專利名稱：結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子α且對Ras基因突變的癌具有增殖抑制活性的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子a (Transforming growth factor alpha,以下稱為“TGFa ”)、并具有在體內(nèi)抑制Ras蛋白質(zhì)具有突變的癌細(xì)胞增殖的效果的單克隆抗體，以及含有該抗體的抗癌劑。
背景技術(shù)：
TGFa是1980年初期由Spawn ( ^ — )和Roberts (羅伯茨)等的小組，自小鼠肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的小鼠3T3細(xì)胞的培養(yǎng)上清中，作為對于軟瓊脂中誘導(dǎo)正常大鼠腎臟成纖維細(xì)胞(NRK細(xì)胞)集落形成所必要的2種因子之一而分離、精制的(非專利文獻1-6)。
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TGFa作為由160個氨基酸組成的前體多肽生物合成，在細(xì)胞內(nèi)糖鏈修飾以及棕櫚酰化后，作為I型膜貫通蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜表面表達(膜型TGF a )(非專利文獻7)。其后，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域受到TACE/ADAM17等金屬蛋白酶切斷，由第40位至第89位的50個氨基酸(約6kDa)構(gòu)成的單一多肽作為分泌型TGFa而游離(非專利文獻8_10)。分泌型TGFa具有通過6個半胱氨酸殘基于3個地方進行二硫鍵合的特征性結(jié)構(gòu)(非專利文獻11-13)。該結(jié)構(gòu)最初在上皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor, EGF)中發(fā)現(xiàn)，以后稱為EGF樣結(jié)構(gòu)域。具有EGF樣結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，除了 TGFa和EGF之外，還有雙調(diào)蛋白(amphiregulin) >HB-EGF> β -動物纖維素、上皮調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin)、epigen、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-5以及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白_6(以下將神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 -6稱為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)，共計存在13種具有EGF樣結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，這些總稱為EGF家族分子(非專利文獻10、非專利文獻14)。EGF家族分子與TGFa同樣，全部作為I型膜蛋白質(zhì)生物合成，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域通過蛋白酶分解而成為游離型(非專利文獻10)。物種間的氨基酸同源性高，EGF樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)造也是保守的。例如，人與小鼠的TGFa氨基酸同源性為92%，人TGFa作用于小鼠或大鼠(非專利文獻15)。EGF家族分子作為直接結(jié)合受體型酪氨酸激酶EGF受體(EGFR)家族(別名ErbB家族)的配體發(fā)揮作用。EGFR家族根據(jù)結(jié)構(gòu)上的類似性目前鑒定為4種，分別稱為EGFR(ErbBl)、HER2 (ErbB2)、HER3 (ErbB3)以及 HER4 (ErbB4)(非專利文獻 14、16)。存在的13種EGF家族分子中，作為結(jié)合EGFR的配體已知有TGF a、EGF、雙調(diào)蛋白、β -動物纖維素、上皮調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin)等。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合HER3,神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，β-動物纖維素、HB-EGF結(jié)合HER4。HER2不具有配體結(jié)合部位(非專利文獻14，16)。EGF家族分子結(jié)合作為受體的EGFR家族分子后，受體形成二聚體的同時，通過位于細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶誘導(dǎo)酪氨酸殘基磷酸化(非專利文獻16)。接著將細(xì)胞內(nèi)各種各樣的蛋白質(zhì)以級聯(lián)狀進行活化。作為這樣的級聯(lián)途徑的代表例，已知有Ras/Raf/MAPK途徑、PI3K/Akt/mT0R途徑以及JAK-STAT途徑。Ras/Raf/MAPK途徑主要參與細(xì)胞的增殖和生存，PI3K/Akt/mT0R途徑參與細(xì)胞生長或抗程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞浸潤、細(xì)胞游走等(非專利文獻17)。
向軟瓊脂中的大鼠正常成纖維細(xì)胞Rat-1添加分泌型TGFa時，Rat-1的細(xì)胞形態(tài)變化為轉(zhuǎn)化細(xì)胞樣，在瓊脂中形成集落(非專利文獻15)。另外，導(dǎo)入了 TGFa基因的CHO細(xì)胞也成為轉(zhuǎn)化樣細(xì)胞，移植至裸小鼠時容易形成腫瘤(非專利文獻9)?？扇缦吕斫?，此時CHO細(xì)胞表面上的EGFR通過有意地磷酸化，CHO分泌的TGF α自分泌性地誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。作為TGFa的其他生理功能，已知有作為強力的血管新生誘導(dǎo)因子的功能。認(rèn)為是通過TGFa作用于在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達的EGFR，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的游走和增殖(非專利文獻 18-21)。健康正常人的TGFa的成體內(nèi)分布特征是，在呼吸道上皮或大腸的粘膜上皮等的粘膜上皮細(xì)胞表達(非專利文獻22-24)。該表達模式類似于EGFR的表達模式。另一方面，對于癌，以實體腫瘤為中心，廣泛知道TGFa的過量表達(非專利文獻22、23)。在頭頸部癌、肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、腎臟癌、肝癌、卵巢癌、黑素瘤等各種各樣的癌種類中確認(rèn)在mRNA以及蛋白質(zhì)水平上TGF α的表達增強。據(jù)報導(dǎo)，作為受體的EGFR也在各種癌組織中確認(rèn)有過量表達，特別是在非小細(xì)胞肺癌或頭頸部扁平上皮癌、腎癌中TGFa與EGFR的表達量正 相關(guān)(非專利文獻25-29)。在實體瘤的周邊部位由形成被稱為間質(zhì)的癌細(xì)胞立腳點的基質(zhì)(stroma)(主要是成纖維細(xì)胞)和運送營養(yǎng)的血管所構(gòu)成的組織發(fā)育。使用抗TGFa抗體進行癌組織的免疫組織染色的結(jié)果可知，TGFa不僅在癌部位存在，在間質(zhì)也存在(非專利文獻25、29)。由此認(rèn)為TGFa不僅誘導(dǎo)癌細(xì)胞的自分泌性增殖，還通過作為支持癌生長的間質(zhì)的生長因子發(fā)揮功能，有助于癌的惡性化(非專利文獻18-21、30)。如上所述，含有TGF α的EGF家族分子或作為其受體的EGFR —定參與癌的增殖。因此，當(dāng)然地期待將TGF α或EGFR作為靶標(biāo)來控制癌細(xì)胞的增殖(非專利文獻16_17、31)。1980年代初開始了將EGFR作為癌治療靶標(biāo)的單克隆抗體的研究(非專利文獻32-34)。開發(fā)了與作為配體的EGF競爭結(jié)合、具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化、二聚體化的活性的單克隆抗體西妥昔單抗(cetuximab :商品名艾比特思(Erbitux))(非專利文獻35、36)。西妥昔單抗抑制以A431細(xì)胞為首的培養(yǎng)癌細(xì)胞的增殖，確認(rèn)在小鼠荷瘤模型中也發(fā)揮抗腫瘤效果，1990年以扁平上皮肺癌患者為對象開始了臨床試驗。在2001-2002年進行的隨機比較臨床試驗中證明了對于大腸癌的效果，在2003年作為對于轉(zhuǎn)移性大腸癌的治療劑在瑞士開始受到認(rèn)可。FDA也在2004年承認(rèn)其作為對于表達EGFR的轉(zhuǎn)移性大腸癌的治療劑，在2006年追加承認(rèn)其作為表達EGFR的頭頸部癌的治療劑。在日本于2008年作為EGFR陽性的不能治愈切除的進行性和/或再發(fā)性結(jié)腸直腸癌的治療劑受到厚生勞動省的制造銷售承認(rèn)(非專利文獻37)。作為同樣與EGFR結(jié)合來抑制癌增殖的抗EGFR單克隆抗體已知有帕尼單抗(panitumumab)(品名Vectibix,安進公司(Amgen))(非專利文獻38)。帕尼單抗(panitumumab)在歐美與西妥昔單抗同樣地作為EGFR陽性的進行性和/或再發(fā)性大腸癌的治療劑使用。任一抗EGFR封閉抗體都可改善化學(xué)療法無效的大腸癌患者的總生存期間和無病情惡化生存期間，維持生活的質(zhì)量，因此期望對于其他的EGFR陽性癌的適應(yīng)擴大(非專利文獻31、35、39)。但是，另一方面，西妥昔單抗抵抗性的大腸癌的頻率高，50%以上的患者發(fā)現(xiàn)大腸癌的病情惡化(非專利文獻40-41)。對于該西妥昔單抗抵抗性，指出與K-Ras基因突變相關(guān)。即，位于EGFR的下游的K-Ras的基因存在突變時，與西妥昔單抗或帕尼單抗(panitumumab)是否封閉了 EGFR無關(guān),細(xì)胞活化,癌維持增殖(非專利文獻42)。
1960年代自大鼠的Kirusten肉瘤病毒、Harbey肉瘤病毒分離出作為癌基因的K-Ras以及H-Ras。其后，從人膀胱癌細(xì)胞株分離出活性型H_Ras、從人肺癌細(xì)胞株分離出活性型K-Ras、從神經(jīng)母細(xì)胞瘤分離出活性型N-Ras (非專利文獻43_44)。這3種Ras基因的基因產(chǎn)物的同源性高達約85%。正常細(xì)胞的Ras基因產(chǎn)物是一種具有GTPase活性的低分子G蛋白，具有促進細(xì)胞增殖的作用。該Ras基因發(fā)生點突變時，所編碼的氨基酸發(fā)生錯義突變，存在本來的GTPase活性降低的情況。特別地，提示了密碼子第12位或者第13位的甘氨酸殘基的點突變與腫瘤化的關(guān)聯(lián)，大腸癌患者中約40%確認(rèn)密碼子12或者13突變(非專利文獻40)。認(rèn)為該突變型Ras蛋白質(zhì)由于維持了 GTP結(jié)合的活性型，向下游連續(xù)不斷地傳送信號，引起異常的細(xì)胞增殖或腫瘤化(非專利文獻45)。此時以TGFa為首的各種EGF家族分子過量地表達，因此認(rèn)為這加速癌細(xì)胞的增殖，增強了癌的增大(非專利文獻46)。在K-Ras基因有突變的場合，即使使用西妥昔單抗或帕尼單抗也不能期待效果，僅承擔(dān)副作用的風(fēng)險。因此，這些治療藥物，在歐洲有僅限用于沒有K-Ras基因突變的患者這樣的附加條件。在日本使用西妥昔單抗時，期待效果地推薦以K-Ras基因正常的患者作為對象。作為其他的EGFR抑制劑，已知抑制存在于細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶的作用的低 分子劑吉非替尼(gefitinib)(商品名易瑞沙(Iressa))或厄洛替尼(erlotinib)(商品名特羅凱(Tarceva))，有報道這些治療藥物在具有K-Ras突變的患者中也效果不良(非專利文獻39，47-48)。另一方面，在我們知道的范圍里不存在以位于EGFR上游的TGFa作為靶標(biāo)的單克隆抗體來對于來源于實際的癌患者的癌細(xì)胞抑制其增殖這樣的報道或?qū)τ谝浦擦巳税┘?xì)胞的荷瘤模型小鼠抑制了腫瘤形成這樣的報道。但是，存在使用針對TGF α的單克隆抗體抑制軟瓊脂中接種的培養(yǎng)細(xì)胞形成集落的例子。1986年Rosenthal等使用針對人TGF α的單克隆抗體TGF-a I進行了以下實驗。正常大鼠成纖維細(xì)胞Rat-1在軟瓊脂中幾乎不形成集落，但添加人TGF α?xí)r，容易誘導(dǎo)形成集落。另外強制性地導(dǎo)入人TGF α基因而建立的Rat-1細(xì)胞株的克隆16和克隆42也獲得集落形成能力。在該培養(yǎng)體系中添加抗TGFa抗體的TGF-α I時阻止集落形成。另一方面，導(dǎo)入了活性型Ras基因的Rat-1也獲得集落形成能力。但是，即使在該培養(yǎng)體系中添加抗TGFa抗體的TGF-a I也不能阻止集落形成(非專利文獻15)。1990年由Ciardiello等實施了同樣的實驗(非專利文獻49)。在正常乳腺上皮細(xì)胞的MCFlOA中導(dǎo)入TGFa基因，建立高表達TGFa的細(xì)胞株MCFlOA TGFaC13(以下稱為C13)以及MCFlOA TGFaC14(以下稱為C14)。親本的MCFlOA細(xì)胞在軟瓊脂中幾乎不形成集落，但C13和C14具有高的集落形成能力。在培養(yǎng)體系添加抗TGF α單克隆抗體Tabl時，C13以及C14的集落形成受抗體濃度依賴性抑制(抗體濃度50 μ g/mL以上阻止約90%集落形成)。在該實驗體系中，EGFR的封閉抗體克隆528在通過抗體濃度進行評價的場合，與Tabl相比達到10倍以上強的抑制集落形成(抗體濃度5 μ g/mL以上時阻止90%以上集落形成)。在MCFlOA中導(dǎo)入活性型Ras基因建立的細(xì)胞株MCFlOA Ha_rasCll以及MCFlOAHa-ras C12在高表達TGFa的同時獲得高的集落形成能力。這些活性型Ras導(dǎo)入細(xì)胞與上述的TGF α導(dǎo)入細(xì)胞相比，對EGFR封閉抗體和抗TGF α抗體顯示強的抵抗性。EGFR的封閉抗體528在抗體濃度5 μ g/mL時僅達成60-70%左右的集落形成抑制，至于抗TGFa抗體Tabl,在50 μ g/mL 100 μ g/mL的抗體濃度也僅達成50%左右的集落形成抑制。1989 年 Oncogene Science 公司(才 >-'7'— >寸4工>7 公司)的 Sorvillo等取得了多個抗TGFa單克隆抗體的專利(專利文獻I)。在專利說明書中，有關(guān)于克隆213-4. 4、克隆134A-2B3以及克隆137-178的針對TGF α的反應(yīng)特異性的記載，但是沒有關(guān)于通過這些抗體抑制TGF α生理功能的數(shù)據(jù)或者針對TGF α表達細(xì)胞的增殖抑制的數(shù)據(jù)。在1990年同一研究組對于專利說明書中記載的某種抗TGF α抗體以論文進行報道(非專利文獻50)。在該論文中，顯示了克隆189-2130抑制TGFa結(jié)合EGFR的效果，但是沒有觸及針對TGF α表達細(xì)胞或Ras突變癌增殖的影響等。如以上那樣，目前為止關(guān)于癌細(xì)胞的增殖控制，不能期待針對存在于EGFR上游的TGFa的抗體比含有EGFR封閉抗體的EGFR抑制劑也顯示優(yōu)異的效果。進一步地，含有Ras的EGFR下游對于連續(xù)不斷地活化的癌細(xì)胞，即使封閉位于上游的EGFR或進而封閉存在于上游的TGF α ,抑制癌細(xì)胞的增殖是更加困難的，目前為止這已成為常識(非專利文獻31,46)。實際上在廣泛的腫瘤中報道了 Ras的基因突變。人的癌全體的平均17-25%的患者中有K-Ras基因突變(非專利文獻51)。特別是大腸癌中35-40%、肺癌中35%、甲狀腺癌中55%以及胰癌中80-90%的患者發(fā)現(xiàn)基因突變(非專利文獻52-53)。如上所述Ras基因的活性型突變成為對于含有西妥昔單抗或帕尼單抗的各種EGFR抑制劑顯示強的耐性的原因(非專利文獻42、54)。開發(fā)對于對現(xiàn)有藥物抵抗性高的Ras突變癌的治療藥是直接關(guān)乎提高人類生活的重要課題，很多的癌患者以及醫(yī)生們也強烈期待。但是，現(xiàn)在為止，不存在用于治療Ras突變癌的有效手段?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1:美國專利第5190858號公報非專利文獻非專利文獻I Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1978) 75，4001-4005非專利文獻2 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1980) 77，3494-3498非專利文獻3 =Nature (1982) 295，417-419非專利文獻4 :Cancer Res. (1982)42,4776-4778非專利文獻5 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1983) 80，4684-4688非專利文獻6 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1983) 80，6264-6268非專利文獻7 J. Cell Biol. (1994) 125,903-916非專利文獻8 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1991) 88,1726-1730非專利文獻9 EMB0 J. (2003) 22，1114-1124非專利文獻10 =Cancer Sc1. (2008) 99，214-220非專利文獻11 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA (1986) 83，8082-8086非專利文獻I2 Biochem. (1993)32,7334-7353非專利文獻13 Cell (2002) 110, 763-773非專利文獻14 Exp. Cell Res. (2003) 284，2-13
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非專利文獻54 J. Clin. Oncol. (2008) 26，5668-5670

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明是鑒于上述情況而完成，其目的在于，提供對Ras基因有突變的癌細(xì)胞具有優(yōu)異的增殖抑制效果的抗體。進而本發(fā)明的目的在于，提供將這樣的抗體作為有效成分的抗癌劑。解決課題的手段本發(fā)明人們?yōu)榱诉_成上述課題反復(fù)深入研究的 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在對天然型TGFa顯示反應(yīng)性的抗體中，與G79A置換型TGF α的反應(yīng)性低的抗體對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞具有優(yōu)異的增殖抑制效果。進而，本發(fā)明人們發(fā)現(xiàn)，這些抗體很多具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性和/或抑制引誘血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，從而完成本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞具有優(yōu)異的增殖抑制效果的抗TGF α抗體、以及其制造方法和用途，更詳細(xì)地說，提供下述的發(fā)明。〈1>針對人TGFa的抗體，所述抗體是對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞顯示增殖抑制活性的抗體。〈2>與天然型人TGFa比較，與79位的甘氨酸具有突變的人TGF α的反應(yīng)性低的抗體。<3>根據(jù)〈2>所述的抗體，其中，79位的甘氨酸具有突變的人TGFa是G79A置換型的人TGF α。<4>根據(jù)〈1> 〈3>的任一項所述的抗體，其具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性。<5>根據(jù)〈1> 〈4>的任一項所述的抗體，其具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的引誘的活性?！?>根據(jù)〈1>所述的抗體,其具有下述(a) (h)的任一項所述的特征，(a)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號19 21所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號22 24所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。(b)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號25 27所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號28 30所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。(c)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號31 33所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號34 36所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。(d)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號37 39所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號40 42所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。(e)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號43 45所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號46 48所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。 (f)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號49 51所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號52 54所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。(g)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號55 57所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號58 60所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。(h)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號61 63所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號64 66所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。<7>根據(jù)〈1>所述的抗體，其具有下述(a) (h)的任一項所述的特征，(a)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號3所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號4所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。(b)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號5所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號6所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。(C)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號7所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號8所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。
(d)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號9所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號10所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。(e)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號11所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號12所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。(f)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號13所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號14所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。
(g)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號15所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號16所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。(h)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號17所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號18所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。<8>由保藏編號FERM ABP-11377所特定的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。<9>根據(jù)〈1>所述的抗體，其結(jié)合〈7>或〈8>所述的抗體的表位。<10>編碼<1> 〈9>的任一項所述的抗體的DNA。<11>產(chǎn)生〈1> 〈9>的任一項所述的抗體或含有〈10>所述的DNA的雜交瘤?！?2>根據(jù)〈1>所述的抗體的制造方法，包括以下工序(a)制備結(jié)合人TGFa的抗體的工序，(b)由制備的抗體，挑選出與天然型人TGF α比較，與79位的甘氨酸具有突變的人TGFa的反應(yīng)性低的抗體的工序?！?3>根據(jù)〈12>所述的方法，其中，79位的甘氨酸具有突變的人TGF α為G79A置換型的人TGF α。〈14>79位的甘氨酸具有突變的人TGFa。<15>G79A 置換型的人 TGFa。<16>將〈1> 〈9>的任一項所述的抗體作為有效成分的抗癌劑?！?7>根據(jù)〈16>所述的抗癌劑，其中，癌為Ras基因中具有突變的癌。<18>將〈2>、〈3>、<6> 〈8>的任一項所述的抗體作為有效成分的癌的診斷劑?！?9>根據(jù)〈18>所述的診斷劑，其中，癌是Ras基因中具有突變的癌。發(fā)明效果本發(fā)明提供了對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞具有優(yōu)異的增殖抑制效果的抗TGF α抗體。特別地，與79位的甘氨酸具有突變的人TGF α的反應(yīng)性低的抗TGF α抗體共同具有對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞的優(yōu)異的增殖抑制活性。使用本發(fā)明的抗體，則癌的治療成為可能。本發(fā)明的抗體對于對現(xiàn)有藥物抵抗性高的Ras突變癌的治療也有效。另夕卜，本發(fā)明的抗體可應(yīng)用于癌的診斷。


圖1 :顯示在抗TGFa單克隆抗體的取得中使用的免疫原和抗體篩選用抗原的圖。對于免疫原proTGF a-mH(a)及proTGF a-mFc (b)以及抗體篩選用抗TGF a-hFc (c)、proTGF a -hFc (d)及GITR-hFc (e)分別進行SDS電泳并在凝膠上展開，進行CBB染色。mFc顯示小鼠IgG2a的Fe部,hFc顯示人IgGl的Fe部。另外mH表示連續(xù)融合myc與His的標(biāo)簽。(f)顯示瞬時表達膜型TGF α的293Τ細(xì)胞與抗TGF α抗體(R&Dsystems公司)(右)或與作為陰性對照的PBS(_)(左)的反應(yīng)性。設(shè)計了根據(jù)TGFa的表達量，通過熒光蛋白(綠色熒光蛋白GFP，Cell Biolabs公司))發(fā)出熒光。對于二級抗體，使用以藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗IgG抗體。在抗體反應(yīng)細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)的二維展開中，抗體與TGFa反應(yīng)的場合，熒光的點在右上展開(圖1f右)。 圖2 :顯示使用免疫原及篩選用抗原的固相ELISA中，各抗TGF α抗體候補(精制生物素標(biāo)記)的反應(yīng)性的例圖。對于各抗TGFa抗體(精制生物素標(biāo)記)，顯示了通過ELISA檢測4個抗原的反應(yīng)性的結(jié)果。將450nm/620nm的吸光度(縱軸OD值)，從左以GITR-hFc、TGF a -hFc、proTGF a -hFc、proTGF a -mH 順序地排放并作圖。圖3 :顯示對于強制表達膜型TGFa的293T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)分析的各抗TGFa抗體候補(精制抗體)的反應(yīng)性結(jié)果的例圖。在X軸展開通過GFP產(chǎn)生的熒光，在Y軸展開通過抗TGFa抗體和PE標(biāo)記抗小鼠IgG抗體產(chǎn)生的熒光。與陰性對照相比抗體與膜型TGF α反應(yīng)時點移動至右上。圖4 :顯示通過免疫沉淀法檢測針對proTGF a -mH抗原，各抗TGF α抗體候補(雜交瘤上清)的反應(yīng)性的結(jié)果的照片。使用抗myc標(biāo)簽抗體檢測免疫沉淀的抗原。為了確認(rèn)所檢測的帶為proTGF a _mH,在凝膠的右端泳道展開proTGF a -mH。圖5a :顯示對于EGFR高表達癌細(xì)胞A431細(xì)胞中EGFR的酪氨酸磷酸化，各抗TGFa抗體的抑制效果的照片。作為實驗對照，使用TGFa中和抗體克隆189-2130(非專利文獻50)及西妥昔單抗的親本抗體225。顯示p-EGFR通過抗磷酸化酪氨酸EGFR抗體的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果，并顯示了相同試驗?zāi)び每笶GFR抗體對EGFR進行再印跡(reblot)的結(jié)果。圖5b :顯示各抗TGF α抗體對于EGFR高表達癌細(xì)胞A431細(xì)胞中EGFR的酪氨酸磷酸化的抑制效果的圖。作為實驗對照，使用TGFa中和抗體克隆189-2130(非專利文獻50)及西妥昔單抗的親本抗體225。將TGFa未添加時的EGFR的磷酸化水平作為O %、將TGF α添加時的EGFR的磷酸化水平作為100%時，對各實驗條件中EGFR的磷酸化水平的相對值進行作圖。圖6 :顯示通過流式細(xì)胞術(shù)分析針對各種實體腫瘤細(xì)胞株，抗TGF α抗體MBL259-3的反應(yīng)性的結(jié)果圖。作為癌細(xì)胞，使用來源于大腸癌的K-Ras基因同突變(homomutation)細(xì)胞株SW620和來源于肺癌的K-Ras異突變(heteromutation)細(xì)胞株A427。顯示了分別進行以下檢測的結(jié)果在上部圖檢測與作為小鼠同種型對照抗體的小鼠IgG的反應(yīng)性；在下部圖檢測與作為抗TGFa抗體的MBL259-3的反應(yīng)性。
圖7a :顯示檢測移植了肺癌細(xì)胞株A427的小鼠荷瘤模型的由各抗TGFa抗體產(chǎn)生的抗腫瘤活性的結(jié)果的圖。作為對照使用作為EGFR封閉抗體的西妥昔單抗。以X軸表示自抗體投與開始的天數(shù)，Y軸表示腫瘤體積mm3。使用5只小鼠進行實驗，對于全部的小鼠將其腫瘤尺寸的變化繪圖。圖的灰色線表示投與同種型對照的場合的結(jié)果，黑色線表示投與各抗TGF α抗體和投與西妥昔單抗的場合的結(jié)果。圖7b :顯示檢測移植了肺癌細(xì)胞株A427的小鼠荷瘤模型的由各抗TGFa抗體產(chǎn)生的抗腫瘤活性的結(jié)果圖。作為對照使用EGFR封閉抗體的西妥昔單抗。以X軸表示自抗體投與開始的天數(shù)，以Y軸表示腫瘤體積mm3。將抗體投與 第23天的腫瘤尺寸的平均值(5只的平均)示于圖中。圖8a:顯示移植了大腸癌細(xì)胞株SW620的小鼠荷瘤模型的由各抗TGF α抗體產(chǎn)生的抗腫瘤活性。作為對照使用EGFR封閉抗體的西妥昔單抗。X軸表示自投與開始的天數(shù)，Y軸表示腫瘤體積mm3。使用4只小鼠進行實驗，對于全部的小鼠將其腫瘤尺寸的變化繪圖。圖的灰色線表示投與PBS (-)的場合的結(jié)果，黑色線表示投與各抗TGF α抗體及西妥昔單抗·的場合的結(jié)果。圖8b :顯示移植了大腸癌細(xì)胞株SW620的小鼠荷瘤模型的由各抗TGF α抗體產(chǎn)生的抗腫瘤活性。作為對照使用EGFR封閉抗體的西妥昔單抗。X軸表示自投與開始的天數(shù)，Y軸表示腫瘤體積mm3。將抗體投與 第22天的腫瘤尺寸的平均值(4只的平均)繪圖。圖9 :顯示對于三維細(xì)胞培養(yǎng)體系的癌細(xì)胞的各抗TGFa抗體的增殖抑制效果圖。作為癌細(xì)胞，使用通過體內(nèi)試驗確認(rèn)通過本發(fā)明的抗體產(chǎn)生的腫瘤抑制效果的A427和SW620。另外，作為用于確認(rèn)西妥昔單抗的效果的陽性對照使用EGFR高表達細(xì)胞株A431。圖10 :顯示利用了小鼠皮下的血管新生評價體系中，各抗TGFa抗體的抑制效果圖。(a)作為血管新生誘導(dǎo)因子的陽性對照使用VEGF和FGF-2的混合溶液，另外作為血管新生的抑制抗體的陽性對照使用VEGF封閉抗體的貝伐單抗(Bevacizumab)。顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤的熒光強度(左)和顯示將PBS添加時的熒光強度作為I時的相對值(右)。(b)研究TGFa存在下各種抗體的血管新生抑制能力。顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤的熒光強度(左)和顯示將PBS添加時的熒光強度作為I時的相對值(右)。圖11 :對于使用抗TGFa抗體MBL259-3的大腸癌細(xì)胞株SW620以及大腸癌組織切片的免疫組織染色的照片。顯示了對于使用同種型對照的小鼠IgG2a(a)和抗TGF α抗體MBL259-3 (b)的K-Ras基因同突變大腸癌細(xì)胞株SW620 (石蠟包埋)的免疫組織染色圖像。顯示了對于使用(c)MBL259-3的來源于大腸癌(腺癌)患者的癌組織切片(石蠟包埋)的免疫組織染色圖像。圖12a :顯示通過流式細(xì)胞術(shù)(點陣圖顯示)來分析對于氨基酸點置換TGFa的各抗TGFa抗體的反應(yīng)性的結(jié)果圖。(a)將抗體的反應(yīng)性降低的場合的數(shù)據(jù)用四角的框圍住。用三維培養(yǎng)體系或荷瘤小鼠模型顯示對于癌細(xì)胞具增殖抑制效果的MBL009-15至MBL352-34的9個抗體共同通過G79A置換失去反應(yīng)性。另一方面，在沒有確認(rèn)對于癌具增殖抑制效果的TGFa中和抗體189-2130中，通過G79A置換而反應(yīng)性沒有變化，通過H74A置換的反應(yīng)性消失。圖12b :顯示通過流式細(xì)胞術(shù)(柱狀圖顯示)分析189-2130對于氨基酸點置換TGF α的反應(yīng)性結(jié)果的曲線圖。G79A置換保持反應(yīng)性，而H74A置換反應(yīng)性消失。
圖13 :顯示對于將TGFa的多肽片段固相化的板，各抗TGF α抗體的反應(yīng)性圖。各多肽有重疊部分。使用proTGF a -hFc作為抗原抗體反應(yīng)的陽性對照。圖14 :顯示通過流式細(xì)胞術(shù)分析各人型嵌合抗TGFa抗體針對膜型TGF a /293T的反應(yīng)性的結(jié)果圖。圖15 :顯示MBL009-15的可變區(qū)的一級結(jié)構(gòu)的圖。圖16 :顯示MBLO16-8的可變區(qū)的一級結(jié)構(gòu)的圖。圖17 :顯示MBL018-1的可變區(qū)的一級結(jié)構(gòu)的圖。圖18 :顯示MBL144-1的可變區(qū)的一級結(jié)構(gòu)的圖。
圖19 :顯示MBL184-6的可變區(qū)的一級結(jié)構(gòu)的圖。圖20 :顯示MBL259-3的可變區(qū)的一級結(jié)構(gòu)的圖。圖21 :顯示MBL292-1的可變區(qū)的一級結(jié)構(gòu)的圖。圖22 :顯示MBL352-34的可變區(qū)的一級結(jié)構(gòu)的圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供了針對TGFa的抗體，所述抗體是對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞顯示增殖抑制活性的抗體。在本發(fā)明中所謂“對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞顯示增殖抑制活性”，表示在體外和/或體內(nèi)，對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞顯示增殖抑制活性。本發(fā)明的抗體在對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞具增殖抑制活性的范圍，進而，也可對Ras基因中沒有突變的癌細(xì)胞具有增殖抑制活性。體外的活性，例如，使用在凝膠化的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)體系，使Ras基因(例如，K-Ras基因)具有突變的癌細(xì)胞(例如，A427或SW620)增殖，向該培養(yǎng)體系中添加被檢抗體，其后，可通過檢測這些癌細(xì)胞的增殖進行評價(參照實施例5)。另外，體內(nèi)的活性是例如將Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞(例如，A427或SW620)進行皮下移植的裸小鼠，皮下投與被檢抗體，可通過測量其后的腫瘤尺寸進行評價(參照實施例4)。作為具有該活性的抗體，可舉出本實施例所述的MBL009-15、MBL016-8、MBL018-1、MBL023-1、MBL144-1、MBL184-6、MBL259-3、MBL292-1及 MBL352-34。將本發(fā)明的抗體結(jié)合的“人TGF α ”的典型的氨基酸序列(天然型氨基酸序列)以序列編號2表不，其編碼的基因的典型的喊基序列以序列編號1表不。本發(fā)明抗體的優(yōu)選方式是，與天然型人TGF α比較而言，與在79位的甘氨酸具有突變的人TGF α (例如，G79A置換型的人TGFa )的反應(yīng)性低的抗體。本發(fā)明抗體的更優(yōu)選方式，是與在79位的甘氨酸具有突變的人TGF a (例如，G79A置換型的人TGF a )的反應(yīng)性消失的抗體。在本實施例中對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞顯示增殖抑制活性的上述MBL009-15、MBLO16-8, MBLO18-1,MBL023-1、MBL144-1、MBL184-6、MBL259-3、MBL292-1 及 MBL352-34，共同地與 G79A 置換型的人TGFa的反應(yīng)性顯著降低。因此，抗體與在79位的甘氨酸具有突變的人TGF a (例如，G79A置換型的人TGFa )的反應(yīng)性低，與抗體對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞的增殖抑制活性，具有聞的相關(guān)關(guān)系。本發(fā)明抗體的其他優(yōu)選方式，是具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性的抗體。抗體對EGFR的酪氨酸磷酸化的抑制，例如，可如以下那樣進行評價。對于用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的EGFR高表達細(xì)胞(例如，A431)，添加TGFa時EGFR的酪氨酸磷酸化(P_Tyrll73)水平瞬時上升。被檢抗體具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性的場合，預(yù)先使TGFa溶液與被檢抗體反應(yīng)后處理該EGFR高表達細(xì)胞的場合，EGFR的磷酸化水平顯示比陰性對照(例如，PBS)低的值。這樣，與使用陰性對照的場合比較，通過測定使用被檢抗體的場合的EGFR的磷酸化水平，可評價被檢抗體抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性(參照實施例2)。本發(fā)明的抗體，優(yōu)選在抗體添加濃度10 μ g/mL時，將EGFR的酪氨酸磷酸化(P-Tyrl 173)抑制50%以上的抗體，更優(yōu)選地抑制70%以上(例如80%以上、90%以上、100%以上)的抗體。作為具有該活性的抗體，可舉出本實施例所述的MBL352-34、MBL292-1、MBL184-6、MBLO16-8,MBL144-UMBL023-1 及 MBL018-1。本發(fā)明抗體的其他優(yōu)選方式，是具有抑制引誘血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性的抗體。該活性的評價例如可利用小鼠皮下的血管新生評價體系。例如，使用市售的體內(nèi)血管形成分析系統(tǒng)(Directed In Vivo Angiogenesis Assay) (Trevigen 公司)，可將通過人 TGFa 引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞向血管反應(yīng)器內(nèi)的游走作為被檢抗體抑制活性來評價該活性(參照實施例6)。作為具有該活性的抗體，可舉出本實施例所述的MBL009-15、MBLO16-8, MBLO18-1,
MBL023-1、MBL292-1、及 MBL352-34。本發(fā)明的抗體特別優(yōu)選作為兼具多個上述活性的抗體。本發(fā)明抗體的其他優(yōu)選方式，是保持含有本實施例所述的抗體的輕鏈CDRl ⑶R3的輕鏈可變區(qū)、和含有重鏈⑶Rl ⑶R3的重鏈可變區(qū)的抗體或者它們的氨基酸序列變體。具體地說，具有下述(a) (h)的任一項所述特征的抗體?！碝BL009-15〉(a)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號19 21所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號22 24所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。〈MBL016-8〉(b)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號25 27所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號28 30所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。〈MBL018-1〉(c)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號31 33所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號34 36所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。〈MBL1444〉(d)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號37 39所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號40 42所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。〈MBL184-6〉(e)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號43 45所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號46 48所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列?！碝BL259-3〉(f)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號49 51所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或 多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號52 54所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列?！碝BL292-1〉(g)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號55 57所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號58 60所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。〈MBL352-34〉(h)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號61 63所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號64 66所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。本發(fā)明抗體的其他優(yōu)選方式是保持本實施例所述的抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體或者其氨基酸序列變體。具體地說，具有下述(a) (h)的任一項所述特征的抗體。〈MBL009-15〉(a)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號3所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號4所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列?！碝BL016-8〉(b)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號5所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號6所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。〈MBL018-1〉(c)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號7所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號8所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。〈MBL144-1〉(d)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號9所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號10所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。〈MBL184-6〉(e)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號11所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號12所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列?！碝BL259-3〉(f)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號13所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號14所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。〈MBL292-1〉(g)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號15所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號16所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列?！碝BL352-34〉(h)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號17所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號18所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入1個或多個氨基酸的氨基酸序列。本發(fā)明抗體的其他優(yōu)選方式是本實施例所述的MBL023-1抗體。產(chǎn)生該抗體的雜交瘤于2011年4月20日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6 (郵政編號305-8566))，賦予保藏編號FERMABP-11377。因此，MBL023-1抗體，具體地說，是由保藏編號FERM ABP-11377特定的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體。一旦得到上述抗體(例如，本實施例的抗體)的場合，只要是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員，可制作識別該抗體識別的表位的各種抗體。本發(fā)明的“抗體”包含免疫球蛋白的全部類及亞類?！翱贵w”包含多克隆抗體、單克隆抗體，另外，也意在包含抗體的功能性片段的形式?！岸嗫寺】贵w”是包含針對不同的表位不同抗體的抗體制備物。另外，“單克隆抗體”表示由實質(zhì)上均一的抗體的集團得到的抗體(包含抗體片段)。與多克隆抗體進行對照，單克隆抗體是識別抗原上的單一決定基的抗體。本發(fā)明的抗體優(yōu)選單克隆抗體。本發(fā)明的抗體是由自然環(huán)境的成分分離和/或回收的(即，分離的)抗體。本發(fā)明的抗體包含嵌合抗體、人源化抗體、人抗體及這些抗體的功能性片段。將本發(fā)明的抗體作為藥品來投與人的場合，從降低副作用的觀點出發(fā)，優(yōu)選嵌合抗體、人源化抗體或者人抗體。在本發(fā)明所謂“嵌合抗體”，是將某個物種的抗體的可變區(qū)和與其異種的抗體的恒定區(qū)連接的抗體。嵌合抗體，例如，可通過用抗原免疫小鼠，由該小鼠單克隆抗體的基因切出與抗原結(jié)合的抗體可變部(可變區(qū))，與來源于人骨髓的抗體恒定部(恒定區(qū))基因結(jié)合，整合入表達載體、導(dǎo)入宿主來產(chǎn)生而取得(例如，特開平7-194384號公報、專利3238049號公報、美國專利第4816397號公報、美國專利第4816567號公報、美國專利第5807715號公報)。另外，在本發(fā)明中所謂“人源化抗體”，是將來源于非人的抗體的抗原結(jié)合部位 (CDR)的基因序列移植至人抗體基因(CDR移植)的抗體，其制作方法為公知(例如，參照專利2912618號、專利2828340號公報、專利3068507號公報、歐州專利239400號公報、歐州專利125023號公報、國際公開90/07861號公報、國際公開96/02576號公報)。在本發(fā)明中，所謂“人抗體”是全部區(qū)域來源于人的抗體。在人抗體的制作中，通過免疫，有可能利用可生產(chǎn)人抗體的抗體庫的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。人抗體的制作手法為公知(例如，Nature,362 :255-258(1992), Intern. Rev.1mmunol, 13 :65-93 (1995) ；J. Mol. Biol,222 581-597(1991) ；Nature Genetics，15 :146-156 (1997) ；Proc. Natl. Acad. Sc1. USA,97 722-727(2000)、特開平10-146194號公報、特開平10-155492號公報、專利2938569號公報、特開平11-206387號公報、特表平8-509612號公報、特表平11-505107號公報)。在本發(fā)明中所謂抗體的“功能片段”，為抗體的一部分(部分片段)，表示特異性識別人TGFa。具體地可舉出Fab、Fab’、F(ab’)2、可變區(qū)片段(Fv)、二硫鍵合Fv、單鏈Fv(scFv)、sc (Fv) 2、雙功能抗體(Diabody)、多特異性抗體及它們的聚合物等。在這里所謂“Fab”，表示包含I條輕鏈和重鏈的一部分的免疫球蛋白的一價抗原結(jié)合片段。可通過抗體的木瓜蛋白酶消化，另外，可通過重組方法得到?！癋ab’”，包含抗體的鉸鏈區(qū)的I個或比I個要多的半胱氨酸，由于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端的些許殘基的添加，與Fab不同。所謂“F(ab’)2”表示包含兩方的輕鏈和兩方的部分重鏈的免疫球蛋白的二價抗原結(jié)合片段?！翱勺儏^(qū)片段(Fv) ”，是具有完全的抗原識別及結(jié)合部位的最小抗體片段。Fv是重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過非共價鍵較強連結(jié)的二聚體?！皢捂淔v(sFv) ”，包含抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，這些區(qū)域存在于單一的多肽鏈?！皊c (Fv) 2”，通過接頭等使2個重鏈可變區(qū)和2個輕鏈可變區(qū)結(jié)合成為單鏈。所謂“雙功能抗體”是具有二個抗原結(jié)合部位的小的抗體片段，該片段在相同多肽鏈中包含結(jié)合了輕鏈可變區(qū)的重鏈可變區(qū)，各區(qū)域與其他鏈的互補區(qū)域成對?！岸嗵禺愋钥贵w”，是對于至少2個不同的抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。例如，可通過同時表達二個重鏈具有不同特異性的二個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對來制備。
本發(fā)明的抗體包含不減少期望的活性(例如，對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞的增殖抑制活性、與天然型人TGFa或679八置換型的人了6 (!的反應(yīng)性、抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性或抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的引誘的活性)，且其氨基酸序列得以修飾的抗體。本發(fā)明抗體的氨基酸序列變體，可通過向本發(fā)明的編碼抗體鏈的DNA導(dǎo)入突變，或通過肽合成來制作。這樣的修飾例如包含本發(fā)明抗體的氨基酸序列內(nèi)的殘基置換、缺失、添加和/或插入?？贵w的氨基酸序列所改變的部位，只要具有與改變前的抗體同等的活性即可，所述部位可以是抗體的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)，另外，也可以是可變區(qū)(構(gòu)架區(qū)和CDR)。CDR以外的氨基酸的改變，考慮對于與抗原的結(jié)合親和性的影響相對地小，現(xiàn)在，改變CDR的氨基酸，篩選對于抗原的親和力提高的抗體的方法是公知的(PNAS，102 =8466-8471 (2005)，Protein Engineering, Design&Selection, 21 :485-493 (2008)、國際公開第 2002/051870號，J. Biol. Chem. , 280 :24880-24887(2005),· Protein Engineering, Design&Selection,21 :345-351(2008)) οCDR以外氨基酸的所改變氨基酸數(shù)，優(yōu)選10個氨基酸以內(nèi)，更優(yōu)選5個氨基酸以內(nèi)，最優(yōu)選3個氨基酸以內(nèi)(例如，2個氨基酸以內(nèi)、I個氨基酸)。氨基酸的改變優(yōu)選保守置換。在本發(fā)明中所謂“保守置換”，表示用化學(xué)上具有同樣側(cè)鏈的其他氨基酸殘基置換?；瘜W(xué)上具有同樣的氨基酸側(cè)鏈的氨基酸殘基的組在屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域已熟知。例如，可分類為酸性氨基酸(天冬氨酸及谷氨酸)；堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)；在中性氨基酸中，具有烴鏈的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸)、具有羥基的氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸)、含硫氨基酸(半胱氨酸、甲硫氨酸)、具有酰胺基的氨基酸(天冬酰胺、谷酰胺)、具有亞氨基的氨基酸(脯氨酸)、具有芳香基的氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。另外，本發(fā)明抗體的改變例如可以是糖基化部位的數(shù)、位置、種類變化等的抗體的翻譯后加工的改變。由此，例如，可提高抗體的ADCC活性。所謂抗體的糖基化，典型地為N-鍵或O-鍵?？贵w的糖基化，很大依賴于表達抗體所使用的宿主細(xì)胞。糖基化模式的改變可通過有關(guān)糖生產(chǎn)的特定酶的導(dǎo)入或缺失等公知方法進行(特開2008-113663號公報、專利4368530號公報、專利4290423號公報、美國專利第5047335號公報、美國專利第5510261號公報、美國專利第5278299號公報、國際公開第99/54342號公報)。進而，在本發(fā)明中，為了增加抗體的穩(wěn)定性等目的，可通過以其他的氨基酸置換脫酰胺化氨基酸或鄰接于脫酰胺化氨基酸的氨基酸來抑制脫酰胺化。另外，以其他的氨基酸置換谷氨酸，可增加抗體的穩(wěn)定性。本發(fā)明也提供這樣的穩(wěn)定化抗體。本發(fā)明的抗體，如果是多克隆抗體，可通過抗原(TGFa、其部分肽或表達它們的細(xì)胞等)對免疫動物進行免疫，由其抗血清，通過以往的方法(例如，鹽析、離心分離、透析、柱色譜等)，進行精制來取得。另外，單克隆抗體可通過雜交瘤法或重組DNA法來制作。作為雜交瘤法，代表性地可舉出Kohler和Milstein的方法(Kohler &Milstein,Nature, 256 :495 (1975))。該方法的細(xì)胞融合工序中所使用的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，是通過抗原(人TGFa、其部分肽或表達它們的細(xì)胞等)免疫的動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、兔子、猴、山羊)的脾臟細(xì)胞、淋巴節(jié)細(xì)胞、外周血白細(xì)胞等。也可使用從沒有進行免疫的動物預(yù)先分離的上述細(xì)胞或者淋巴細(xì)胞等使抗原在培養(yǎng)基中進行作用而得到的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。對于骨髓瘤細(xì)胞可使用公知的各種的細(xì)胞株?？贵w產(chǎn)生細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞，如果它們可融合，則可以是不同的動物種起源的細(xì)胞，優(yōu)選相同的動物種起源的細(xì)胞。雜交瘤，例如，通過用抗原免疫的小鼠得到的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞之間的細(xì)胞融合來產(chǎn)生，通過其后的篩選，可得到產(chǎn)生對于人TGFa特異性的單克隆抗體的雜交瘤。針對人TGFa的單克隆抗體，通過培養(yǎng)雜交瘤，另外，可通過投與了雜交瘤的哺乳動物的腹水來取得。重組DNA法是將編碼上述本發(fā)明的抗體或肽的DNA自雜交瘤或B細(xì)胞等克隆化，整合入適當(dāng)?shù)妮d體中，將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞(例如哺乳類細(xì)胞株、大腸桿菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞等)中，作為重組抗體產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法(例如,P. J. Delves, AntibodyProduction Essential Techniques,1997WILEY ；P.Shepherd and C. Dean MonoclonalAntibodies,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS ；Vandamme A. M.等，Eur.J.Biochem. 192 :767-775 (1990))。對于編碼本發(fā)明抗體的DNA的表達，可通過分別將編碼重鏈或輕鏈的DNA整合入表達載體來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，也可通過將編碼重鏈及輕鏈的DNA整合入單一的表達載體來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(參照國際公開94/11523號公報)。培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞，由宿主細(xì)胞內(nèi) 或培養(yǎng)液進行分離、精制，能夠以實質(zhì)上純粹且均一的形式取得本發(fā)明的抗體。可使用在通常的多肽的精制中所使用的方法實施抗體的分離、精制?？墒褂棉D(zhuǎn)基因動物制作技術(shù)制作植入了抗體基因的轉(zhuǎn)基因動物(牛、山羊、綿羊或豬等)，由該轉(zhuǎn)基因動物的奶，大量取得來源于抗體基因的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了編碼上述本發(fā)明的抗體或肽的DNA ;包含該DNA的載體；保持該DNA的宿主細(xì)胞；及包括培養(yǎng)該宿主細(xì)胞并回收抗體的抗體的生產(chǎn)方法。由上述，在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，抗人TGFa抗體中，與79位的甘氨酸具有突變的人TGFa (例如，679八置換型的人了6 (!)的反應(yīng)性低，與對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞的增殖抑制活性，具有高的相關(guān)關(guān)系。根據(jù)該認(rèn)識，通過挑選與天然型人TGFa進行比較，與79位的甘氨酸具有突變的人TGFa (例如，G79A置換型的人TGFa)的反應(yīng)性低的抗體，可制造對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞顯示增殖抑制活性的抗人TGFa抗體。因此，本發(fā)明還提供對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞顯示增殖抑制活性的抗人TGFa抗體的制造方法，所述方法包括以下工序(a)制備與人TGFa結(jié)合的抗體的工序；和(b)由制備的抗體，挑選出與天然型人TGFa相比，與79位的甘氨酸具有突變的人TGFa的反應(yīng)性低的抗體的工序。天然型人TGF α或79位的甘氨酸具有突變的人TGF a (例如，G79A置換型的人TGF a )與抗體的反應(yīng)性，例如，制備使各TGF α在表面表達的293T細(xì)胞，可通過用流式細(xì)胞術(shù)分析該細(xì)胞與被檢抗體的反應(yīng)性來評價(參照實施例7)。進而，本發(fā)明還提供在這樣的抗人TGFa抗體的制造方法中有用的79位甘氨酸具有突變的人TGF a (例如，G79A置換型的人TGF a )。本發(fā)明的抗體由于對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞具有增殖抑制活性，可作為抗癌劑利用。因此，本發(fā)明還提供癌的治療方法，所述方法包括將本發(fā)明的抗體作為有效成分的抗癌劑及將本發(fā)明的抗體以治療有效量投與包含人的哺乳類的工序。本發(fā)明的治療方法，除了人以外，例如，還可應(yīng)用于包含狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔子等各種哺乳動物。本發(fā)明的抗體，在對于現(xiàn)有藥物抵抗性高的Ras突變癌的治療中有效。將本發(fā)明的抗體作為有效成分的抗癌劑，可以本發(fā)明的抗體與任意的成分，例如含有生理食鹽水、葡萄糖水溶液或磷酸鹽緩沖液等的組合物的形式來使用。本發(fā)明的抗癌齊U，可根據(jù)需要以液體或冷凍干燥的形式來制形化，也可含有任意藥學(xué)上允許的載體或者介質(zhì)，例如，穩(wěn)定化劑、防腐劑、等滲劑等。
作為藥學(xué)上允許的載體，在冷凍干燥的制劑的場合，可例舉甘露醇、乳糖、蔗糖、人白蛋白等，在液狀制劑的場合，可例舉生理食鹽水、注射用水、磷酸鹽緩沖液、氫氧化鋁等，但不限定于這些。本發(fā)明的抗癌劑的投與方法，根據(jù)投與對象的年齡、體重、性別、健康狀態(tài)等而不同，可通過經(jīng)口投與、非經(jīng)口投與(例如，靜脈投與、動脈投與、局部投與)的任一種投與途徑來投與。優(yōu)選的投與方法為非經(jīng)口投與。本發(fā)明的抗癌劑的投與量，根據(jù)患者的年齡、體重、性別、健康狀態(tài)、癌的進行程度及投與的抗癌劑的成分而變動，一般地在靜脈內(nèi)投與的場合，成人每IKg體重為I日O.1 IOOOmg,優(yōu)選I lOOmg。本發(fā)明的抗體不僅用于癌的治療，也可考慮用于癌的診斷。由本發(fā)明人們所發(fā)現(xiàn)的，與天然型人TGFa進行比較，與79位的甘氨酸具有突變的人TGF a (例如，G79A置換型的人TGFa)的反應(yīng)性低的抗體，特別在Ras基因中具有突變的癌的診斷中有用。在癌的診斷中使用本發(fā)明抗體的場合或者用于癌的檢測的場合，本發(fā)明的抗體也可以是標(biāo)記的抗體。作為標(biāo)記，例如，可使用放射性物質(zhì)、熒光色素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、酶、輔酶，具體地可舉出放射性同位素、熒光素、若丹明、丹磺酰氯、螢光素酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、溶菌酶、生 物素/抗生物素蛋白等。對于將本發(fā)明的抗體作為診斷劑進行調(diào)劑，可采用符合目的任意手段并以任意的劑型來得到它們。例如，對于精制的抗體測定其抗體價，適當(dāng)?shù)赜肞BS(含有生理食鹽的磷酸緩沖液)等稀釋后，可添加O.1 %疊氮化鈉等作為防腐劑。另外，例如，對于膠乳等吸附本發(fā)明抗體的物質(zhì)，也可來求抗體效價，適當(dāng)?shù)剡M行稀釋，添加防腐劑來使用。實施例以下，根據(jù)實施例及比較例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于以下實施例。[材料及方法]1.抗TGFa單克隆抗體的制作方法(I)免疫原以及抗體篩選用抗原的制備為了獲得針對TGFa的小鼠單克隆抗體，制備了以下2個免疫原。第一個免疫原是如下制備的，將對應(yīng)于人TGFa的氨基酸序列第24位 第89位(堿基序列第70位 第267位)的基因自胎盤cDNA文庫通過PCR法擴增，將得到的PCR產(chǎn)物克隆入動物培養(yǎng)細(xì)胞表達載體pSecTag2 (Invitrogen公司)，進而將包含來源于pSecTag2的前導(dǎo)序列(leader sequence)的人TGF α (堿基序列第70位 第267位)亞克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP(TakaraBio公司)。設(shè)計載體以在TGFa的C末側(cè)連續(xù)融合有作為標(biāo)記的myc和His。使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000 (Lipofectamine 2000) 一同將制作的載體和env載體(pVSVG)基因?qū)胫磷鳛椴《景b細(xì)胞的GP293細(xì)胞中。接著使用由培養(yǎng)上清得到的病毒液感染293T細(xì)胞，得到TGFa穩(wěn)定產(chǎn)生細(xì)胞株。將10天培養(yǎng)后得到的上清通過填充了TALON樹脂(TakaraBio公司)的柱，用10倍量樹脂的5mM含有咪唑的結(jié)合緩沖液洗滌柱后，以IOOmM的咪唑溶液將結(jié)合物洗脫。以PBS過夜透析后，對于一部分洗脫物進行SDS電泳，在分子量19-22KDa附近確認(rèn)目的帶(圖1a)，將其作為免疫原(以下，將該免疫原稱為proTGF a -mH)。第二個免疫原是如下制備的，將對應(yīng)于人TGF α的氨基酸序列第I位 第89位(堿基序列第I位 第267位)的基因自胎盤cDNA文庫通過PCR法擴增，克隆入pCAGGS (由大阪大學(xué)大學(xué)院醫(yī)學(xué)系研究科教授宮崎純一先生轉(zhuǎn)讓。Gene (1991) 108 (2)193-199)。設(shè)計載體以在3’側(cè)融合了小鼠免疫球蛋白G2a的Fe部基因。使用作為基因?qū)朐噭┑闹|(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000 (Invitrogen公司)導(dǎo)入人培養(yǎng)細(xì)胞293T中，通過離心操作回收其培養(yǎng)上清用。根據(jù)制品說明書添加質(zhì)粒DNA的量、細(xì)胞數(shù)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺的量。將得到的上清通過填充了蛋白G珠(GE公司)的柱，用10倍珠量的結(jié)合緩沖液洗滌柱后，用pH2. 3的甘氨酸鹽酸溶液洗脫柱吸附物。用PH8. O的Tris-HCl緩沖液迅速中和后，用PBS過夜透析。對于提取物的一部分進行SDS電泳，在分子量40-44KDa附近確認(rèn)目的單帶(圖1b)，將其作為免疫原(以下，將該免疫原稱為proTGF a -mFc)。另外，為了制備用于確認(rèn)得到的抗體與TGFa的反應(yīng)性的篩選用抗原，構(gòu)建下述4個表達載體。在第一個載體中，將對應(yīng)于人TGF α的氨基酸序列第40位 第89位(堿基序列第118位 第267位)的成熟型TGFa的基因自胎盤cDNA文庫通過PCR法擴增，將得到的PCR產(chǎn)物克隆入動物培養(yǎng)細(xì)胞表達載體pSecTag2后，將包含來源于pSecTag2的前導(dǎo)序列的人TGF α (堿基序列第118位 第267位)亞克隆入pcDNA3.1載體(Invitrogen公司)。設(shè)計載體以在TGFa的C末側(cè)融合有人免疫球蛋白Gl的Fe部的基因(以下，將通過該表 達載體制備的抗原稱為TGF a -hFc)。在第二個載體中，將對應(yīng)于人TGF α的氨基酸序列第I位 第89位(堿基序列第I位 第267位)的基因自胎盤cDNA文庫通過PCR法擴增，將得到的PCR產(chǎn)物克隆入動物培養(yǎng)細(xì)胞表達載體pcDNA3.1。設(shè)計載體以在TGFa的C末側(cè)融合有人免疫球蛋白Gl的Fe部(以下，將通過該表達載體制備的抗原稱為proTGF a -hFc)。作為第三個載體，為了研究針對人免疫球蛋白Gl的Fe部的抗體的非特異反應(yīng)，構(gòu)建融合了人GITR的細(xì)胞外區(qū)域的部分長基因序列(第1-495位堿基)和人免疫球蛋白Gl的Fe部基因的載體pcDNA-GITR-hFc (以下，將通過該表達載體制備的抗原稱為GITR-hFc)。將各表達載體通過脂質(zhì)體導(dǎo)入人培養(yǎng)細(xì)胞293T，于3-4日后回收培養(yǎng)上清。按照上述的免疫原制備法實施培養(yǎng)上清中所含有的抗體篩選用抗原TGFa -hFc、proTGF a -hFc以及GITR-hFc的回收、精制(圖lc-e)。以研究與在細(xì)胞表面表達的膜型TGF α的反應(yīng)性為目的構(gòu)建了第四個表達載體。將對應(yīng)于人TGF α的氨基酸序列第I位 第160位(堿基序列第I位 第480位)的基因克隆入動物細(xì)胞表達載體pcDNA3.1。設(shè)計載體以在TGFa基因的3’側(cè)連接有核糖體進入位點IRES以及熒光蛋白GFP(Cell Biolabs公司)的基因(以下，將該表達載體稱為PDIG-TGF α )。該表達載體的特征是在通過脂質(zhì)體瞬時導(dǎo)入293T細(xì)胞時，僅表達膜型TGF α的細(xì)胞具有發(fā)出GFP的熒光這樣的結(jié)構(gòu)。使該細(xì)胞與一級抗體以及PE標(biāo)記的二級抗體反應(yīng)后，用流式細(xì)胞術(shù)二維展開時，在發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的場合，僅發(fā)出GFP熒光的細(xì)胞得到在右上點移動的數(shù)據(jù)(圖1f)(以下，將瞬時導(dǎo)入了該表達載體的293Τ細(xì)胞稱為 TGF α /293Τ)。(2)免疫原的免疫和雜交瘤的建立作為免疫原單獨使用proTGF a-mFc或者使用proTGF a-mFc和proTGF a-mH。在這些溶液中等量混合弗氏完全佐劑(Complete Freund’ sAdjuvant)后,對于BALB/c系統(tǒng)、C57BL/6系統(tǒng)、C3H系統(tǒng)以及MRL系統(tǒng)的小鼠計60只進行每周2次、共計6 8次的免疫。最終投與后至第3天由免疫小鼠摘出脾臟或者淋巴節(jié)，由組織內(nèi)部采取淋巴細(xì)胞?；旌献鳛樾∈蠊撬枇黾?xì)胞株P(guān)3U1回收的淋巴細(xì)胞，以RPMI培養(yǎng)基(Sigma公司)洗滌2次后，向細(xì)胞沉淀等量添加以RPMI稀釋至50%的聚乙二醇4000溶液(和光純藥公司)。抽吸細(xì)胞懸浮液I分鐘后，用20倍量的RPMI洗滌細(xì)胞3次。其后，將細(xì)胞用含有15%牛血清(Extech公司)、2% HAT (Invitrogen公司)、1/100量的BM培養(yǎng)基(Roche公司)、終濃度5ng/mL的鏈霉素和青霉素的RPMI培養(yǎng)基懸浮，接種至96孔板中并在37度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。接種 第5天將培養(yǎng)液換成新鮮培養(yǎng)基，然后繼續(xù)5天的培養(yǎng)。(3)抗體篩選1:抗原固相ELISA接種 第10天由雜交瘤增加的孔回收培養(yǎng)上清，使用以篩選用抗原proTGF a -hFc O. 2 μ g/孔量固相化的96孔板,進行酶免疫測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)(以下，稱為 ELISA)。將 ELISA 發(fā)色的 OD 值(450nm/620nm 吸光度)為O. 2-0. 5以上的上清判斷為一次陽性，選擇1007種類的雜交瘤。將陽性雜交瘤 移至24孔板
進一步培養(yǎng)3天。(4)抗體篩選2 :流式細(xì)胞術(shù)使用使293T細(xì)胞瞬時地表達全長TGFa的TGF a/293T細(xì)胞，通過下述的方法來進行對于上述的24孔板上清的流式細(xì)胞術(shù)分析。對于雜交瘤上清I樣品50 μ L，使IxlO5個細(xì)胞數(shù)的TGF a /293T于4度反應(yīng)60分鐘。用含有2mM EDTA和O. 5% BSA的PBS洗滌細(xì)胞后，與PE標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(MBL公司)于4度反應(yīng)30分鐘。進而，以400xg離心洗滌細(xì)胞后，將細(xì)胞沉淀懸浮于500 μ L的含有2mM EDTA和O. 5 % BSA的PBS中，通過流式細(xì)胞儀(FC500, BecmannCoulter公司)進行分析。(5)抗體篩選3 :免疫沉淀法對于以流式細(xì)胞術(shù)顯示與膜型TGFa的反應(yīng)性的雜交瘤上清進一步以proTGF a -mH為抗原通過以下方法進行免疫沉淀。每I雜交瘤回收700 μ L的培養(yǎng)上清，添加15 μ L的蛋白G瓊脂糖(GE公司)后，于4度攪拌的同時過夜反應(yīng)。向以PBS洗滌瓊脂糖4次得到的瓊脂糖沉淀中添加ImL的3 μ g/mLproTGF a -mH,于4度過夜攪拌反應(yīng)。向PBS洗滌后得到的瓊脂糖沉淀添加與沉淀等量的SDS樣品緩沖液后，進行10分鐘的煮沸，得到其上清。以每15 μ L量應(yīng)用于15% SDS電泳用凝膠。使用市售的抗myc抗體(MBL公司)和抗TGFa多克隆抗體(R&D systems公司)作為免疫沉淀的陽性對照抗體。另外，同時應(yīng)用proTGF a -mH作為免疫印跡的陽性對照。進行SDS電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，用含有5%脫脂奶的PBS室溫I小時封閉處理膜。檢測用抗體使用稀釋500倍的抗myc抗體(MBL公司)，與PVDF膜室溫反應(yīng)I小時。用含有0. 05%吐溫20的PBS (以下，稱為洗滌液)洗滌膜后，使用市售的化學(xué)發(fā)光底物(Milipore公司)進行目的條帶的檢測(圖4)。自抗原固相ELISA、流式細(xì)胞術(shù)以及免疫沉淀的結(jié)果挑選雜交瘤上清，通過極限稀釋法進行雜交瘤的單克隆化。為了確認(rèn)精制抗體與TGFa的反應(yīng)性，圖2顯示研究與使用GITR-hFc、TGF a -hFc、proTGF a -hFc 及 proTGF a -mH(各 0· 2 μ g/ 孔量)固相化的 ELISA板的精制抗體(生物素標(biāo)記)的反應(yīng)性的數(shù)據(jù)的一部分。確認(rèn)了陰性對照GITR-hFc的OD值為O.1以上不反應(yīng)，TGF a -hFc,proTGF a -hFc及proTGF a -mH在OD值為O. 5以上反應(yīng)。圖3顯示通過流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)針對TGF a /293T細(xì)胞的精制抗體的反應(yīng)性的結(jié)果。各抗體的同種型使用IsoStrip試劑盒(Roche公司)來確定。其結(jié)果，將39種雜交瘤產(chǎn)生的單一抗體作為抗TGFa單克隆抗體列表，用于以后的實驗(表I)。[表 I]
權(quán)利要求
1.針對人TGFa的抗體，其是對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞顯示增殖抑制活性的抗體。
2.抗體，其是與79位的甘氨酸具有突變的人TGFa的反應(yīng)性低于與天然型人TGFa的反應(yīng)性的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體，其中，79位的甘氨酸具有突變的人TGFa是G79A置換型的人TGF a。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的抗體，其具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項所述的抗體，其具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)的活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其具有下述(a) (h)的任一項所述的特征， (a)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號19 21所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號22 24所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (b)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號25 27所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號28 30所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (c)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號31 33所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號34 36所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (d)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號37 39所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號40 42所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (e)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號43 45所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號46 48所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (f)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號49 51所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號52 54所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (g)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號55 57所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號58 60所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (h)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號61 63所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號64 66所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其具有下述(a) (h)的任一項所述的特征， (a)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號3所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號4所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (b)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號5所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號6所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (c)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號7所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號8所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (d)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號9所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號10所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (e)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號11所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號12所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (f)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號13所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號14所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (g)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號15所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號16所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列； (h)保持有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含序列編號17所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含序列編號18所述的氨基酸序列或該氨基酸序列中置換、缺失、添加和/或插入I個或多個氨基酸的氨基酸序列。
8.抗體，其是由保藏編號FERMABP-11377所特定的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其與權(quán)利要求7或8所述的抗體的表位結(jié)合。
10.DNA，其編碼權(quán)利要求1 9中任一項所述的抗體。
11.雜交瘤，其是產(chǎn)生權(quán)利要求1 9中任一項所述的抗體的雜交瘤，或是含有權(quán)利要求10所述的DNA的雜交瘤。
12.權(quán)利要求1所述的抗體的制造方法，其包括以下工序 (a)制備與人TGFa結(jié)合的抗體的工序， (b)由制備的抗體，挑選出與79位的甘氨酸具有突變的人TGFa的反應(yīng)性低于與天然型人TGF a的反應(yīng)性的抗體的工序。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，79位的甘氨酸具有突變的人TGFa是G79A置換型的人TGF a。
14.79位的甘氨酸具有突變的人TGF a。
15.679々置換型的人了6 0。
16.抗癌劑，其以權(quán)利要求1 9中任一項所述的抗體作為有效成分。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗癌劑，其中，癌是Ras基因中具有突變的癌。
18.癌的診斷劑，其以權(quán)利要求2、3、6 8中任一項所述的抗體作為有效成分。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的診斷劑，其中，癌是Ras基因中具有突變的癌。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了在顯示與天然型TGFα的反應(yīng)性的抗體中，與G79A置換型TGFα的反應(yīng)性低的抗體對Ras基因中具有突變的癌細(xì)胞具有優(yōu)異的增殖抑制效果。本發(fā)明進一步發(fā)現(xiàn)了，這些抗體中的很多抗體也具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性和/或抑制引誘血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性。
文檔編號A61K39/395GK103003424SQ20118002451
公開日2013年3月27日 申請日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者金田誠, 藤井慶宏, 早田芳弘, 岸義朗, 矢原一郎 申請人:株式會社醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所