷酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，以及它們摻入到核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身也為已知的且無(wú)需在此描述。由于如本領(lǐng)域已知，翻譯起始密碼子通常為5' -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在相應(yīng)的DNA分子中為5' -ATG)，因而翻譯起始密碼子也稱為“AUG密碼子”、“起始密碼子” 或“AUG起始密碼子”。少數(shù)基因具有翻譯起始密碼子，其具有RNA序列5' -GUG、5' -UUG 或5' -CUG;以及5' -AUA、5' -ACG和5' -CUG已顯示在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語(yǔ)“翻譯起始密碼子”和“起始密碼子”可包括許多密碼子序列，但在每個(gè)情況下起始氨基酸通常為甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有兩個(gè)或更多個(gè)備選起始密碼子，其中的任何一個(gè)可優(yōu)先地用于在特定細(xì)胞類型或組織中或在特定設(shè)定的條件下的翻譯起始。在本發(fā)明的文段中，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”是指這樣的一個(gè)或多個(gè)密碼子，其在體內(nèi)用于起始由編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯，與這類密碼子的一個(gè)或多個(gè)序列無(wú)關(guān)?；虻姆g終止密碼子(或“終止密碼子”)可具有三個(gè)序列中的一個(gè)，即，5' -UAA、5' -UAG和5' _UGA(對(duì)應(yīng)的DNA序列分別為 5' -TAA、5' -TAG 和 5' -TGA)。術(shù)語(yǔ)“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”是指在從翻譯起始密碼子開始在任一方向上(即，5’或3’)包含約25-約50個(gè)連續(xù)的核苷酸的這類mRNA或基因的部分。類似地，術(shù)語(yǔ)“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”是指在從翻譯終止密碼子開始在任一方向上(S卩，5’或3’ )包含約25-約50個(gè)連續(xù)的核苷酸的這類mRNA或基因的部分。因此， “起始密碼子區(qū)”(或“翻譯起始密碼子區(qū)”)和“終止密碼子區(qū)”(或“翻譯終止密碼子區(qū)”) 均為可用本發(fā)明的反義化合物有效地靶定的區(qū)。本領(lǐng)域已知的可讀框(ORF)或“編碼區(qū)”是指在翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)，也為可有效地靶定的區(qū)。在本發(fā)明的內(nèi)容內(nèi)，靶定的區(qū)為包含基因的可讀框 (ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)。另一種靶區(qū)包括本領(lǐng)域已知的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)，是指在翻譯起始密碼子的5’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的5’帽位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上對(duì)應(yīng)的核苷酸)。再一種靶區(qū)包括本領(lǐng)域已知的3’非翻譯區(qū)(3' UTR)，是指在翻譯終止密碼子3’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的翻譯終止密碼子和3’末端之間的核苷酸(或基因上對(duì)應(yīng)的核苷酸)。mRNA的5’帽位點(diǎn)包含經(jīng)由5’ -5’三磷酸酯鍵連接到mRNA的5’最末端殘基的N7-甲基化鳥苷殘基。認(rèn)為mRNA的5’帽區(qū)包括5’帽結(jié)構(gòu)本身以及鄰近該帽位點(diǎn)的前50個(gè)核苷酸。用于本發(fā)明的另一種個(gè)靶區(qū)為5’帽區(qū)。

盡管一些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物為直接翻譯的，但是許多包含一個(gè)或多個(gè)稱為“內(nèi)含子”的區(qū)，其在翻譯前被從轉(zhuǎn)錄物中切除。余下的(且因此翻譯的)區(qū)稱為“外顯子”，并將其剪接在一起形成連續(xù)的mRNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶定剪接位點(diǎn)(即，內(nèi)含子-外顯子連接處或外顯子-內(nèi)含子連接處)在疾病牽涉異常剪接或疾病牽涉特定剪接產(chǎn)物過(guò)度產(chǎn)生的狀況中特別有用。因重排或缺失所致的異常融合連接處為靶位點(diǎn)的另一個(gè)實(shí)施方案。 經(jīng)由來(lái)自不同基因來(lái)源的兩個(gè)(或更多個(gè))mRNA的剪接過(guò)程產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱為“融合轉(zhuǎn)錄物”。內(nèi)含子可使用靶定到例如DNA或前-mRNA的反義化合物來(lái)有效地靶定。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區(qū)并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到天然反義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到有義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能?？勺僐NA轉(zhuǎn)錄物可產(chǎn)生自DNA的相同基因組區(qū)。這些可變轉(zhuǎn)錄物一般稱為“變體”。 更具體地，“前mRNA變體”為產(chǎn)生自相同的基因組DNA的轉(zhuǎn)錄物，其與產(chǎn)生自相同的基因組 DNA的其他轉(zhuǎn)錄物在其起始或終止位置上不同且包含內(nèi)含子和外顯子序列二者。當(dāng)剪接期間切除了一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)、或其部分時(shí)，前mRNA變體產(chǎn)生更小的“mRNA變體”。因此，mRNA變體為經(jīng)加工的前mRNA變體，并且由于剪接所致，每種獨(dú)特的前mRNA變體必須總是產(chǎn)生獨(dú)特的mRNA變體。這些mRNA變體也稱為“可變剪接變體”。 如果未發(fā)生前mRNA變體的剪接，則前mRNA變體與mRNA變體完全相同。變體可通過(guò)使用可變信號(hào)啟動(dòng)或終止轉(zhuǎn)錄來(lái)產(chǎn)生。前mRNA和mRNA可具有多于一個(gè)起始密碼子或終止密碼子。起源于使用可變起始密碼子的前mRNA或mRNA的變體稱為該前mRNA或mRNA的“可變起始變體”。使用可變終止密碼子的轉(zhuǎn)錄物稱為該前mRNA或mRNA 的“可變終止變體”?？勺兘K止變體的一個(gè)具體類型為“聚腺苷酸變體”，其中所產(chǎn)生的多重轉(zhuǎn)錄物起因于轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)對(duì)其中一種“聚腺苷酸終止信號(hào)”的可變選擇，從而產(chǎn)生終止在獨(dú)特的聚腺苷酸位點(diǎn)上的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明的文段內(nèi)，本文所述的變體類型也為靶核酸的實(shí)施方案。將反義化合物與之雜交的靶核酸上的位置定義為活性反義化合物靶定的靶區(qū)的至少5-核堿基部分。雖然將某些示例性靶區(qū)段的具體序列列舉于此，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)至IJ，這些用于說(shuō)明和描述在本發(fā)明范圍內(nèi)的具體實(shí)施方案。根據(jù)本公開內(nèi)容，其他靶區(qū)段可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地鑒定。認(rèn)為以下靶區(qū)段同樣適合靶定，該靶區(qū)段長(zhǎng)度為5-100個(gè)核苷酸并包含選自說(shuō)明性的優(yōu)選靶區(qū)段之內(nèi)的至少五(5)個(gè)連續(xù)核苷酸段。 靶區(qū)段可包括DNA或RNA序列，其包含來(lái)自說(shuō)明性優(yōu)選靶區(qū)段之一的5’末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸為相同DNA或RNA的連續(xù)段，其開始于靶區(qū)段5’末端的緊接上游且持續(xù)到該DNA或RNA包含約5-約100個(gè)核苷酸為止)。類似優(yōu)選的靶區(qū)段由以下DNA或RNA序列表示，該序列包含來(lái)自說(shuō)明性優(yōu)選靶區(qū)段之一的3’末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸為相同DNA或RNA的連續(xù)段，其開始于靶區(qū)段3’末端的緊接下游且持續(xù)到該DNA或RNA包含約5-約100個(gè)核苷酸為止)。用本文所說(shuō)明的靶區(qū)段準(zhǔn)備的本領(lǐng)域技術(shù)人員，無(wú)需過(guò)度試驗(yàn)就能夠鑒定進(jìn)一步優(yōu)選的靶區(qū)段。一旦鑒定一個(gè)或多個(gè)靶區(qū)、區(qū)段或位點(diǎn)，就選出與該靶足夠互補(bǔ)的反義化合物，所述足夠互補(bǔ)即充分良好且具有足夠的特異性地雜交以得到所需的效果。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，寡核苷酸與特定靶標(biāo)的反義鏈結(jié)合。所述寡核苷酸長(zhǎng)度為至少5個(gè)核苷酸且可為合成的，使得每個(gè)寡核苷酸靶定重疊的序列，由此將寡核苷酸合成為覆蓋靶多核苷酸的全長(zhǎng)。靶標(biāo)也包括編碼區(qū)以及非編碼區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選通過(guò)反義寡核苷酸來(lái)靶定特定核酸。將反義化合物靶定到特定核酸為多步過(guò)程。該過(guò)程通常開始于鑒定其功能待調(diào)節(jié)的核酸序列。這可為，例如其表達(dá)與特定的病癥或疾病狀態(tài)有關(guān)的細(xì)胞基因(或從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或非編碼多核苷酸，例如非編碼RNA(ncRNA)。可將RNA歸類為(1)信使RNA(mRNA)，其被翻譯成蛋白，和(2)非編碼蛋白的 RNA(ncRNA)。ncRNA包括微小RNA、反義轉(zhuǎn)錄物和包含高密度的終止密碼子并缺少任何廣泛的“可讀框”的其他轉(zhuǎn)錄單元(TU)。許多ncRNA似乎開始于蛋白編碼基因座的3’非翻譯區(qū) (3 ‘ UTR)中的起始位點(diǎn)。ncRNA常常為罕見的且至少一半已由FANTOM協(xié)會(huì)測(cè)序的ncRNA 似乎未聚腺苷酸化。大多數(shù)研究者因?yàn)槊黠@的原因而關(guān)注經(jīng)加工并輸出到細(xì)胞質(zhì)的聚腺苷酸化mRNA。近來(lái)，已顯示非聚腺苷酸化核RNA的群體可非常巨大，且許多這類轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生于所謂的基因內(nèi)區(qū)(Cheng，J.等(2005)Science 308 (5725), 1149-1154 ；Kapranov, P.等 (2005). Genome Res 15 (7)，987-997)。ncRNA可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制為通過(guò)與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對(duì)。通過(guò)堿基配對(duì)起作用的RNA可分組成(1)順式編碼RNA，其在相同的基因位置、 但在其所作用的RNA相反的鏈上編碼，因此顯示對(duì)其靶標(biāo)完美的互補(bǔ)性，和(2)反式編碼 RNA，其在與其所作用的RNA不同的染色體位置上編碼，一般不表現(xiàn)出與其靶標(biāo)完美的堿基配對(duì)潛能。不希望受到理論的約束，通過(guò)本文所述的反義寡核苷酸來(lái)擾亂反義多核苷酸，可改變相應(yīng)有義信使RNA的表達(dá)。然而，此調(diào)節(jié)可為不一致的(反義敲減導(dǎo)致信使RNA上升) 或一致的(反義敲減導(dǎo)致伴隨的信使RNA下降)。在這些情況下，可將反義寡核苷酸靶定到反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，引起其敲減或隔離。編碼以及非編碼反義物可以相同的方式來(lái)靶定，并且任一種類別均能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)有義轉(zhuǎn)錄物——以一致或不一致的方式。用于鑒定針對(duì)靶標(biāo)使用的新寡核苷酸的策略可基于通過(guò)反義寡核苷酸或任何其他調(diào)節(jié)所需靶標(biāo)的方法來(lái)敲減反義RNA轉(zhuǎn)錄物。策略1 在不一致調(diào)節(jié)的情況下，敲減所述反義轉(zhuǎn)錄物提升常規(guī)(有義)基因的表達(dá)。若后者基因編碼已知或假定的藥物靶標(biāo)，則其反義配對(duì)物的敲減可預(yù)料到地模擬受體激動(dòng)劑或酶刺激劑的作用。
策略2 在一致調(diào)節(jié)的情況下，可伴隨地敲減反義和有義轉(zhuǎn)錄物，從而達(dá)到常規(guī) (有義)基因表達(dá)的協(xié)同下降。如果例如將反義寡核苷酸用于進(jìn)行敲減，則此策略可用于應(yīng)用針對(duì)有義轉(zhuǎn)錄物靶定的一種反義寡核苷酸和針對(duì)相應(yīng)反義轉(zhuǎn)錄物的另一種反義寡核苷酸，或同時(shí)靶定重疊的有義和反義轉(zhuǎn)錄物的單個(gè)有力對(duì)稱的反義寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)，以及與靶核酸的至少一部分雜交且調(diào)節(jié)其功能的其他寡聚化合物。因此，其可為DNA、RNA、DNA樣、RNA 樣、或其混合物，或可為這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可為單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物且 可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或末端突起、錯(cuò)配或環(huán)。將反義化合物常規(guī)地制備為線性的但可被連接，或者另外制備成環(huán)狀和/或分枝的。反義化合物可包括構(gòu)建體， 例如雜交的兩條鏈以形成完全或部分雙鏈的化合物，或具有足夠自我互補(bǔ)性的單鏈以允許雜交并形成完全或部分雙鏈化合物。可將所述兩條鏈內(nèi)部連接而留下自由的3’或5’末端，或可將其連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可在5’或3’末端上包含突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸物。所述雙鏈化合物任選可在末端上包含突出端。進(jìn)一步的修飾可包括與末端之一、經(jīng)挑選的核苷酸位置、糖位置或與核苷間鍵之一連接的綴合基團(tuán)?；蛘?，所述兩條鏈可經(jīng)由非核酸部分或連接基團(tuán)來(lái)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時(shí)，dsRNA可呈自我互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，其在其自身上對(duì)折形成雙鏈體。因此，所述dsRNA可為完全或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特定調(diào)節(jié)可通過(guò)在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)dsRNA發(fā)夾來(lái)完成，然而，在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)或功能為增量調(diào)節(jié)的。當(dāng)形成自兩條鏈，或呈在其自身上對(duì)折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)發(fā)夾型分子形式的單鏈時(shí)，所述兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))為以沃森_克里克模式堿基配對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈。一旦引入系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實(shí)現(xiàn)靶核酸的切割或其他修飾，或可經(jīng)由基于占據(jù)的機(jī)制來(lái)運(yùn)作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為“DNA樣”(即，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’脫氧糖和一般地T而不是U堿基)或 "RNA樣”(即，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’羥基或2’修飾的糖和一般U而不是T堿基)。核酸螺旋可采取多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最普通地A和B型。據(jù)認(rèn)為，一般而言，具有B型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“DNA樣”而具有A型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“RNA樣”。在一些(嵌合的)實(shí)施方案中，反義化合物可包含A和B型區(qū)兩者。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所需的寡核苷酸或反義化合物，包括以下中的至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包含經(jīng)修飾的鍵的反義寡核苷酸、干擾 RNA (RNAi)、短干擾 RNA (siRNA)；微小干擾 RNA (miRNA)；小時(shí)序 RNA (stRNA)；或短發(fā)夾 RNA(shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因活化(RNAa)；小活化RNA(saRNA)、或其組合。dsRNA也可激活基因表達(dá)，已稱為“小RNA誘導(dǎo)的基因活化”或RNAa的機(jī)制。dsRNA 靶定基因啟動(dòng)子來(lái)誘導(dǎo)相關(guān)基因有效的轉(zhuǎn)錄活化。在人細(xì)胞中使用合成dsRNA(稱為“小活化RNA” (saRNA))證實(shí)RNAa。目前未知RNAa在其他生物體中是否為保守的。已發(fā)現(xiàn)小雙鏈RNA (dsRNA)(例如小干擾RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA))是稱為 RNA干擾(RNAi)的進(jìn)化保守機(jī)制的觸發(fā)物。RNAi總是經(jīng)由重構(gòu)染色質(zhì)來(lái)導(dǎo)致基因沉默，從而抑制轉(zhuǎn)錄、降解互補(bǔ)mRNA或阻斷蛋白翻譯。然而，在下文實(shí)施例章節(jié)詳述的例子中，顯示寡核苷酸增加沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸和其編碼產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。dsRNA也可充當(dāng)小活化RNA(saRNA)。不希望受理論約束，通過(guò)靶定基因啟動(dòng)子中的序列，saRNA在稱為dsRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化(RNAa)的現(xiàn)象中誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文鑒定的“優(yōu)選靶區(qū)段”可用于篩選調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白 I(SIRTl)多核苷酸表達(dá)的另外化合物?！罢{(diào)節(jié)劑”為以下化合物，其減少或增加編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的核酸分子的表達(dá)并包含與優(yōu)選靶區(qū)段互補(bǔ)的至少5-核苷酸部分。篩選方法包括以下步驟使編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的核酸分子的優(yōu)選靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，以及選擇一種或多種減少或增加編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl) 多核苷酸的核酸分子表達(dá)的候選調(diào)節(jié)劑(例如SEQ ID N0:6-47)。一旦顯示候選調(diào)節(jié)劑或調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如減少或增加)編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的核酸分子表達(dá)，則將所述調(diào)節(jié)劑用于沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸功能的進(jìn)一步調(diào)查研究，或用作依照本發(fā)明的研究、診斷或治療劑。靶定反義序列優(yōu)選地調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如，SIRTl基因(檢索號(hào)NM_012238. 3 ； UCSC基因組數(shù)據(jù)庫(kù))。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶標(biāo)為沉默調(diào)節(jié)蛋白1基因的反義多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶定沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸(例如檢索號(hào)NM_012238.3 Seq ID No. 1，圖10)的有義和/或天然反義序列、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子且所述靶標(biāo)包括反義和/或有義SIRTl多核苷酸的編碼和非編碼區(qū)。本發(fā)明的優(yōu)選靶區(qū)段也可與本發(fā)明的其各自互補(bǔ)的反義化合物結(jié)合，以形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。本領(lǐng)域中已顯示這類雙鏈寡核苷酸部分經(jīng)由反義機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)靶表達(dá)和調(diào)節(jié)翻譯以及RNA加工。此外，所述雙鏈部分可經(jīng)受化學(xué)修飾(Fire等人，(1998) Nature，391， 806-811 ；Timmons 和 Fire, (1998)Nature,395, 854 ；Timmons 等人(2001)Gene，263， 103-112 ；Tabara ^ 人，(1998)Science, 282,430-431 ；Montgomery ^ 人，(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,95,15502-15507 ；Tuschl ^ 人，(1999)Genes Dev.，13，3191-3197 ； Elbashir 等人，(2001)Nature，411，494-498 ;Elbashir 等人，(2001)Genes Dev. 15, 188-200)。例如，已顯示這類雙鏈部分通過(guò)所述雙鏈體的反義鏈與靶標(biāo)的典型雜交來(lái)抑制該靶標(biāo)，從而觸發(fā)靶標(biāo)的酶促降解(Tijsterman等人，(2002) Science, 295,694-697)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶定沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸 (例如檢索號(hào)NM_012238. 3)、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子。依照本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不單獨(dú)限于沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)而是延伸到沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)分子的任何同種型、受體、同源物等等。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸靶定SIRTl多核苷酸(例如，如SEQ ID NO 2-5所述的多核苷酸)的天然反義序列，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID N0:6-47所述。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)反義物的核酸序列互補(bǔ)或結(jié)合，并調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)分子的表達(dá)和/或功能，所述核酸序列包括但不限于與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸有關(guān)的非編碼有義和/或反義序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸與如SEQ ID NO :2_5所述的SIRTl天然反義物的核酸序列互補(bǔ)或結(jié)合，并調(diào)節(jié)SIRTl分子的表達(dá)和/或功能。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :6_47的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的序列且調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)分子的表達(dá)和/或功能。多核苷酸靶標(biāo)包括SIRTl，包括其家族成員、SIRTl的變體；SIRTl的突變體，包括 SNP ；SIRTl的非編碼序列；SIRTl的等位基因；種變體、片段等等。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶定沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的寡核苷酸包括反義RNA、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA)；小干擾RNA(miRNA)；小時(shí)序 RNA(StRNA)；或短發(fā)夾RNA (shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因活化(RNAa)；或小活化RNA (saRNA)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸(例如SEQ ID NO 6-47)的靶定調(diào)節(jié)這些靶標(biāo)的表達(dá)和功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)或功能相比于對(duì)照為增量調(diào)節(jié)的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)或功能相比于對(duì)照為減量調(diào)節(jié)的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義化合物包括如SEQ ID NO :6_47所述的序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸、更短或更長(zhǎng)的片段、經(jīng)修飾的鍵等等。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO :6_47包含一個(gè)或多個(gè)LNA核苷酸。所需靶核酸的調(diào)節(jié)可以本領(lǐng)域已知的數(shù)個(gè)方式來(lái)進(jìn)行。例如，反義寡核苷酸、 siRNA等。酶促核酸分子(例如，核酶)為能夠催化一種或多種不同反應(yīng)(包括以核苷酸堿基序列特異的方式反復(fù)切割其他單獨(dú)的核酸分子的能力)的核酸分子。這類酶促核酸分子可用于，例如，靶定幾乎任何RNA轉(zhuǎn)錄物(Zaug等人，324，Nature 429 1986 ；Cech, 260 JAMA 3030，1988 ；和 Jefferies 等人，17 Nucleic Acids Research 1371,1989)。由于反式切割酶促核酸分子的序列特異性，其有望作為用于人類疾病的治療劑 (Usman & McSwiggen，(1995)Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294 ；Christoffersen 禾口 Marr， (1995) J. Med. Chem. 38，2023-2037)。可將酶促核酸分子設(shè)計(jì)成在細(xì)胞RNA背景下切割特定的RNA靶標(biāo)。這類切割事件致使mRNA無(wú)功能且終止從該RNA的蛋白表達(dá)。以這種方式，可選擇性地抑制與疾病狀態(tài)有關(guān)的蛋白合成。一般而言，帶有RNA切割活性的酶促核酸通過(guò)首先與靶RNA結(jié)合來(lái)起作用。這類結(jié)合通過(guò)酶促核酸的靶結(jié)合部分來(lái)進(jìn)行，該酶促核酸保持緊密靠近進(jìn)行切割靶RNA的分子的酶促部分。因此，所述酶促核酸首先識(shí)別而后通過(guò)互補(bǔ)的堿基配對(duì)與靶RNA結(jié)合，且一旦與正確的位點(diǎn)結(jié)合，即進(jìn)行酶促地切割靶RNA。這類靶RNA的策略性切割將破壞其指導(dǎo)合成編碼蛋白的能力。在酶促核酸結(jié)合和切割其RNA靶標(biāo)之后，其從該RNA中釋放以尋找另一個(gè)靶標(biāo)且可反復(fù)結(jié)合和切割新靶標(biāo)。已使用諸如體外選擇(進(jìn)化)策略(Orgel，(1979)Proc. R. Soc. London, B 205， 435)等數(shù)種途徑來(lái)進(jìn)化能夠催化各種反應(yīng)的新核酸催化劑，所述反應(yīng)為例如磷酸二酯鍵和酰胺鍵的切割和連接(Joyce, (1989) Gene，82，83-87 ;Beaudry 等人，(1992) Science 257， 635-641 Joyce, (1992) Scientific American 267，90-97 ;Breaker 等人，(1994) TIBTECH 12，268 ;Bartel 等人，(1993) Science 261 1411-1418 ；Szostak, (1993) TIBS 17,89-93 ； Kumar 等人，(1995) FASEB J. ,9,1183 ；Breaker, (1996) Curr. Op. Biotech. , 7,442) 催化活性最佳的核酶的開發(fā)會(huì)顯著地有助于以調(diào)節(jié)基因表達(dá)為目的而采用RNA 切割核酶的任何策略。例如錘頭狀核酶在Mg2+輔因子的飽和(IOmM)濃度下，以約Imin-I的催化速率(kcat)來(lái)起 作用。已顯示人造“RNA連接酶”核酶以約IOOmin-I的速率催化相應(yīng)的自我修飾反應(yīng)。此外，據(jù)了解具有由DNA組成的底物結(jié)合臂的某些經(jīng)修飾的錘頭狀核酶，以接近IOOmin-I的倍數(shù)轉(zhuǎn)換速率(multiple turn-over rate)催化RNA切割。最終，用某些核苷酸類似物置換在錘頭的催化核心內(nèi)的特定殘基產(chǎn)生顯示出在催化速率上多達(dá)10 倍改進(jìn)的修飾核酶。這些研究結(jié)果證實(shí)核酶可以以顯著高于大多數(shù)天然自我切割核酶展示于體外的催化速率，促進(jìn)化學(xué)轉(zhuǎn)化。那么可能的是，可優(yōu)化某些自我切割核酶的結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生最高的催化活性，或者可制備展示出顯著更快的RNA磷酸二酯切割速率的全新RNA模體。通過(guò)符合“錘頭”模型的RNA催化劑來(lái)分子間切割RNA底物首先顯示于1987年 (Uhlenbeck，0. C. (1987) Nature, 328 :596_600)。將所述 RNA 催化劑回收且與多種 RNA 分子反應(yīng)，證實(shí)其為真正催化性的?；凇板N頭”模體設(shè)計(jì)的催化性RNA已通過(guò)在催化性RNA中作出適當(dāng)?shù)膲A基改變以維持與靶序列的必要堿基配對(duì)，來(lái)用于切割特定靶序列(Haseloff和Gerlach，(1988) Nature, 334, 585 ；Walbot 禾口 Bruening， (1988)Nature,334,196 ；Uhlenbeck, 0. C. (1987) Nature, 328 596-600 ；Koizumi, Μ.等人，(1988)FEBS Lett.，228 :228_230)。這允許使用催化性RNA來(lái)切割特定靶序列，并指出根據(jù)“錘頭”模型設(shè)計(jì)的催化性RNA可能在體內(nèi)切割特定底物 RNA(參見 Haseloff 和 Gerlach，(1988)Nature, 334, 585 ；Walbot 和 Bruening， (1988)Nature,334，196 ；Uhlenbeck,0.C. (1987)Nature,328 :596_600)。RNA干擾(RNAi)已成為調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)的強(qiáng)大工具。 此方法要求使用表達(dá)質(zhì)?；虿《疽约凹庸こ蓅iRNA的小發(fā)夾RNA的編碼序列，將小干擾 RNA (siRNA)作為RNA本身或作為DNA遞送。此系統(tǒng)能夠有效將前siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到它們?cè)谄渲谢钴S的細(xì)胞質(zhì)中，并允許使用經(jīng)調(diào)節(jié)的和組織特異的啟動(dòng)子用于基因表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸或反義化合物包括核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或多聚體、或其模擬物、嵌合體、類似物或同源物。此術(shù)語(yǔ)包括由天然存在核苷酸、糖和共價(jià)核苷間(主鏈)鍵組成的寡核苷酸以及具有類似功能的非天然存在部分的寡核苷酸。由于所需性質(zhì)，例如，增強(qiáng)的細(xì)胞攝取、對(duì)靶核酸增強(qiáng)的親和力以及在核酸酶存在時(shí)增大的穩(wěn)定性，常常需要這類經(jīng)修飾或取代的寡核苷酸超過(guò)天然形式。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸或“反義化合物”包括反義寡核苷酸(例如RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類似物或同源物)、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA,以及與靶核酸的至少一部分雜交且調(diào)節(jié)其功能的其他寡聚化合物。因此，它們可為DNA、RNA、DNA樣、RNA樣、或其混合物，或可為這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可為單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物且可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或末端突起、錯(cuò)配或環(huán)。將反義化合物常規(guī)地制備成線性但可經(jīng)連接或者另外地制備成環(huán)狀和/或分枝的。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如雜交的兩條鏈以形成完全或部分雙鏈化合物，或帶有足夠自我互補(bǔ)性的單鏈以允許完全或部分雙鏈化合物的雜交和形成?？蓪⑺鰞蓷l鏈內(nèi)部連接而留下游離的3’或5’末端或可將其連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可在5’或3’末端上包含突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸物。雙鏈化合物任選可在末端上包含突出端。進(jìn)一步的修飾可包括與末端之一、經(jīng)挑選的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵之一連接的綴合基團(tuán)。備選地，所述兩條鏈可經(jīng)由非核酸部分或連接基團(tuán)來(lái)連接。當(dāng)形成自僅一條鏈時(shí)，dsRNA可采取自我互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，其在其自身上對(duì)折形成雙鏈體。因此，所述dsRNA可為完全或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可通過(guò)dsRNA發(fā)夾在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的穩(wěn)定表達(dá)來(lái)完成(Hammond等人，(1991) Nat. Rev. Genet.，2，110-119 ；Matzke 等人，(2001) Curr. Opin. Genet. Dev.，11，221-227 ；Sharp, (2001) Genes Dev.，15，485-490)。當(dāng)形成自兩條鏈或采取在其自身上對(duì)折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式的單鏈時(shí)，所述兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))為以沃森-克里克模式堿基配對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈。一旦引入系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實(shí)現(xiàn)靶核酸的切割或其他修飾，或可經(jīng)由基于占據(jù)的機(jī)制來(lái)運(yùn)作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為“DNA樣”(即，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’脫氧糖和，一般地，T而不是U堿基) 或“RNA樣”(S卩，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’羥基或2’修飾的糖和，一般U而不是T堿基)。 核酸螺旋可采取多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最普通地A和B型。據(jù)認(rèn)為，一般而言，具有B型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“DNA樣”而具有A型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“RNA樣”。在一些(嵌合的) 實(shí)施方案中， 反義化合物可包含A和B型區(qū)兩者。依照本發(fā)明的反義化合物可包含約5-約80個(gè)核苷酸(即約5-約80個(gè)連接核苷)長(zhǎng)度的反義部分。這是指反義鏈或反義化合物部分的長(zhǎng)度。換言之，本發(fā)明的單鏈反義化合物包含5-約80個(gè)核苷酸，而本發(fā)明的雙鏈反義化合物(例如，dsRNA)包含5-約80 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義鏈或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這包括5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79 或 80 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、或其之內(nèi)任何范圍的反義部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物具有10-50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義部分。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這包括具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49或50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、或其之內(nèi)任何范圍的反義部分的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中， 寡核苷酸長(zhǎng)度為15個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義或寡核苷酸化合物具有12或13-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這包括具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、或其之內(nèi)任何范圍的反義部分的反義化合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，施用至少一種靶定沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的任何一種或多種多核苷酸的寡核苷酸，預(yù)防或治療與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸及其編碼產(chǎn)物的異常表達(dá)或功能有關(guān)的疾病，或其他相關(guān)的疾病。可用所述反義寡核苷酸治療的疾病的實(shí)例包括癌癥(例如，乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、CCL、CML、前列腺癌)、神經(jīng)變性疾病 (例如，阿爾茨海默氏病(AD)、亨廷頓舞蹈病ALS、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化，以及由多谷氨酰胺聚集引起的病癥)；骨骼肌疾病(例如，杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchene muscular dystrophy)、骨骼肌萎縮、貝克耳肌營(yíng)養(yǎng)不良或強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良)；代謝病(例如，胰島素抵抗、糖尿病、肥胖癥、葡萄糖耐量降低、高膽固醇血癥、高血糖癥、血脂障礙和高脂血癥)；成年型糖尿病、糖尿病腎病、神經(jīng)病(例如，感覺神經(jīng)病、自主神經(jīng)病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病)；骨病(例如，骨質(zhì)疏松癥)、血液病(例如，白血病)；肝病(例如，由于酗酒或肝炎所致的)；肥胖癥；骨吸收、年齡相關(guān)性黃斑變性、AIDS相關(guān)的癡呆、ALS、貝爾氏麻痹 (Bell' s Palsy)、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病(例如，心律紊亂、慢性充血性心力衰竭、缺血性發(fā)作、冠狀動(dòng)脈疾病和心肌病)、 慢性退行性疾病(例如，心肌疾病)、慢性腎衰竭、2型糖尿病、潰瘍、白內(nèi)障、老視、腎小球腎炎、格-巴(Guillan-Barre)綜合征、出血性卒中、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、SLE、克羅恩氏病、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、慢性阻塞性肺病(COPD)Ji 炎、皮膚老化，以及尿失禁。其他實(shí)例包括與神經(jīng)元細(xì)胞死亡、老化或其他以不需要的細(xì)胞消亡為特征的病況相關(guān)的疾病和病癥。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包括其中不同的堿基存在于化合物中一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上的變體。例如，如果第一個(gè)核苷酸為腺苷，那么可產(chǎn)生在此位置包含胸苷、鳥苷或胞苷的變體。這可在反義或dsRNA化合物的任何位置上進(jìn)行。然后使用本文所述的方法來(lái)檢測(cè)這些化合物以確定其抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，反義化合物與靶標(biāo)之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約 40%-約60%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約60% -約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約70% -約80%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約80% -約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸(例如，SEQ ID NO 6~47中所述的核酸分子)包含一個(gè)或多個(gè)取代或修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，將核苷酸用鎖定核酸(LNA)取代。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸靶定與SIRTl有關(guān)的編碼和/或非編碼序列以及如SEQ ID NO :1-5所述的序列有義和/或反義的核酸分子的一個(gè)或多個(gè)區(qū)。也將寡核苷酸靶定到SEQ ID NO 1-5的重疊區(qū)。本發(fā)明的某些優(yōu)選的寡核苷酸為嵌合寡核苷酸?！扒逗瞎押塑账帷被颉扒逗象w”，在本發(fā)明的背景中，為包含兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)上不同區(qū)的寡核苷酸，每個(gè)區(qū)由至少一個(gè)核苷酸組成。這些寡核苷酸典型地包含賦予一種或多種有益特性(例如，對(duì)核酸酶的抗性增強(qiáng)、 攝入細(xì)胞增強(qiáng)、對(duì)靶標(biāo)增強(qiáng)的結(jié)合親和力)的修飾核苷酸的至少一個(gè)區(qū)，以及作為能夠切割RNA:DNA或RNA:RNA雜合體的酶底物的區(qū)。作為實(shí)例，核糖核酸酶H為細(xì)胞核酸內(nèi)切酶， 其切割RNA:DNA雙鏈體的RNA鏈。核糖核酸酶H的活化因此導(dǎo)致RNA靶標(biāo)的切割，從而大大地增強(qiáng)基因表達(dá)的反義調(diào)節(jié)效率。因此，當(dāng)使用嵌合寡核苷酸時(shí)，與雜交到相同靶區(qū)的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，常?？捎幂^短的寡核苷酸獲得相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。RNA靶標(biāo)的切割可通過(guò)凝膠電泳和必要時(shí)本領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)，常規(guī)地檢測(cè)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合寡核苷酸包含修飾成增加靶結(jié)合親和力的至少一個(gè)區(qū)，并且通常包含充當(dāng)核糖核酸酶H的底物的區(qū)。寡核苷酸對(duì)其靶標(biāo)(在此情況下，編碼ras的核酸)的親和力通過(guò)測(cè)定寡核苷酸/靶標(biāo)對(duì)的Tm來(lái)常規(guī)地確定，Tffl為寡核苷酸與靶標(biāo)解離的溫度；解離以分光光度法檢測(cè)。Tm越高，寡核苷酸對(duì)靶標(biāo)的親和力越大。本發(fā)明的嵌合反義化合物可作為如上所述的兩個(gè)或更多個(gè)寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)而形成。本領(lǐng)域亦已將這類化合物稱為雜合體或gapmer。教導(dǎo)制備這類雜合結(jié)構(gòu)的代表性美國(guó)專利包括但不限于，美國(guó)專利第 5，013，830,5, 149，797,5, 220，007,5, 256，775,5, 366，878,5, 403，711,5, 491，133、 5，565，350,5, 623，065,5, 652，355,5, 652，356、和 5，700，922 號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的寡核苷酸區(qū)包含在糖的2’位置上修飾的至少一個(gè)核苷酸，最優(yōu)選2’ -0烷基、2’ -0-烷基-0-烷基或2’ -氟修飾的核苷酸。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA修飾包括在RNA 3’末端的嘧啶、脫堿基殘基或反向堿基的核糖上的 2’ -氟、2’ -氨基和2’ 0-甲基修飾。將這類修飾常規(guī)地?fù)饺氲焦押塑账嶂?，已顯示這些寡核苷酸具有比2’ -脫氧寡核苷酸對(duì)給定靶標(biāo)更高的Tm (即，更高的靶結(jié)合親和力)。這種增加的親和力的作用為大大地增強(qiáng)基因表達(dá)的RNAi寡核苷酸抑制。核糖核酸酶H為切割 RNAiDNA雙鏈體的RNA鏈的細(xì)胞核酸內(nèi)切酶；此酶的活化因此導(dǎo)致RNA靶標(biāo)的切割，且因此可大大地增強(qiáng)RNAi抑制效率。RNA靶標(biāo)的切割可通過(guò)凝膠電泳來(lái)常規(guī)地證實(shí)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，也修飾嵌合寡核苷酸以增強(qiáng)核酸酶抗性。細(xì)胞包含可降解核酸的各種核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。已顯示許多核苷酸和核苷修飾使摻入有它們的寡核苷酸比天然寡脫氧核苷酸對(duì)核酸酶消化更有抗性。核酸酶抗性通過(guò)將寡核苷酸與細(xì)胞提取物或分離的核酸酶溶液一起孵育并測(cè)定隨時(shí)間推移剩余的完好寡核苷酸的程度(通常地通過(guò)凝膠電泳) 來(lái)常規(guī)地測(cè)定。已修飾成增強(qiáng)其核酸酶抗性的寡核苷酸比未修飾寡核苷酸保持完好持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間。已證實(shí)多種寡核苷酸修飾增強(qiáng)或賦予核酸酶抗性。包含至少一個(gè)硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸為目前更優(yōu)選的。在一些情況下，增強(qiáng)靶結(jié)合 親和力的寡核苷酸修飾也能夠獨(dú)立地增強(qiáng)核酸酶抗性。一些所需的修飾可在De Mesmaeker等人，(1995)Acc. Chem. Res.， 28 366-374 中找到。預(yù)想用于本發(fā)明的一些優(yōu)選寡核苷酸的具體實(shí)例包括包含經(jīng)修飾的骨架的那些， 所述經(jīng)修飾的骨架為例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵或者短鏈雜原子或雜環(huán)的糖間鍵。最優(yōu)選的為帶有硫代磷酸酯骨架和帶有雜原子骨架的寡核苷酸，特別地CH2—NH—0—CH2、CH, —N(CH3)—0—CH2 [稱為亞甲基(甲亞氨基)或 MMI 骨架]、CH2--0—N (CH3) —CH2、CH2-N (CH3) —N (CH3) —CH2 和 0—N (CH3) —CH2—CH2 骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示為0—P—0-CH。由De Mesmaeker等人，(1995) Acc. Chem. Res. 28 366-374公開的酰胺骨架也為優(yōu)選的。同樣優(yōu)選的為具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(Summerton和Weller，美國(guó)專利第5，034,506號(hào))。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，將寡核苷酸的例如肽核酸(PNA)骨架、磷酸二酯骨架替換為聚酰胺骨架，核苷酸直接或間接地與聚酰胺骨架的氮雜氮原子結(jié)合(Nielsen等人，(1991) Science 254，1497)。寡核苷酸也可包含一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一種0H、SH、 SCH3、F、0CN、0CH3 0CH3.0CH3 0(CH2)η CH3、0(CH2)n NH2 或 0(CH2)n CH3，其中 η 為 1-約 10 ；Cl-ClO低級(jí)烷基、烷氧基烷氧基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基或芳烷基；Cl ；Br ；CN ；CF3 ； 0CF3 ；0—、S—、或 N-烷基；0—、S—、或 N-烯基；S0CH3 ；S02 CH3 ；0Ν02 ；Ν02 ；Ν3 ；ΝΗ2 ；雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基團(tuán)；報(bào)道基團(tuán)；嵌入劑；改進(jìn)寡核苷酸藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)；或改進(jìn)寡核苷酸藥效特性的基團(tuán)以及具有類似特性的其他取代基。優(yōu)選的修飾包括2’ -甲氧乙氧基[2' -0-CH2 CH2 0CH3，也稱為 2' -0-(2-甲氧乙基)](Martin 等人，(1995)Helv. Chim. Acta，78，486)。其他優(yōu)選的修飾包括 2’ -甲氧基(2' -0—CH3)、2’ -丙氧基(2' -0CH2 CH2CH3)和 2’ -氟(2‘ -F)。類似的修飾也可在寡核苷酸的其他位置上進(jìn)行，具體地在3’末端核苷酸上糖的3’位置和 5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可具有糖模擬物例如取代戊呋喃糖基基團(tuán)的環(huán)丁基。寡核苷酸也可另外或備選地包含核堿基(本領(lǐng)域常常簡(jiǎn)稱為“堿基”)修飾或取代。本文所用的“未修飾的”或“天然的”核苷酸包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、 胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括在天然核酸中僅稀少或短暫地存在的核苷酸， 例如，次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、特別地5-甲基胞嘧啶(也稱為5-甲基-2’脫氧胞嘧啶且常常在本領(lǐng)域中稱為5-Me-C)、5_羥甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龍膽二糖基 HMC，以及合成核苷酸，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、 2_(氨烷基氨基)腺嘌呤或其他雜取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N6 (6-氨己基)腺嘌呤和 2,6-^MSpIηφ (Romberg, Α. ，DNA Replication, W. H. Freeman & Co. ， San Francisco, 1980，第 75-77 頁(yè)；Gebeyehu, G.，(1987)等人，Nucl. Acids Res. 15 4513)?？砂ū绢I(lǐng)域已知的“通用的”堿基，例如，肌苷。已顯示5-Me-C取代增強(qiáng)核酸雙鏈體的穩(wěn)定性達(dá) 0. 6-1. 2°C (Sanghvi, Y. S. , in Crooke, S. Τ.禾口 Lebleu,B.,編輯,Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton，1993，276-278 頁(yè))且為目前優(yōu)選的堿基取代。本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及以化學(xué)方法使一種或多種增強(qiáng)寡核苷酸的活性或細(xì)胞攝取的部分或綴合物與寡核苷酸連接。這類部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分、膽甾醇基部分(Letsinger等人，(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,6553)、膽酸(Manoharan 等人，(1994) Bioorg. Med. Chem. Let. 4，1053)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan 等人，(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660，306 ；Manoharan 等人，(1993) Bioorg. Med. Chem. Let. 3,2765)、巰基膽固醇(Oberhauser 等人，(1992) Nucl. Acids Res. 20，533)、脂族鏈例如十二烷二醇或^^一烷基殘基(Saison-Behmoaras 等人，EMBO J. 1991,10,111 ；Kabanov 等人，(1990)FEBS Lett. 259,327 ；Svinarchuk 等人，(1993) Biochimie 75，49)、磷脂例如二-十六烷基-消旋-甘油或1，2-二-0-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙銨(Manoharan 等人，(1995)Tetrahedron Lett. 36， 3651 ;Shea 等人，(1990)Nucl. Acids Res. 18，3777)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan 等人， (1995)Nucleosides & Nucleotides，14，969)、或金剛燒乙酸(Manoharan 等人，(1995) Tetrahedron Lett. 36，3651)。包含親脂性部分的寡核苷酸以及用于制備這類寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域已知的，例如美國(guó)專利第5，138，045,5, 218，105和5，459，255號(hào)。無(wú)需將給定寡核苷酸中的所有位置一致地修飾，且實(shí)際上多于一種上述修飾可摻入到單個(gè)寡核苷酸中或甚至在寡核苷酸內(nèi)的單個(gè)核苷酸內(nèi)部。本發(fā)明也包括作為如上文中定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子與另一個(gè)部分綴合，所述部分包括但不限于脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或聚碳?xì)浠衔?。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可將這些分子在糖、堿基或磷酸基的數(shù)個(gè)位置上連接到包含一個(gè)或多個(gè)任何核苷酸的核酸分子。依照本發(fā)明使用的寡核苷酸可通過(guò)眾所周知的固相合成技術(shù)來(lái)便利和常規(guī)地制備。用于這類合成的設(shè)備由包括Applied Biosystems在內(nèi)的數(shù)個(gè)供應(yīng)商銷售。也可使用用于這類合成的任何其他方法；寡核苷酸的實(shí)際合成完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的才能之內(nèi)為。亦眾所周知的是使用類似技術(shù)來(lái)制備其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。還眾所周知的是使用類似技術(shù)和市購(gòu)經(jīng)修飾的亞酰胺(amidites)和可控孔度玻璃(CPG)產(chǎn)品，例如生物素、熒光黃、吖唳、或補(bǔ)骨脂素修飾的亞酰胺和/或CPG(可從Glen Research, Sterling VA購(gòu)買)，以合成熒光標(biāo)記的、生物素化的或其他修飾的寡核苷酸，例如膽固醇修飾的寡核苷酸。依照本發(fā)明，使用修飾(例如使用LNA單體)以增加寡核苷酸的效價(jià)、特異性和作用持續(xù)時(shí)間并拓寬施用途徑，包括諸如MOE、ANA、FANA、PS等當(dāng)前的化學(xué)法(參考在反義寡核苷酸的醫(yī)用化學(xué)中的近期進(jìn)展，Uhlman，(2000)Current Opinions in Drug Discovery & Development第3卷第2期)。這可通過(guò)用LNA單體取代當(dāng)前寡核苷酸中的一些單體來(lái)完成。LNA修飾的寡核苷酸可具有類似于母體化合物的大小或可更大或優(yōu)選更小。優(yōu)選這類LNA修飾寡核苷酸包含少于約70%、更優(yōu)選少于約60%、最優(yōu)選少于約50%的LNA單體且其大小在約5-25個(gè)核苷酸之間，更優(yōu)選在約12-20個(gè)核苷酸之間。優(yōu)選的修飾寡核苷酸骨架包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包括3’烯基膦酸酯和手性膦酸酯、次磷酸酯、氨基磷酸酯包括3’ -氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯，以及具有正常3’ -5’鍵的硼烷磷酸酯 (boranophosphates)、這些的2’ -5’連接類似物，以及具有反極性的那些，其中核苷酸單元的相鄰對(duì)3’ -5’與5’ -3’或2’ -5’與5’ -2’連接。也包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。教導(dǎo)制備上述含磷鍵的代表性的美國(guó)專利包括但不限于，美國(guó)專利第3，687，808、 4，469，863,4，476，301,5，023，243,5，177，196,5，188，897,5，264，423,5，276，019, 5，278，302,5,286，717,5,321，131,5, 399，676,5, 405，939,5, 453，496,5, 455，233、 5，466，677,5, 476，925,5, 519，126,5, 536，821,5, 541，306,5, 550，111,5, 563，253、 5，571，799,5, 587，361和5，625，050號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。優(yōu)選的修飾寡核苷酸骨架(其中不包含磷原子)，具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成的骨架。這些包括具有嗎啉代鍵的骨架(部分由核苷酸的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；亞甲基formacetyl和 thioformacetyl骨架；含烯骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基胼基骨架；磺酸酯或氨磺酰骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、0、S和CH2組合部分的其他骨架。教導(dǎo)制備上述寡聚核苷的代表性的美國(guó)專利包括但不限于，美國(guó)專利第 5，034，506,5，166，315,5，185，444,5，214，134,5，216，141,5，235，033,5，264，562, 5，264，564,5，405，938,5，434，257,5，466，677,5，470，967,5，489，677,5，541，307, 5，561，225,5，596，086,5，602，240,5，610，289,5，602，240,5，608，046,5，610，289, 5，618，704,5, 623，070,5, 663，312,5, 633，360,5, 677，437 和 5，677，439 號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。在其他優(yōu)選的寡核苷酸模擬物中，將核苷酸單元的糖和核苷間鍵(即主鏈)，均用新基團(tuán)置換。維持堿基單元用于與適當(dāng)?shù)暮怂岚谢衔镫s交。一種已顯示具有優(yōu)秀的雜交特性的寡核苷酸模擬物的這類寡聚化合物，稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架替換為含酰胺的骨架，具體地氨乙基氨基乙酸骨架。將所述核苷酸保留并直接或間接地與骨架的酰胺部分的氮雜氮原子結(jié)合。教導(dǎo)制備PNA化合物的代表性的美國(guó)專利包括但不限于，美國(guó)專利第5，539，082,5, 714，331和5，719，262號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。PNA化合物的進(jìn)一步教導(dǎo)可在ο Nielsen等人，Science，1991，254，1497-1500中找到。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，帶有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和帶有雜原子骨架的寡聚核苷，具體地-CH2-NH-0-CH2-，-CH2-N(CH3) -0-CH2-(稱為亞甲基(甲亞氨基)或 MMI 骨架)，-CH2-0-N (CH3) -CH2-、_CH2N (CH3) -N (CH3) CH2-和-0-N (CH3) -CH2-CH2-， 其中天然磷酸二酯骨架表示為上文引用的美國(guó)專利第5，489，677號(hào)的-0-P-0-CH2-，以及上文引用的美國(guó)專利第5，602，240號(hào)的酰胺骨架。同樣優(yōu)選的為具有上文引用的美國(guó)專利第5，034，506號(hào)的嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。修飾寡核苷酸也可包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)取代的糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一種0H ；F ；0-、S-、或N-烷基；0-、S-、或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或0烷基-0-烷基，其中可取代或不取代烷基、烯基和炔基的C為CO烷基或C2為CO烯基和炔基。 特別優(yōu)選的為 0 (CH2) η 0mCH3、0(CH2)n、0CH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、0 (CH2) n0NH2、和 0(CH2n0N(CH2)nCH3)2，其中η和m可為1-約10。其他優(yōu)選的寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一種C到CO、低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或0-芳烷基、SH、 SCH3、0CN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02CH3、0N02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)燒芳基、 氨烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團(tuán)、報(bào)道基團(tuán)、嵌入劑、用于改進(jìn)寡核苷酸藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)、或用于改進(jìn)寡核苷酸藥效特性的基團(tuán)，以及具有類似特性的其他取代基。優(yōu)選的修飾包括2’ -甲氧乙氧基(2' -0-CH2CH20CH3，也稱為2’ ~0~(2~甲氧乙基)或 2' -Μ0Ε) (Martin 等人，(1995)Helv. Chim. Acta，78，486-504)，SP，烷氧基烷氧基基團(tuán)。進(jìn)一步優(yōu)選的修飾包括2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即0(CH2)20N(CH3)2基團(tuán)，也稱為2' _DMA0E(如下文實(shí)施例中所述)，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域也稱為 2，-0- 二甲基氨基乙氧基乙基或 2' -DMAE0E)，即 2' -0-CH2-0-CH2-N(CH2) 2。其他優(yōu)選的修飾包括2’ -甲氧基(2 ‘ -0 CH3)、2’ -氨基丙氧基 (2' -0CH2CH2CH2NH2)和2’ -氟(2' -F)。類似的修飾也可在寡核苷酸的其他位置上進(jìn)行，具體地在3’末端核苷酸上或2’ -5’連接的寡核苷酸中糖的3’位置以及5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可具有糖模擬物例如取代戊呋喃糖基糖的環(huán)丁基部分。教導(dǎo)制備這類經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)的代表性的美國(guó)專利包括但不限于，美國(guó)專利第4，981，957,5, 118，800、 5，319，080,5，359，044,5，393，878,5，446，137,5，466，786,5，514，785,5，519，134, 5，567，811、5，576，427、5，591，722、5，597，909、5，610，300、5，627，053、5，639，873、 5，646，265,5, 658，873,5, 670，633和5，700，920號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。寡核苷酸也可包含核堿基(本領(lǐng)域常常簡(jiǎn)稱為“堿基”)修飾或取代。本文所用的“未修飾的”或“天然的”核苷酸包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括其他合成和天然核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、 2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-巰基、 8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代具體地5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤(methylquanine)和7_甲基腺嘌呤、8_氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤以及3-脫氮雜鳥嘌呤和 3_脫氮雜腺嘌呤。此外，核苷酸包括公開于以下文獻(xiàn)中的核苷酸美國(guó)專利第3，687，808號(hào)、“高分子禾斗學(xué)禾口工禾呈的簡(jiǎn)明百禾斗全書(The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering) ”，858-859 頁(yè)，Kroschwitz，J. I.，編輯，John Wiley & Sons, 1990、Englisch 等人，'Angewandle Chemie, International Edition ' , 1991, 30,613 頁(yè)、禾口 Sanghvi, Y. S.，第 15 章，“反義研究和應(yīng)用(Antisense Research and Applications) ”，289-302 頁(yè)， Crooke, S. Τ.和Lebleu，B. ea.，CRC Press，1993。這些核苷酸中的某些對(duì)于增加本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力特別地有用。這些包括5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6 和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已顯示 5-甲基胞嘧啶取代增加核酸雙鏈體的穩(wěn)定性達(dá)0. 6-1. 2V (Sanghvi,Y. S.，Crooke，S. Τ.和 Lebleu，B.，編輯，“反義研究和應(yīng)用”，CRC Press, Boca Raton，1993，276-278 頁(yè))且為目前優(yōu)選的堿基取代，更特別地當(dāng)與2’ -0甲氧基乙基糖修飾組合時(shí)。教導(dǎo)制備上述修飾核苷酸以及其他修飾核苷酸的代表性的美國(guó)專利包括但不限于，美國(guó)專利第 3，687，808、以及 4，845，205,5, 130，302,5, 134，066,5, 175，273、 5，367，066、5，432，272、5，457，187、5，459，255、5，484，908、5，502，177、5，525，711、 5，552，540,5, 587，469,5, 596，091,5, 614，617,5, 750，692 和 5，681，941 號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用
結(jié)合于本文中。本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及使所述寡核苷酸與一種或多種部分或綴合物化學(xué)連接，該部分或綴合物增強(qiáng)所述寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取。這類部分包括但不限于，脂質(zhì)部分(例如膽固醇部分)(Letsinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1989，86，6553-6556)、膽酸(Manoharan 等人，(1994) Bioorg. Med. Chem. Let.，4，1053-1060)、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)(Manoharan 等人，(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. ,660,306-309 ；Manoharan 等人，(1993)Bioorg. Med. Chem. Let. ,3, 2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser 等人，(1992)Nucl. Acids Res.，20，533-538)、脂族鏈(例如，十二烷二醇或4^一烷基殘基)(Kabanov 等人，(1990) FEBS Lett.，259,327-330 ； Svinarchuk 等人，(1993)Biochimie 75，49_54)、磷脂(例如，二-十六烷基-消旋-甘油或1，2_ 二-0-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙銨)(Manoharan等人，(1995) Tetrahedron Lett.，36，3651-3654 ;Shea 等人，(1990) Nucl. Acids Res.，18，3777-3783)、 聚胺或聚乙二醇鏈(Mancharan 等人，(1995)Nucleosides & Nucleotides, 14，969-973)、 或金剛燒乙酸(Manoharan 等人，(1995) Tetrahedron Lett.，36，3651-3654)、棕櫚基部分 (Mishra 等人，(1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264，229-237)、或十八胺或己基氨基-羰基-t 羥膽固醇部分(Crooke 等人，(1996) J. Pharmacol. Exp. Ther.，277，923-937)。教導(dǎo)制備這類寡核苷酸綴合物的代表性的美國(guó)專利包括但不限于，美國(guó)專利
第 4，828，979、4，948，882、5，218， 105、5，525，465、5，541，313,5，545，730、5:,552，538、5，578，717,5,580，731,5,580，731,5,591，584,5，109，124,5,118，802,5，138，045、5，414，077,5，486，603,5，512，439,5，578，718,5，608，046,4，587，044,4,605，735、4，667，025,4，762，779,4，789，737,4，824，941,4，835，263,4，876，335,4，904，582、4，958，013、5，082，830、5，112，963、5，214，136,5,082，830、5，112，963、5，214，136、5，245，022、5，254，469、5，258，506、5，262，536,5,272，250、5，292，873、5，317，098、5，371，241、5，391，723、5，416，203、5，451，463,5，510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552、5，567，810、5，574，142、5，585，481,5，587，371、5，595，726、5，597，696、
5，599，923,5, 599，928和5，688，941號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。藥物開發(fā)本發(fā)明的化合物也可應(yīng)用于藥物開發(fā)和靶標(biāo)驗(yàn)證的領(lǐng)域。本發(fā)明包括本文所鑒定的化合物和優(yōu)選的靶區(qū)段在闡明存在于沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸和疾病狀態(tài)、表型或病況之間的關(guān)系的藥物開發(fā)努力中的應(yīng)用。這些方法包括檢測(cè)或調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸，包括使本發(fā)明的化合物與樣品、組織、細(xì)胞或生物體接觸，在處理后的某個(gè)時(shí)間測(cè)定沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相關(guān)的表型或化學(xué)終末點(diǎn)，以及任選將該測(cè)定值與未處理樣品或與用本發(fā)明的另一種化合物處理的樣品比較。這些方法也可與其他試驗(yàn)平行或組合進(jìn)行以確定未知基因的功能用于靶標(biāo)驗(yàn)證過(guò)程，或確定特定基因產(chǎn)物作為用于治療或預(yù)防特定疾病、病況或表型的靶標(biāo)的有效性。評(píng)價(jià)基因表達(dá)的增量調(diào)節(jié)或抑制外源核酸到宿主細(xì)胞或生物體中的轉(zhuǎn)移可通過(guò)直接檢測(cè)細(xì)胞或生物體中核酸的存在情況來(lái)評(píng)價(jià)。這類檢測(cè)可通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的數(shù)種方法來(lái)完成。例如，外源核酸的存在情況可通過(guò)DNA印跡或通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)使用以下引物來(lái)檢測(cè)，該引物特異地?cái)U(kuò)增與所述核酸相關(guān)的核苷酸序列。外源核酸的表達(dá)也可使用包括基因表達(dá)分析在內(nèi)的常規(guī)方法來(lái)測(cè)定。例如，由外源核酸產(chǎn)生的mRNA可使用RNA印跡和反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 來(lái)檢測(cè)和定量。來(lái)自外源核酸的RNA表達(dá)也可通過(guò)測(cè)定酶活性或報(bào)道蛋白活性來(lái)檢測(cè)。例如，反義調(diào)節(jié)活性可根據(jù)靶核酸表達(dá)的減少或增加間接地測(cè)定，靶核酸表達(dá)作為外源核酸正在產(chǎn)生效應(yīng)物RNA的指示。基于序列保守性，可設(shè)計(jì)和使用引物來(lái)擴(kuò)增靶基因的編碼區(qū)。最初， 可使用來(lái)自每個(gè)基因的最高表達(dá)的編碼區(qū)來(lái)建立模型對(duì)照基因，但任何編碼或非編碼區(qū)均可使用。每個(gè)對(duì)照基因通過(guò)將每個(gè)編碼區(qū)插入報(bào)道基因編碼區(qū)和其聚腺苷酸信號(hào)之間來(lái)裝配。這些質(zhì)粒可產(chǎn)生在基因的上游部分具有報(bào)道基因以及在3’非編碼區(qū)中具有潛在RNAi 靶標(biāo)的mRNA。單個(gè)反義寡核苷酸的有效性可通過(guò)調(diào)節(jié)報(bào)道基因來(lái)測(cè)定?？捎糜诒景l(fā)明的方法中的報(bào)道基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、堿性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β 葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、 黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、螢光素酶(Luc)、胭脂堿合酶(NOS)、章魚堿合酶(OCS)，以及其衍生物。多重選擇標(biāo)記為可利用的，其賦予對(duì)氨芐青霉素、博來(lái)霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦 (phosphinothricin)、嘌呤霉素和四環(huán)素的抗性。確定報(bào)道基因調(diào)節(jié)的方法為本領(lǐng)域眾所周知的，包括但不限于，熒光法(例如熒光光譜法、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、熒光顯微法)、抗生素抗性測(cè)定。試劑盒、研究試劑、診斷和治療本發(fā)明的化合物可用于診斷、治療和預(yù)防，并作為研究試劑和試劑盒的組分。此外，能夠靈敏特異地抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸，常常被普通技術(shù)人員用于闡明特定基因的功能或區(qū)分生物途徑的各個(gè)成員之間的功能。
對(duì)于用于試劑盒和診斷和各種生物系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物(單獨(dú)的或與其他化合物或治療劑組合)可用作在差異和/或組合分析中的工具，以闡明在細(xì)胞和組織內(nèi)表達(dá)的基因的一部分或全部互補(bǔ)序列的表達(dá)模式。本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物系統(tǒng)”或“系統(tǒng)”定義為表達(dá)或使得能夠表達(dá)沉默調(diào)節(jié)蛋白 I(SIRTl)基因產(chǎn)物的任何生物體、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織。這些包括但不限于人、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、異種移植物、移植物及其組合。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，將在用一種或多種反義化合物處理的細(xì)胞或組織內(nèi)的表達(dá)模式與未用反義化合物處理的對(duì)照細(xì)胞或組織相比較，并針對(duì)基因表達(dá)的差異水平分析產(chǎn)生的模式，因?yàn)樗鼈冇嘘P(guān)于，例如，所檢測(cè)基因的疾病相關(guān)、信號(hào)傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞定位、表達(dá)水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能。這些分析可對(duì)受刺激或未受刺激的細(xì)胞以及在影響表達(dá)模式的其他化合物存在或不存在時(shí)進(jìn)行。本領(lǐng)域已知的基因表達(dá)分析方法的實(shí)例包括DNA陣列或微陣列(Brazma和Vilo， (2000) FEBS Lett.，480，17-24 ;Celis 等人，(2000) FEBS Lett.，480，2-16)、SAGE (基因表達(dá)的系列分析)(Madden 等人，(2000) Drug Discov. Today，5，415-425)、READS (已消化 cDNA 的限制酶擴(kuò)增)(Prashar 和 Weissman，(1999)Methods Enzymo 1.，303，258-72)、 T0GA(總基因表達(dá)分析)(Sutcliffe 等人，(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,97, 1976-81)、蛋白質(zhì)陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)(Celis 等人，(2000)FEBS Lett.，480，2-16 Jungblut 等人，Electrophoresis，1999，20，2100-10)、已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)測(cè)序(Celis 等人， FEBS Lett.，2000，480，2-16 ;Larsson 等人，J. Biotechnol.，2000，80，143-57)、消減 (subtractive)RNA 指紋法(SuRF) (Fuchs 等人，(2000)Anal. Biochem. 286，91-98 ；Larson 等人，(2000) Cytometry 41，203-208)、消減克隆、差異顯示(DD) (Jurecic 和 Belmont， (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3，316-21)、比較基因組雜交(Carulli 等人，(1998) J. Cell Biochem. Suppl.，31，286-96)、FISH(熒光原位雜交)技術(shù)(Going 和 Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35,1895-904)和質(zhì)譜分析法(To, Comb. (2000) Chem. High Throughput Screen,3,235-41)。本發(fā)明的化合物對(duì)于研究和診斷而言為有用的，因?yàn)檫@些化合物與編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的核酸雜交。例如，為了成為有效的沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)調(diào)節(jié)劑而以本文公開的這類效率和這類條件下雜交的寡核苷酸，在有利于基因擴(kuò)增或檢測(cè)的條件下分別為有效的引物或探針。這些引物和探針可用于需要對(duì)編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的核酸分子特異檢測(cè)的方法中，和可用于在擴(kuò)增所述核酸分子用于檢測(cè)或用于沉默調(diào)節(jié)蛋白 I(SIRTl)的進(jìn)一步研究中。本發(fā)明的反義寡核苷酸(具體地，引物和探針)與編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的核酸的雜交，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)檢測(cè)。這類方法可包括使酶與所述寡核苷酸綴合、放射性標(biāo)記所述寡核苷酸或任何其他適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法。也可制備使用這類檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)樣品中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)水平的試劑盒。反義物的特異性和敏感性也由本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握用于治療用途。已將反義化合物在動(dòng)物(包括人)的疾病狀態(tài)的治療中用作治療部分。反義寡核苷酸藥物已安全和有效地施用給人且許多臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行。因此確立的是，反義化合物可為有用的治療形式，可將其經(jīng)配置以在用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物、尤其是人的治療方案中有用。對(duì)于治療而言，將懷疑具有可通過(guò)調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的表達(dá)來(lái)治療的疾病或病癥的動(dòng)物(優(yōu)選人)，通過(guò)施用依照本發(fā)明的反義化合物來(lái)治療。例如， 在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，所述方法包括給需要治療的動(dòng)物施用治療上有效量的沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)調(diào)節(jié)劑的步驟。本發(fā)明的沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)調(diào)節(jié)劑有效地調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)蛋白的活性或調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)蛋白的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的活性或表達(dá)與對(duì)照相比抑制了約10%。優(yōu)選地，將動(dòng)物中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的活性或表達(dá)抑制約30%。更優(yōu)選地，將動(dòng)物中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的活性或表達(dá)抑制約50%或更多。因此，與對(duì)照相比，寡聚化合物將沉默調(diào)節(jié)蛋白1 (SIRTl)mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少 98%、至少 99%、或 100%。在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照相比，在動(dòng)物中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的活性或表達(dá)增加約10%。優(yōu)選地，在動(dòng)物中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的活性或表達(dá)增加約30%。更優(yōu)選地，在動(dòng)物中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的活性或表達(dá)增加50%或更多。因此，與對(duì)照比較， 寡聚化合物使沉默調(diào)節(jié)蛋白l(SIRTl)mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)至少10%、至少50%、至少25%、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少 90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。例如，沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)表達(dá)的下降可在血清、血液、脂肪組織、肝臟或動(dòng)物的任何其他體液、組織或器官中測(cè)定。優(yōu)選地，包含于待分析的所述液體、組織或器官之內(nèi)的細(xì)胞包含編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)肽的核酸分子和/或沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)蛋白本身。本發(fā)明的化合物可通過(guò)向合適的藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體中添加有效量的化合物來(lái)用于藥物組合物。本發(fā)明的化合物和方法的應(yīng)用也可為預(yù)防上有用的。綴合物本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及以化學(xué)方法將一種或多種增強(qiáng)寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取的部分或綴合物與寡核苷酸連接。這些部分或綴合物可包含與官能團(tuán)(例如伯或仲醇羥基基團(tuán))共價(jià)結(jié)合的綴合基團(tuán)。本發(fā)明的綴合基團(tuán)包括嵌入劑、報(bào)道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強(qiáng)寡聚體藥效特性的基團(tuán)，以及增強(qiáng)寡聚體藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)。典型的綴合基團(tuán)包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光黃、羅丹明、香豆素和染料。增強(qiáng)藥效特性的基團(tuán)，在本發(fā)明的背景中，包括改善攝取、增強(qiáng)對(duì)降解的抗性、和/或加強(qiáng)與靶核酸的序列特異性雜交的基團(tuán)。增強(qiáng)藥代動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)，在本發(fā)明的背景中，包括改善本發(fā)明的化合物的攝取、分布、代謝或分泌的基團(tuán)。代表性的綴合基團(tuán)在提交于1992年10月23日的國(guó)際專利申請(qǐng)第PCT/US92/09196 號(hào)和美國(guó)專利第6，287，860號(hào)中公開，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。綴合部分包括但不限于，脂質(zhì)部分(例如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂族鏈(例如，十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如，二 _十六烷基_消旋_甘油或1，2- 二 -0-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙銨)、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇部分。也可將本發(fā)明的寡核苷酸與活性藥物物質(zhì)綴合，例如，阿司匹林、華法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、 (S)-(+)普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2，3，5_三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜草、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺類藥物、抗糖尿病藥、抗菌劑或抗生素。 教導(dǎo)制備這類寡核苷酸綴合物的代表性的美國(guó)專利包括但不限于，美國(guó)專利
第4，828，979,4,948，882,5,218，105、5，525，465、5，541，313、5，545，730.、5:,552,,538、5，578，717,5,580，731,5,580，731,5,591，584、5:’ 109，124、5，118，802、5，138，045、5，414，077,5,486，603,5，512，439,5，578，718、5:’ 608，046、4，587，044、4，605，735、4，667，025,4，762，779,4，789，737,4，824，94U4;,835，263、4，876，335、4，904，582、4，958，013,5,082，830,5，112，963,5，214，136,5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，245，022,5，254，469,5，258，506,5，262，536,5:’ 272，250、5，292，873、5，317，098、5，371，241,5,391，723,5,416，203,5，451，463,5:’ 510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552,5，567，810,5,574，142,5,585，48U5;,587，371、5，595，726、5，597，696、
5，599，923,5, 599，928 和 5，688，941 號(hào)。制劑本發(fā)明的化合物也可與其他分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、封裝、綴合或其他方式締合，作為例如，脂質(zhì)體、受體靶向分子、口服的、直腸的、局部的或其他制劑， 用于有助于攝取、分布和/或吸收。教導(dǎo)制備這類攝取、分布和/或吸收輔助制劑的代表性的美國(guó)專利包括但不限于，美國(guó)專利第5，108，921,5, 354，844,5, 416，016,5, 459，127、
5，521，291、5，543，165、5，547，932、5，583，020、5，591，721,4,426，330,4，534，899、5，013，556、5，108，921、5，213，804、5，227，170、5，264，221,5,356，633,5，395，619、5，416，016、5，417，978、5，462，854、5，469，854、5，512，295,5,527，528,5,534，259、
5，543，152,5, 556，948,5, 580，575和5，595，756號(hào)，每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合于本文中。盡管，反義寡核苷酸不需要在有載體的背景中施用以便調(diào)節(jié)靶表達(dá)和/或功能， 但是本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于反義寡核苷酸表達(dá)的表達(dá)載體構(gòu)建體，包括啟動(dòng)子、雜合啟動(dòng)子基因序列并且擁有強(qiáng)組成型啟動(dòng)子活性，或可在所需情況下誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明實(shí)施涉及用適合的核酸遞送系統(tǒng)施用至少一種前述反義寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包含與所述多核苷酸可操作連接的非病毒載體。這類非病毒載體的實(shí)例包括單獨(dú)的寡核苷酸(例如，SEQ ID N0:6-47中的任何一個(gè)或多個(gè)) 或與適合的蛋白、多糖或脂質(zhì)制劑組合的寡核苷酸。其他適合的核酸遞送系統(tǒng)包括病毒載體，典型地來(lái)自腺病毒、腺病毒伴隨病毒 (AAV)、依賴輔助病毒的腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或仙臺(tái)病毒-脂質(zhì)體(HVJ)復(fù)合體中的至少一種的序列。優(yōu)選地，所述病毒載體包含與所述多核苷酸可操作連接的強(qiáng)真核啟動(dòng)子，例如， 巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。另外優(yōu)選的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學(xué)綴合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一種優(yōu)選的基于HIV的病毒載體包括至少兩種載體， 其中g(shù)ag基因和pol基因來(lái)自HIV基因組而env基因來(lái)自另一種病毒。DNA病毒載體為優(yōu)選的。這些載體包括痘病毒載體(例如正痘病毒或禽痘病毒載體)、皰疹病毒載體(例如單純皰疹 I 病毒(HSV)載體[Geller，A. I.等人，(1995) J. Neurochem, 64 487 ；Lim, F.等人，載于 DNA 克隆哺乳動(dòng)物系統(tǒng)(DNA Cloning =Mammalian Systems)，D. Glover，編輯，(Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995) ；Geller, A. I.等人,(1993)Proc Natl. Acad. Sci.U.S.A. 90 7603 ；Geller,Α. I.等人，(1990) Proc Natl. Acad. Sci USA :87 :1149])、腺病毒載體[LeGal LaSalle 等人，Science，259 988(1993) ；Davidson 等人，(1993) Nat. Genet. 3 219 ；Yang 等人，(1995) J. Virol. 69 2004]和腺伴隨病毒載體[Kaplitt，M. G.等人，(1994) Nat. Genet. 8 148]。本發(fā)明的反義化合物包括任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯、或這類酯的鹽、或任何其他化合物，其在施用給動(dòng)物包括人后，能夠提供(直接地或間接地)生物學(xué)活性的代謝物或其殘留物。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物的生理上和藥學(xué)上可接受的鹽即， 保留母體化合物的所需生物活性且不對(duì)其賦予非所需的毒理學(xué)作用的鹽。對(duì)于寡核苷酸而言，藥學(xué)上可接受的鹽的優(yōu)選實(shí)例和其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專利第6，287，860號(hào)中，其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。本發(fā)明也包括包含本發(fā)明的反義化合物的藥物組合物和制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以以若干方式來(lái)施用，這取決于是否需要局部或全身治療以及待治療的區(qū)域。施用可為局部的(包括眼的和至黏膜包括陰道和直腸遞送)、肺的(例如，通過(guò)吸入或吹入散劑或氣霧劑，包括通過(guò)噴霧器)、氣管內(nèi)的、鼻內(nèi)的、表皮的和經(jīng)皮的、□服的或胃腸外的。胃腸外施用包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉注射或輸注；或顱內(nèi)(例如，鞘內(nèi)或心室內(nèi)) 施用。認(rèn)為帶有至少一個(gè)2’-0_甲氧基乙基修飾的寡核苷酸對(duì)于口服施用而言為特別有用的。用于局部施用的藥物組合物和制劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和散劑。常規(guī)藥物載體、水性、粉末或油性基質(zhì)、增稠劑等可為必要的或所需的。包被的避孕套、手套等也為可使用的?？蛇m宜地以單位劑型存在的本發(fā)明藥物制劑，可根據(jù)藥學(xué)工業(yè)中眾所周知的常規(guī)技術(shù)來(lái)制備。這類技術(shù)包括使活性成分與藥物載體或賦形劑組合的步驟。一般而言，制劑如下制備通過(guò)使活性成分與液體載體或細(xì)碎的固體載體或兩者均勻和緊密地組合，隨后在需要時(shí)使產(chǎn)物成形?？蓪⒈景l(fā)明的組合物制成任何許多可能劑型，例如但不限于，片劑、膠囊劑、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。也可將本發(fā)明的組合物在水性、非水性或混合介質(zhì)中制成混懸劑。水性混懸劑可進(jìn)一步包含增加混懸劑粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。所述混懸劑也可包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于，溶液劑、乳劑、泡沫劑和含脂質(zhì)體的制劑。本發(fā)明的藥物組合物和制劑可包含一種或多種滲透促進(jìn)劑、載體、賦形劑或其他活性或非活性成分。乳劑典型地為一種液體以通常直徑超過(guò)0. 1 μ m的液滴形式分散在另一種液體中的非均質(zhì)體系。乳劑可包含除分散相之外的其他組分，以及可作為在水相、油相中的溶液或其本身作為單獨(dú)相存在的活性藥物。將微乳液包括為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。乳劑及其使用為本領(lǐng)域眾所周知的且進(jìn)一步描述于美國(guó)專利第6，287，860號(hào)中。本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”意為由排列在一個(gè)或多個(gè)球形雙層或雙層中的兩親脂質(zhì)組成的囊泡。脂質(zhì)體為具有由親脂材料形成的膜和包含待遞送組合物的水性內(nèi)部的單層或多層囊泡。陽(yáng)離子脂質(zhì)體為帶正電的脂質(zhì)體，認(rèn)為其與帶負(fù)電的DNA分子相互作用以形成穩(wěn)定的復(fù)合體。認(rèn)為PH敏感的或帶負(fù)電的脂質(zhì)體誘捕DNA而不是與其復(fù)合。陽(yáng)離子和非陽(yáng)離子脂質(zhì)體均已用來(lái)遞送DNA到細(xì)胞。脂質(zhì)體也包括“空間上穩(wěn)定的”脂質(zhì)體，該術(shù)語(yǔ)如本文所用是指包含一種或多種特化脂質(zhì)的脂質(zhì)體。當(dāng)摻入到脂質(zhì)體中時(shí)，這些特化脂質(zhì)給脂質(zhì)體帶來(lái)相對(duì)于缺乏這類特化脂質(zhì)的脂質(zhì)體增長(zhǎng)的循環(huán)生命期?？臻g上穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實(shí)例為以下脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)體形成囊泡的脂質(zhì)部分的部分包含一種或多種糖脂或衍生有一種或多種親水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)部分。脂質(zhì)體及其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專利第6，287，860號(hào)中。本發(fā)明的藥物制劑和組合物也可包含表面活性劑。表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑和乳劑中的使用為本領(lǐng)域眾所周知的。表面活性劑及其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專利第 6，287, 860號(hào)中，其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用各種滲透促進(jìn)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)核酸特別是寡核苷酸的有效遞送。除了有助于非親脂性藥物穿過(guò)細(xì)胞膜的擴(kuò)散之外，滲透促進(jìn)劑還增加親脂性藥物的滲透性。可將滲透促進(jìn)劑歸類為屬于五大類的一種，五大類即表面活性劑、脂肪酸、 膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑。滲透促進(jìn)劑及其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專利第 6，觀7，860號(hào)，其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，將根據(jù)其預(yù)期用途(即給藥途徑)來(lái)常規(guī)地設(shè)計(jì)制劑。用于局部給藥的優(yōu)選制劑包括以下制劑，其中本發(fā)明寡核苷酸與局部遞送試劑 (例如，脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、留類化合物、螯合劑和表面活性劑)混合。優(yōu)選的脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性的(例如二油?；?磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A DMPC、二硬脂?；字Ｄ憠A)、陰性的(例如二肉豆蔻?；字８视虳MPG)和陽(yáng)離子的 (例如二油?；募谆北鵇OTAP和二油?；?磷脂?；掖及稤0TMA)。對(duì)于局部或其他給藥而言，可將本發(fā)明的寡核苷酸封裝在脂質(zhì)體內(nèi)或可與其(特別是與陽(yáng)離子脂質(zhì)體)形成復(fù)合體?；蛘撸蓪⒐押塑账崤c脂質(zhì)(特別是陽(yáng)離子脂質(zhì))復(fù)合。優(yōu)選的脂肪酸和酯類、其藥學(xué)上可接受的鹽，以及它們的使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專利第 6，287，860 號(hào)中。用于口服給藥的組合物和制劑包括散劑、顆粒劑、微粒、納米粒子、在水或非水性介質(zhì)中的混懸劑或溶液劑、膠囊劑、凝膠膠囊、小藥囊、片劑或小片。增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可為所需的。優(yōu)選的口服制劑為以下制劑，其中將本發(fā)明的寡核苷酸與一種或多種滲透促進(jìn)劑、表面活性劑和螯合劑協(xié)同施用。優(yōu)選的表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽汁酸和/或其鹽。優(yōu)選的膽汁酸/鹽和脂肪酸及其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專利第6，287, 860號(hào)中，其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。還優(yōu)選的為滲透促進(jìn)劑的組合，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽的組合。特別優(yōu)選的組合為月桂酸的鈉鹽、癸酸和 UDCA。另外的滲透促進(jìn)劑包括聚氧化乙烯-9-月桂醚、聚氧化乙烯-20-鯨蠟醚。本發(fā)明的寡核苷酸可以以包括噴霧干燥顆粒的顆粒形式口服地遞送，或復(fù)合以形成微米或納米粒子。寡核苷酸絡(luò)合劑及其使用進(jìn)一步描述于美國(guó)專利第6，287, 860號(hào)中，其通過(guò)引用結(jié)合于本文中。用于胃腸外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥的組合物和制劑可包括無(wú)菌水性溶液劑，其也可含有緩沖液、稀釋劑和其他適合的添加劑，例如但不限于，滲透促進(jìn)劑、載體化合物和其他藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供藥物組合物，所述藥物組合物包含一種或多種寡聚化合物和一種或多種其他通過(guò)非反義機(jī)制來(lái)起作用的化學(xué)治療劑。這類化學(xué)治療劑的實(shí)例包括但不限于癌癥化學(xué)治療藥物，例如柔紅霉素、道諾霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、 伊達(dá)比星、依索比星、博來(lái)霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、雙氯乙基-亞硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴胼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-巰鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、噴司他丁、4-羥基過(guò)氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤 (MTX)、秋水仙堿、泰素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、拓泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES)。當(dāng)與本發(fā)明的化合物一起使用時(shí)，這類化學(xué)治療劑可單獨(dú)地(例如，5-FU和寡核苷酸)、序貫地(例如，5-FU和寡核苷酸持續(xù)一段時(shí)間，接著MTX和寡核苷酸)、或與一種或多種其他的這類化學(xué)治療劑組合(例如，5-FU、MTX 和寡核苷酸，或5-FU、放射療法和寡核苷酸)使用?？寡姿?包括但不限于非留體抗炎藥和皮質(zhì)類固醇)和抗病毒藥物(包括但不限于利巴韋林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋)也可組合到本發(fā)明的組合物中。反義化合物和其他非反義藥物的組合也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。兩種或更多種組合的化合物可一起或序貫使用。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可包含靶定到第一核酸的一種或多種反義化合物(特別是寡核苷酸)，以及靶定到第二核酸靶標(biāo)的一種或多種其他反義化合物。例如，第一靶標(biāo)可為沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的特定反義序列，第二靶標(biāo)可為來(lái)自另一個(gè)核苷酸序列的區(qū)域?；蛘?，本發(fā)明的組合物可包含靶定到相同沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)核酸靶標(biāo)的不同區(qū)域的兩種或更多種反義化合物。本文舉例說(shuō)明了許多反義化合物的實(shí)例而其他的可選自本領(lǐng)域已知的適合化合物。兩種或更多種組合化合物可一起或序貫使用。給藥認(rèn)為治療組合物的制劑和其隨后的施用(給藥)在本領(lǐng)域的技術(shù)之內(nèi)。給藥取決于要治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和應(yīng)答性，而療程從數(shù)天持續(xù)到數(shù)月，或直到完成治愈或達(dá)到疾病狀態(tài)的減輕。最佳給藥方案可根據(jù)患者體內(nèi)藥物蓄積的測(cè)定來(lái)計(jì)算。普通技術(shù)人員可容易地確定最適劑量、給藥方法和重復(fù)率。最適劑量可根據(jù)單獨(dú)寡核苷酸的相對(duì)功效而不同，一般可基于發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中有效的EC50來(lái)評(píng)價(jià)。一般而言，劑量為 0. 01 μ g-100g/kg體重，且可每天、每周、每月或每年給藥一次或多次，或甚至每2-20年一次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可基于測(cè)定體液或組織中藥物的停留時(shí)間和濃度來(lái)容易地評(píng)價(jià)給藥的重復(fù)率。成功治療之后，可能需要使患者進(jìn)行維持療法以預(yù)防疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中所述寡核苷酸以維持劑量來(lái)施用，范圍為0. 01 μ g-100g/kg體重，每天一次或多次到每20年一次。雖然上文已描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但是應(yīng)理解的是，其僅以實(shí)例的方式提供，而并非限制。對(duì)公開的實(shí)施方案的許多改變可依照本文的公開內(nèi)容來(lái)進(jìn)行，而不會(huì)背離本發(fā)明的精神或范圍。因此，本發(fā)明的廣度和范圍不應(yīng)受到任何上述的實(shí)施方案所限制。本文提及的所有文件都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本申請(qǐng)引用的所有出版物和專利文件都為于所有目的而通過(guò)引用結(jié)合，其程度如同單獨(dú)地指出各個(gè)出版物或?qū)＠募粯?。通過(guò)其在本文件中引用不同參考文獻(xiàn)，申請(qǐng)人并不承認(rèn)任何具體參考文獻(xiàn)對(duì)其發(fā)明而言為“現(xiàn)有技術(shù)”。本發(fā)明的組合物和方法的實(shí)施方案舉例說(shuō)明于下列實(shí)施例中。 實(shí)施例下列非限制性的實(shí)施例用于舉例說(shuō)明本發(fā)明的經(jīng)挑選的實(shí)施方案。應(yīng)理解的是， 所示組分要素中的比例和備選物的變化對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言為顯而易見的且在本發(fā)明的實(shí)施方案的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1 對(duì)沉默調(diào)節(jié)蛋白1 (SIRTl)多核苷酸的核酸分子反義和/或有義鏈特異的反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)如上指出的術(shù)語(yǔ)“對(duì)……特異的寡核苷酸”或“靶定……的寡核苷酸”是指具有以下序列的寡核苷酸，該序列(i)能夠與靶定基因的一部分形成穩(wěn)定的復(fù)合體，或(ii)能夠與靶定基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。適當(dāng)寡核苷酸的挑選通過(guò)使用計(jì)算機(jī)程序來(lái)促進(jìn)，該計(jì)算機(jī)程序自動(dòng)比對(duì)核酸序列并指出同一性或同源性區(qū)域。這類程序用于比較例如通過(guò)搜索諸如GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)或通過(guò)測(cè)序PCR產(chǎn)物而獲得的核酸序列。來(lái)自一系列物種的核酸序列的比較允許挑選顯示出物種之間適當(dāng)同一性程度的核酸序列。在未測(cè)序基因的情況下，進(jìn)行DNA印跡來(lái)確定在靶物種和其他物種的基因之間的同一性程度。通過(guò)在各種嚴(yán)格程度下進(jìn)行DNA印跡，如本領(lǐng)域眾所周知的，可獲得同一性的近似測(cè)量。這些程序允許挑選這樣的寡核苷酸，其在待控制的受試者中對(duì)靶核酸序列表現(xiàn)高度的互補(bǔ)性而在其他物種中對(duì)相應(yīng)核酸序列表現(xiàn)較低程度的互補(bǔ)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在挑選用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)幕騾^(qū)域上具有相當(dāng)大的自由。反義化合物為“可特異雜交的”，如果所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能，導(dǎo)致功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并且在要求特異性結(jié)合的條件下具有足夠程度的互補(bǔ)性以避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，所示條件即在體內(nèi)測(cè)定或治療處理情況中的生理?xiàng)l件下，以及其中測(cè)定在體外測(cè)定情況中進(jìn)行的條件下。本文所述的寡核苷酸的雜交特性可通過(guò)本領(lǐng)域已知的一種或多種體外測(cè)定法來(lái)確定。例如，本文所述的寡核苷酸的特性可通過(guò)使用解鏈曲線測(cè)定法確定靶天然反義物和潛在藥物分子之間的結(jié)合強(qiáng)度來(lái)獲得。靶天然反義物和潛在藥物分子(Molecule)之間的結(jié)合強(qiáng)度，可使用任何已建立的測(cè)定分子間相互作用強(qiáng)度的方法例如解鏈曲線測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)。解鏈曲線測(cè)定法確定這樣的溫度，在該溫度下天然反義物/Molecule復(fù)合體發(fā)生從雙鏈構(gòu)象到單鏈構(gòu)象的迅速轉(zhuǎn)變。此溫度為廣泛認(rèn)可的兩個(gè)分子之間相互作用強(qiáng)度的可靠測(cè)定。解鏈曲線測(cè)定法可使用實(shí)際的天然反義RNA分子的cDNA拷貝或?qū)?yīng)Molecule的結(jié)合位點(diǎn)的合成DNA或RNA核苷酸來(lái)進(jìn)行。包含進(jìn)行此測(cè)定的所有必需試劑的多重試劑盒為可得的(例如Applied Biosystems he. MeltDoctor試劑盒)。這些試劑盒包含含有雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合染料(例如ABI HRM染料、STOR Green、SYT0，等等)之一的適宜的緩沖溶液。dsDNA染料的特性為，其在游離形式幾乎不發(fā)出熒光，但當(dāng)與dsDNA結(jié)合時(shí)為高度熒光的。為進(jìn)行所述測(cè)定，將所述cDNA或相應(yīng)寡核苷酸以由具體制造商的方案限定的濃度與Molecule混合。將所述混合物加熱到95°C以解離所有預(yù)先形成的dsDNA復(fù)合體，然后緩慢冷卻到室溫或由試劑盒制造商確定的其他較低的溫度以使DNA分子退火。隨后將新形成的復(fù)合體緩慢加熱到95°C，同時(shí)連續(xù)地收集由反應(yīng)產(chǎn)生的熒光量的數(shù)據(jù)。熒光強(qiáng)度反比于反應(yīng)中存在的dsDNA量。數(shù)據(jù)可使用與所述試劑盒相配的實(shí)時(shí)PCR儀器(例如ABI’s StepOne Plus Real Time PCR System或LightTyper儀器，Roche Diagnostics,Lewes,UK) 來(lái)收集。解鏈峰通過(guò)使用適當(dāng)軟件(例如LightTyper (Roche)或SDS Dissociation Curve, ABI)對(duì)溫度(χ-軸)繪制熒光關(guān)于溫度的負(fù)導(dǎo)數(shù)(在y_軸上的_d (熒光)/dT)的圖形來(lái)構(gòu)建。分析數(shù)據(jù)以確定從dsDNA復(fù)合體迅速轉(zhuǎn)變到單鏈分子的溫度。此溫度稱為Tm 且正比于兩個(gè)分子之間的相互作用強(qiáng)度。典型地，Tm將超過(guò)40°C。實(shí)施例2 =SIRTl多核苷酸的調(diào)節(jié)材料和方法用裸露反義寡核苷酸處理!fepG2細(xì)胞使來(lái)自ATCC(目錄號(hào)HB-8065)的！fepG2細(xì)胞在37 °C和5 % CO2下生長(zhǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/EBSS(Hyclone 目錄號(hào) SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV)+10 % FBS(Mediatech 目錄號(hào) MT!35-011-CV) +青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CI))。 試驗(yàn)的前一天將所述細(xì)胞以密度0. 5XlOVml再接種到6孔板，在37°C和5% CO2下培養(yǎng)。在試驗(yàn)當(dāng)天用1.5ml/孔新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換6孔板中的培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸用水稀釋到20 μ M的濃度。將2 μ 1此溶液與400 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào) 31985-070)和 4μ 1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019)在室溫下孵育20min，然后向6孔板的每個(gè)孔加入H印G2細(xì)胞。含有用2 μ 1水代替所述寡核苷酸溶液的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-1 后，將培養(yǎng)基換成新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。添加反義寡核苷酸7 后，將所述細(xì)胞如上文所述再添加。在第二次添加反義寡核苷酸4 后，將培養(yǎng)基移出，并遵循制造商的說(shuō)明書使用Promega的SV Total RNA Isolation System(目錄號(hào) Z3105)或 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試齊[J盒 (目錄號(hào)74181)從細(xì)胞中提取RNA。如制造商的方案中所述，向使用Thermo Scientific 的Verso cDNA試劑盒(目錄號(hào)AB1453B)進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中添加600ng RNA。將來(lái)自此反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)使用ABI Taqman Gene Expression Mix(目錄號(hào)4369510)和由 ABI(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay :Hs00202021_ml, Applied Biosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計(jì)的引物/探針的實(shí)時(shí)PCR，來(lái)監(jiān)控基因表達(dá)。使用下面的 PCR 循環(huán):50°C,2min ；95°C, IOmin ；40 個(gè)循環(huán)的(95°C，15 秒；60°C，Imin)，使用 StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)。用反義寡核苷酸處理后基因表達(dá)的倍數(shù)改變基于處理和模擬轉(zhuǎn)染的樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的不同來(lái)計(jì)算。結(jié)果實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA水平在用針對(duì)SIRTl反義物 CV396200的一些反義寡核苷酸處理后4 顯著增加(圖2、3A)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA水平在針對(duì)SIRT反義物CV396200 設(shè)計(jì)的寡核苷酸之一中顯著增加。表示為CUR-1230、CUR-1231、CUR-1232和CUR-1230的條對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 32-35。(圖 6)
實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，!fepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA水平在針對(duì)SIRTl反義物CV428275 設(shè)計(jì)的其中兩種寡核苷酸中顯著增加。表示為CUR-1302、CUR-1304、CUR-1303和CUR-1305 的條對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 36-39。(圖 7)結(jié)果顯示，在用針對(duì)SIRT反義物BE717453設(shè)計(jì)的寡核苷酸之一處理后48小時(shí)， 在!fepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA水平顯著增加。表示為CUR-U64、CUR1265和CUR-1266的條分別對(duì)應(yīng) SEQ ID NO. :40-42ο (圖 8)結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA水平在用針對(duì)SIRTl反義物AV718812設(shè)計(jì)的其中三種寡核苷酸處理后48小時(shí)顯著增加。表示為CUR-1294、CUR-1297、CUR-1295、 CUR-1296 和 CUR-1298 的條分別對(duì)應(yīng) SEQ ID NO. :43-47。(圖 9)用反義寡核苷酸處理Vero76細(xì)胞使來(lái)自ATCC(目錄號(hào)CRL-1587)的Vero76細(xì)胞在37 °C和5 % CO2下生長(zhǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/raSS (Hyclone cat #SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-IO-OIO-CV)+10 % FBS(Mediatech 目錄號(hào) MT!35-011-CV) +青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CI))。 試驗(yàn)的前一天將所述細(xì)胞以密度1. 5XlOVml再接種到6孔板，并在37°C和5% CO2下孵育。在試驗(yàn)當(dāng)天將6孔板中的培養(yǎng)基換成新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸用水稀釋到20 μ M的濃度。將2 μ 1此溶液與400 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào)31985-070) 和 4μ1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019)在室溫下孵育 20min，然后向 6孔板的每個(gè)孔加入Vero76細(xì)胞。含有用2 μ 1水代替所述寡核苷酸溶液的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照。在37°C和5% CO2下培養(yǎng)3-1 后，將培養(yǎng)基換成新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。 添加反義寡核苷酸4 后，將培養(yǎng)基移出，并遵循制造商的說(shuō)明書使用Promega的SV Total RNA Isolation System(目錄號(hào) Z3105)或 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試齊[J盒 (目錄號(hào)74181)從細(xì)胞中提取RNA。如制造商的方案中所述，向使用Thermo Scientific 的Verso cDNA試劑盒(目錄號(hào)AB1453B)進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中添加600ng RNA。將來(lái)自此反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)使用ABI Taqman Gene Expression Mix(目錄號(hào)4369510)和由 ABI(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay :Hs00202021_ml, Applied Biosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計(jì)的引物探針的實(shí)時(shí)PCR，來(lái)監(jiān)控基因表達(dá)。使用下面的 PCR 循環(huán)50°C，2min ；95 °C, IOmin ；40 個(gè)循環(huán)的(95°C，15 秒；60°C，Imin)，使用 StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)。用反義寡核苷酸處理后基因表達(dá)的倍數(shù)變化基于處理和模擬轉(zhuǎn)染的樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的不同來(lái)計(jì)算。結(jié)果實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，Vero細(xì)胞中SIRTl mRNA水平在用針對(duì)SIRTl反義物CV396200 的反義寡核苷酸處理后4 顯著增加(圖:3B)。實(shí)施例3 =SIRTl基因表達(dá)的調(diào)節(jié)材料和方法用裸露反義寡核苷酸處理!fepG2細(xì)胞使來(lái)自ATCC(目錄號(hào)HB-8065)的!fepG2細(xì)胞在37 °C和5 % CO2下生長(zhǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/EBSS(Hyclone 目錄號(hào) SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV)+10 % FBS (Mediatech 目錄號(hào) MT!35-011-CV) +青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CI))。 試驗(yàn)的前一天將所述細(xì)胞以密度0. 5XlOVml再接種到6孔板，并在37°C和5% CO2下孵育。在試驗(yàn)當(dāng)天用1.5ml/孔新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換6孔板中的培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸用水稀釋到20 μ M的濃度。將2 μ 1此溶液與400 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào) 31985-070)和 4μ 1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019)在室溫下孵育20min，然后向6孔板的每個(gè)孔加入H印G2細(xì)胞。含有用2 μ 1水代替所述寡核苷酸溶液的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-1 后，將培養(yǎng)基換成新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。添加反義寡核苷酸7 后，將所述細(xì)胞如上文所述再添加。在第二次添加反義寡核苷酸4 后，將培養(yǎng)基移出，并遵循制造商的說(shuō)明書使用Promega的SV Total RNA Isolation System(目錄號(hào) Z3105)或 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試齊[J盒 (目錄號(hào)74181)從細(xì)胞中提取RNA。如制造商的方案中所述，向使用Thermo Scientific 的Verso cDNA試劑盒(目錄號(hào)AB1453B)進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中添加600ng RNA。將來(lái)自此反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)使用ABI Taqman Gene Expression Mix(目錄號(hào)4369510)和由 ABI(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay :Hs00202021_ml, Applied Biosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計(jì)的引物/探針的實(shí)時(shí)PCR，來(lái)監(jiān)控基因表達(dá)。使用下面的 PCR 循環(huán):50°C,2min ；95°C, IOmin ；40 個(gè)循環(huán)的(95°C，15 秒；60°C，Imin)，使用 StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)。用反義寡核苷酸處理后基因表達(dá)的倍數(shù)變化基于處理和模擬轉(zhuǎn)染的樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的不同來(lái)計(jì)算。用于SIRTl 天然反義物 CV396200 外顯子 4 :AACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCA (SEQ ID NO 48)的定制設(shè)計(jì)Taqman測(cè)定法的引物和探針。正向引物序列CCATCAGACGACATCCCTTAACAAA(SEQ ID NO :49)反向引物序列ACATTATATCATAGCTCCTAAAGGAGATGCA (SEQ ID NO 50)報(bào)道序列CAGAGTTTCAATTCCC(SEQ ID NO 51)結(jié)果結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA水平在用針對(duì)sirtas設(shè)計(jì)的siRNA之一 (sirtas_5, P = 0.01)處理后48h顯著增加。在相同的樣品中，sirtas RNA水平在用 sirtas_5處理后顯著減少，但在用sirtas_6和sirtas_7處理后不變，其也不影響SIRTl mRNA 水平(圖 IB)。sirtas_5、sirtas_6 和 sirtas_7 分別對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 29、30 和 31。原代猴肝細(xì)胞的處理將原代猴肝細(xì)胞通過(guò)RxGen Inc.引入培養(yǎng)，然后接種到6孔板中。其用如下的寡核苷酸處理。將6孔板中的培養(yǎng)基換成由William，s Medium E(Sigma目錄號(hào)W4128)組成的新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基，William，s Medium E補(bǔ)充有5% FBS、50U/ml青霉素和50ug/ml鏈霉素、4ug/ml胰島素、IuM地塞米松、10ug/ml菌纖維素(InVivogen, San Diego CA)。將所有反義寡核苷酸稀釋到20 μ M的濃度。將2 μ 1此溶液與400 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco 目錄號(hào) 31985-070)和 4μ1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019)在室溫下孵育20min，然后向6孔板的每個(gè)孔加入細(xì)胞。含有用2 μ 1水代替所述寡核苷酸溶液的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-1 后，將培養(yǎng)基換成新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。添加反義寡核苷酸4 后，將培養(yǎng)基移出，并遵循制造商的說(shuō)明書使用 Promega ^ SV Total RNA Isolation System( 0 ^ Z3105) ^ Qiagen ^ RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號(hào)74181)，從細(xì)胞中提取RNA。如制造商的方案中所述，向使用Thermo kientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號(hào)AB1453B)進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中添加600ng RNA。將來(lái)自此反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)使用ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號(hào) 4369510)禾口由 ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay Hs00978340_ml, Applied Biosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計(jì)的引物 / 探針的實(shí)時(shí) PCR，來(lái)監(jiān)控基因表達(dá)。使用下面的PCR循環(huán)50°C，2min ；95°C，IOmin ；40個(gè)循環(huán)的(95°C， 15秒；60°C，lmin)，使用Mx4000熱循環(huán)儀(Stratagene)。用反義寡核苷酸處理后基因表達(dá)的倍數(shù)變化基于處理和模擬轉(zhuǎn)染的樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的不同來(lái)計(jì)算。結(jié)果結(jié)果顯示于圖5中。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)SIRTl反義物的寡核苷酸處理后SIRTl mRNA水平增加。實(shí)施例4 非洲綠猴中⑶R 963的功效和作用持續(xù)時(shí)間研究本研究的目標(biāo)為評(píng)定和比較不一致非編碼反義序列的反義敲減效果，該不一致非編碼反義序列在非人類的靈長(zhǎng)類模型中在靜脈內(nèi)施用后調(diào)節(jié)SIRTl基因。將設(shè)計(jì)成抑制 SIRTl調(diào)節(jié)序列的反義寡核苷酸測(cè)試物定名為CUR 963。CUR 963 :+G*+T*C*T*G*A*T*G*G*+A*+G*+A(SEQ ID NO :25)。CUR 962(對(duì)照)+G*+C*T*A*G*T*C*T*G*+T*+T*+G (SEQ ID NO :52)。調(diào)節(jié)試驗(yàn)指引本研究依照公認(rèn)的毒理學(xué)原理且遵守國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(International Conference of Harmonization, ICH)協(xié)調(diào)的三方指引(用于進(jìn)行藥物的人類臨床試驗(yàn)的非臨床安全石if究(Non-Clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials for Pharmaceuticals) ICH M3 (m)，2000年11月9日)和用于治療劑的試驗(yàn)的一般公認(rèn)程序來(lái)設(shè)計(jì)。檢品和對(duì)照品檢品鑒定和制備檢品⑶R-963為化學(xué)穩(wěn)定的反義寡核苷酸。用于靜脈內(nèi)遞送的溶媒為磷酸緩沖鹽水(PBS)。溶媒特征對(duì)于PBS溶媒而言，組成、批號(hào)、有效期和儲(chǔ)存條件(溫度和亮/暗)可從供應(yīng)商處獲得。檢品儲(chǔ)存和處理試樣和溶媒相應(yīng)地依照由贊助商和制造商提供的公認(rèn)的儲(chǔ)存條件來(lái)儲(chǔ)存。檢品制劑的分析檢品制劑的樣品將冷藏保存以用于試樣制劑的濃度、穩(wěn)定性和均質(zhì)性的分析。試驗(yàn)系統(tǒng)基本原理靈長(zhǎng)類動(dòng)物為適合的非嚙齒類物種，其作為可接受的潛在危害的指示者為管理機(jī)構(gòu)可接受，且對(duì)其而言大量的背景數(shù)據(jù)為可得的。非洲綠猴特別地為多重人類生理和疾病狀態(tài)的高度臨床相關(guān)模型。靜脈內(nèi)給藥途徑對(duì)應(yīng)可能的人類治療途徑。檢品的劑量基于早前在非洲綠猴中進(jìn)行的類似化合物的劑量探測(cè)研究的結(jié)果。將非洲綠猴選為精選的靈長(zhǎng)類動(dòng)物，因?yàn)樵嚇拥陌行蛄性谖锓N之間保守，在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中具有100%的同源性。此外，試樣為合成寡核苷酸。因此，在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中給藥允許對(duì)這些化合物的功效進(jìn)行優(yōu)良評(píng)價(jià)，與任何其他物種相比，這更多地反映可能見于人中的攝取。動(dòng)物物禾中綠猴屬(Chlorocebus sabaeus)，非人類靈長(zhǎng)類。品種Kitts本土非洲綠猴。來(lái)源RxGen, Lower Bourryeau, St. Kitts, West Indies。期望年齡試驗(yàn)動(dòng)物為成體。期望體重猴近似重3_4kg。實(shí)際范圍可以改變但將記錄在數(shù)據(jù)中。性別試驗(yàn)動(dòng)物為成年雌性。動(dòng)物數(shù)目篩選十只動(dòng)物以確保適合于加入研究中的8只動(dòng)物的身份。研究數(shù)量雌性8。關(guān)于研究數(shù)目的論證本研究設(shè)計(jì)為使用最少可能數(shù)目的動(dòng)物，符合評(píng)價(jià)檢品在非洲綠猴中的治療功效的主要目標(biāo)以及此類型寡核苷酸在該物種中的全身給藥的預(yù)先研究。動(dòng)物規(guī)格在研究中采用在3_4kg重量范圍的十只成年非洲綠猴。猴為從棲息于島的野生種群中人道捕獲的首次接觸藥物(drUg-na’ive)的成年動(dòng)物。捕獲的猴用驅(qū)蠕蟲藥 (antihelminthics)處理以消除任何可能的腸道寄生蟲負(fù)荷，并在針對(duì)研究加入進(jìn)行篩選之前隔離觀察最少4周。捕獲的猴的年齡通過(guò)大小和齒狀結(jié)構(gòu)來(lái)估算，從研究中排除年長(zhǎng)動(dòng)物。在研究加入之前，對(duì)每只猴進(jìn)行臨床檢查，包括移動(dòng)和靈巧評(píng)估。取得血樣并送往 Antech Diagnostics (Memphis, TN)用于綜合臨床化學(xué)和全血計(jì)數(shù)以及脂肪譜(參見關(guān)于詳述的章節(jié)9. 2和319567928)。如通過(guò)與在Kitts群體中對(duì)于猴確定的正常范圍比較測(cè)定的，從研究中排除具有異常實(shí)驗(yàn)值的猴。為了鑒定滿足此標(biāo)準(zhǔn)的8只猴，篩選10只猴， 根據(jù)需要篩選額外的動(dòng)物。在研究開始之前，將挑選出的猴轉(zhuǎn)移到單個(gè)籠子以適應(yīng)獨(dú)居一周時(shí)間。只將視為適合于試驗(yàn)的動(dòng)物加入研究。在研究開始時(shí)的實(shí)際(或估算的)年齡和重量范圍將在原始數(shù)據(jù)和最終報(bào)告中詳述。動(dòng)物健康和福利遵循最高標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物福利且堅(jiān)持由Kitts農(nóng)業(yè)部和美國(guó)衛(wèi)生與公眾服務(wù)部 (U. S. Department of Health and Human Services)規(guī)定的指南。所有研究將依照這些要求以及用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和居住的所有可應(yīng)用實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。關(guān)于獸醫(yī)學(xué)護(hù)理、操作和審查的所有可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)如NIH動(dòng)物護(hù)理和使用指南(Guide for the Care and Use of Animals) 中包含的。Μ. Kitts設(shè)施保持動(dòng)物研究委員會(huì)，其如由指南要求審查方案并檢查設(shè)施?；饡?huì)具有由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利辦公室(Office of Laboratory Animal Welfare)提交的批準(zhǔn)保證，如由指南#A4384-01 (Axion研究基金會(huì)(Research Foundation) /St. Kitts生物醫(yī)學(xué)基金會(huì)(Biomedical Foundation))要求的。不存在由本研究中指定的研究產(chǎn)生的專門非人靈長(zhǎng)類獸醫(yī)學(xué)護(hù)理內(nèi)容和生物危害內(nèi)容。居住和環(huán)境為了允許檢測(cè)任何治療相關(guān)的臨床體征，動(dòng)物在手術(shù)前和手術(shù)后獨(dú)居直至處死。 各個(gè)籠子位于其中的靈長(zhǎng)類建筑物完全由環(huán)境光線照明，如U. S. D. H. H. S指南中推薦的， 在北緯17度約12小時(shí)12小時(shí)光-暗循環(huán)。RxGen靈長(zhǎng)類建筑物完全通風(fēng)至室外。另外的空氣流動(dòng)通過(guò)吊扇確保，以維持23-35°C的恒定目標(biāo)溫度，如為Kitts全年典型的。每天測(cè)量二十四小時(shí)溫度極端和相對(duì)濕度(這也將不受控制)。在研究期間，定期清潔籠子。飲食和水每只動(dòng)物提供約90克/天的標(biāo)準(zhǔn)猴食物飲食(TekLad，Madison, WI)。記錄飲食的具體營(yíng)養(yǎng)組成。水定期分析微生物純度。常備飲食和水源中可接受水平的污染物標(biāo)準(zhǔn)分別在由飲食制造商確定的分析規(guī)格和定期的設(shè)施水評(píng)估內(nèi)。水符合對(duì)于證明為可接受用于人消耗所需的所有標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)動(dòng)物標(biāo)識(shí)和隨機(jī)化借助于基于體重和血漿膽固醇譜的分層隨機(jī)化程序來(lái)完成分配。在分配至組前和后，每只動(dòng)物通過(guò)腹部上的紋身來(lái)標(biāo)識(shí)。紋身置于所有群體動(dòng)物上，作為在常規(guī)健康檢查過(guò)程中的鑒別方法。擬定籠計(jì)劃以標(biāo)識(shí)在內(nèi)居住的個(gè)體，并且單個(gè)猴通過(guò)與其各自籠附著的標(biāo)記標(biāo)簽來(lái)進(jìn)一步標(biāo)識(shí)。組大小、劑量和標(biāo)識(shí)號(hào)將動(dòng)物分配至2個(gè)處理組，由每組中的4只猴組成。根據(jù)設(shè)施編號(hào)系統(tǒng)為每只猴提供特定動(dòng)物標(biāo)識(shí)號(hào)。此系統(tǒng)通過(guò)跟隨有三個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字的字母(例如Y032)唯一地標(biāo)識(shí)每只猴。給藥途徑和頻率通過(guò)在約10分鐘內(nèi)手動(dòng)輸注來(lái)靜脈內(nèi)遞送，動(dòng)物在第1、3和5天每天給藥一次。 輸注速率將為24mL/kg/h。在給藥程序之前和期間，用氯胺酮和賽拉嗪鎮(zhèn)靜動(dòng)物。將靜脈導(dǎo)管(Terumo微型靜脈輸液裝置，20規(guī)針，或類似的合適輸液裝置)插入隱靜脈內(nèi)。在8:00 和10:00a.m之間，在動(dòng)物醒來(lái)后不久且在進(jìn)食前，對(duì)每只猴進(jìn)行給藥。如下文血液化學(xué)章節(jié)中所述的用來(lái)評(píng)估血漿膽固醇和其他脂質(zhì)水平的血樣，僅在每次輸注前收集。采血在2 次取樣間隔時(shí)的進(jìn)食前進(jìn)行，以最小化飲食對(duì)膽固醇測(cè)量的影響。臨床觀察在給藥的每天記錄治療反應(yīng)的所有可見體征。此外，動(dòng)物就物理屬性(例如外表) 和一般狀況每周檢查至少一次。體重在治療期間和治療期后以每周間隔記錄體重。
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食物消耗不定量個(gè)體食物消耗。然而，監(jiān)控進(jìn)食模式和作出任何大改變的備注。死亡率和發(fā)病率將記錄死亡率和發(fā)病率。在與研究負(fù)責(zé)人且如有可能，贊助者的監(jiān)控科學(xué)家商量后，作出關(guān)于過(guò)早處死的任何決定。被發(fā)現(xiàn)死亡或過(guò)早殺死的動(dòng)物將經(jīng)受尸檢，收集肝臟、 腎、心臟和脾肺組織用于組織病理學(xué)。在過(guò)早處死的事件中，還將獲取血樣(如有可能)并測(cè)定參數(shù)。在固定工作時(shí)間后被發(fā)現(xiàn)死亡的動(dòng)物將冷凍過(guò)夜且在下一個(gè)工作日開始時(shí)進(jìn)行尸檢。如果動(dòng)物狀況需要過(guò)早處死，那么它將通過(guò)靜脈內(nèi)過(guò)量的戊巴比妥鈉而安樂(lè)死。所有研究受動(dòng)物使用原則(Principles for Use of Animals)控制。RxGen由法律要求遵守美國(guó)衛(wèi)生和人力資源服務(wù)部靈長(zhǎng)類設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)，其指示在本研究?jī)?nèi)的程序(指定為溫和)必須遵守的嚴(yán)重性水平。臨床實(shí)驗(yàn)室研究脂肪活檢在研究第沈天，在除Y775之外的所用研究猴上通過(guò)經(jīng)由臍下Icm中線切口的組織提取物進(jìn)行皮下脂肪活檢。將活檢立即浸入含有anl RNAlater(Qiagen)的標(biāo)記冷凍管中并在4°C孵育過(guò)夜，這之后將RNAlater吸出并將樣品管在液氮中瞬間冷凍。在液氮中運(yùn)送后，將總RNA分離用于靶基因的實(shí)時(shí)qPCR。結(jié)果實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示與用CUR-962(SEQ ID NO. :52，在體外對(duì)SIRTl表達(dá)無(wú)影響的寡核苷酸(針對(duì)ApoAl反義物DA327409設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)未顯示))給藥的猴相比，用⑶R-963 (針對(duì)SIRTl反義物CV396200. 1設(shè)計(jì)的寡核苷酸)給藥的猴脂肪活檢中，SIRTl mRNA水平增加。mRNA水平通過(guò)實(shí)時(shí)PCR來(lái)確定(圖4)。盡管本發(fā)明已就一個(gè)或多個(gè)實(shí)現(xiàn)舉例說(shuō)明并描述，但在閱讀和理解本說(shuō)明書和附圖后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到等價(jià)改變和修飾。此外，雖然本發(fā)明的具體特征可能已就幾個(gè)實(shí)現(xiàn)中的唯一一個(gè)公開，但這類特征可與其他實(shí)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)其他特征組合，如對(duì)于任何給定或具體應(yīng)用而言可為所需和有利的。本公開的摘要將允許讀者快速確定本技術(shù)公開內(nèi)容的性質(zhì)。在理解以下的情況下將其提出其將不用于解釋或限制隨附權(quán)利要求的范圍或含義。
權(quán)利要求
1.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO 2的核苷酸1-10 或SEQ ID NO 3的核苷酸1_似9或SEQ ID NO 4的核苷酸1-156或 SEQ ID NO 5的核苷酸1-593(圖11)之內(nèi)的5_30個(gè)連續(xù)核苷酸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
2.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的反義物的反向互補(bǔ)序列，具有至少50%序列同一性； 從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
3.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與針對(duì)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的反義寡核苷酸，具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
4.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與靶定沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸天然反義物的區(qū)域的反義寡核苷酸接觸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)的表達(dá)和/功能在體內(nèi)或體外相比于對(duì)照增加。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸靶定沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的天然反義序列。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸靶定核酸序列，所述核酸序列包括沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸靶定沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸包含一種或多種修飾，所述修飾包括經(jīng)修飾的糖部分、經(jīng)修飾的核苷間鍵、經(jīng)修飾的核苷酸和/或其組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中經(jīng)修飾的糖部分包括2’-0-甲氧基乙基修飾的糖部分、 2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、或二環(huán)糖部分。
11.權(quán)利要求9的方法，其中經(jīng)修飾的核苷間鍵包括硫代磷酸酯、2’-0-甲氧基乙基 (MOE)、2’_氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯、和/或其組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述寡核苷酸任選地具有至少一種經(jīng)修飾的核苷酸，所述經(jīng)修飾的核苷酸包括肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子、阿糖核酸(EANA)、肽核酸(PNA)、其類似物或衍生物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述寡核苷酸包含如SEQID NO :6-47所述的至少一個(gè)寡核苷酸序列。
14.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)基因的表達(dá)和/或功能的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與對(duì)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的反義多核苷酸特異的長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的短干擾RNA(SiRNA)寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白 I(SIRTl)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列，具有至少50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl) 基因的表達(dá)和/或功能。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少80%序列同一性。
16.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)基因的表達(dá)和/或功能的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度為約5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，所述反義寡核苷酸對(duì)編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)分子的多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼和/ 或編碼序列特異，其中反義寡核苷酸與如SEQ ID NO :1-5所述的至少一個(gè)核酸序列具有至少50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl) 基因的表達(dá)和/或功能。
17.一種合成的、經(jīng)修飾的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少一種修飾，其中所述修飾包括至少一種下列核苷酸間鍵烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、 氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯、或其組合，其中與正常對(duì)照相比，所述寡核苷酸為在體內(nèi)或體外與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)分子雜交并調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能的反義化合物。
18.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述修飾包括硫代磷酸酯核苷酸間鍵與至少一種選自下列的核苷酸間鍵的組合烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯、和/或其組合。
19.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
20.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵的骨架。
21.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸任選地包含至少一種經(jīng)修飾的核苷酸，所述經(jīng)修飾的核苷酸包括肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子、其類似物、衍生物和/或組合。
22.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含經(jīng)修飾的糖部分，所述經(jīng)修飾的糖部分包括2’ -0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、或二環(huán)糖部分。
23.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有至少約5-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度且與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列，具有至少約20%序列同一性。
24.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列，具有至少約80%序列同一性。
25.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中與正常對(duì)照相比，所述寡核苷酸在體內(nèi)或體外與至少一種沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸雜交并調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能。
26.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含如SEQID NO :6_47所述的序列。
27.一種組合物，所述組合物包含對(duì)沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸特異的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括其反義序列、互補(bǔ)序列、等位基因、同源物、同種型、變體、衍生物、突變體或片段。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述寡核苷酸包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列與如SEQ ID NO 6-47所述核苷酸序列中的任何一個(gè)相比有至少約40%的同一性。
29.權(quán)利要求27的組合物，其中所述寡核苷酸包含如SEQID NO 1_47所述的核苷酸序列。
30.權(quán)利要求27的組合物，其中如SEQID NO :6_47所述的寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾或取代的核苷酸。
31.權(quán)利要求27的組合物，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸包含經(jīng)修飾的堿基，所述經(jīng)修飾的堿基包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子。
32.一種預(yù)防或治療與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸和/或其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括給患者施用治療有效劑量的至少一種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的天然反義序列結(jié)合，并調(diào)節(jié)所述沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸的表達(dá)；從而預(yù)防或治療與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸和/或其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病。
33.權(quán)利要求32的方法，其中與沉默調(diào)節(jié)蛋白I(SIRTl)多核苷酸有關(guān)的疾病包括癌癥(例如，乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、CCL、CML、前列腺癌)、神經(jīng)變性疾病(例如，阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化，以及由多谷氨酰胺聚集引起的病癥)；骨骼肌疾病(例如，杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良、骨骼肌萎縮、貝克耳肌營(yíng)養(yǎng)不良、或強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良)；代謝病(例如，胰島素抵抗、糖尿病、肥胖癥、葡萄糖耐量降低、高膽固醇血癥、 高血糖癥、血脂障礙和高脂血癥)；成年型糖尿病、糖尿病腎病、神經(jīng)病(例如，感覺神經(jīng)病、 自主神經(jīng)病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病)；骨病(例如，骨質(zhì)疏松癥)、血液病(例如，白血病)； 肝病(例如，由于酗酒或肝炎所致的)；肥胖癥；骨吸收、年齡相關(guān)性黃斑變性、AIDS相關(guān)的癡呆、ALS、貝爾氏麻痹、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病(例如，心律紊亂、慢性充血性心力衰竭、缺血性發(fā)作、冠狀動(dòng)脈疾病和心肌病)、慢性退行性疾病(例如，心肌疾病)、慢性腎衰竭、2型糖尿病、潰瘍、白內(nèi)障、老視、腎小球腎炎、格-巴綜合征、出血性卒中、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、SLE、克羅恩氏病、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺炎、皮膚老化， 以及尿失禁；其他實(shí)例包括與神經(jīng)元細(xì)胞死亡、老化或其他以不需要的細(xì)胞消亡為特征的病況相關(guān)的疾病和病癥。
34.一種鑒定和選擇用于體內(nèi)施用的寡核苷酸的方法，所述方法包括選擇與疾病狀態(tài)有關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包含至少五個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，所述連續(xù)核苷酸與已鑒定的多核苷酸互補(bǔ)或處于其反義方向；和，在嚴(yán)格雜交條件下測(cè)定所述反義寡核苷酸與靶多核苷酸的結(jié)合之間的熱解鏈溫度；以及，鑒定和選擇用于體內(nèi)施用的寡核苷酸。
全文摘要
寡核苷酸化合物調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)多核苷酸和其編碼的基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。治療與沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)有關(guān)的疾病的方法包括給患者施用設(shè)計(jì)以抑制SIRT1天然反義轉(zhuǎn)錄物的一種或多種寡核苷酸化合物。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102307997SQ200980156393
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者萊昂 B·德, C·科伊托, J·科拉德, 謝爾曼 O·霍爾科瓦 申請(qǐng)人:歐科庫(kù)爾納有限責(zé)任公司