專利名稱：具有改善的底物特異性的pqq-依賴性葡萄糖脫氫酶的新變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的主題是PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶(sPQQGDH)，它們的生產(chǎn)和鑒別方法， 編碼根據(jù)本發(fā)明的sPQQGDH的基因，生產(chǎn)該基因的載體，以及包含根據(jù)本發(fā)明的葡萄糖脫 氫酶的葡萄糖傳感器。
背景技術(shù)：
葡萄糖的酶測定在醫(yī)學(xué)診斷中是非常重要的。這里，檢測尿或血液中的葡萄糖以 診斷或監(jiān)測代謝性疾病的進展是必需的。在糖尿病(也稱為糖尿病)的情況中，每天可能 需要多次測定血糖濃度。這可以通過市場上絕大多數(shù)的計量器通過酶方法實現(xiàn)，在酶方法 中葡萄糖被氧化，由此得到的氫(2H+和2e_)進行電流分析定量(P. Vadgama, J. Med. Eng Technol. 5 [6]，293-298 (1981)，K. S. Chua 和 I. K. Tan，Clin. Chem. 24 [1]，150-152 (1978))。存在許多適合這種目的的各種酶，但是這些酶與各種輔助因子共同作用進行電子 的主要接收，并且還具有不同的生化性質(zhì)諸如特異性、穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)換率。酶的轉(zhuǎn)換率通常以 活性單位(U)進行報道；在葡萄糖-氧化酶的情況中，比活性(U/mg)通常是指在確定的反 應(yīng)條件下每分鐘被1毫克酶氧化的以微摩爾計的葡萄糖的量。通常使用的酶為葡萄糖脫氫酶(⑶H)。在NAD(P)+-依賴性⑶H的情況中，輔助因 子為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或煙酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADP+) (H. E. Pauly 和 G. Pfleiderer,Hoppe Seylers. Z. Physiol Chem. 356 [10]，1613-1623 (1975))，二 者均為相當(dāng)不穩(wěn)定的必須添加到反應(yīng)中的化合物，因為它們不與酶結(jié)合。另一類葡萄糖脫氫酶含有作為電子受體與酶結(jié)合的吡咯并喹啉醌(PQQ)。已 經(jīng)描述了這種類型中兩種結(jié)構(gòu)相互不同的葡萄糖脫氫酶膜錨定型，mPQQGDH (A. M Cleton-Jansen 等，J. Bacteriol. 170 [5]，2121-2125 (1988))，和較小的可溶型，sPQQ⑶H (A.M. Cleton-Jansen 等，Mol. Gen. Genet. 217 [2-3], 430-436 (1989))。由于后者的高 比活性、其對氧的不敏感性以及緊密地結(jié)合，其為穩(wěn)定的輔助因子，為特別適合生產(chǎn)用于葡 萄糖測定的測試系統(tǒng)的酶。因此在許多商品化的血糖計量器中，使用這種酶，盡管與提到的 其他酶相比，這種酶顯示更低的底物特異性。由于最后提到的限制，當(dāng)然希望擁有具有更高 底物特異性的這種酶的變體。除了底物葡萄糖外，sPQQGDH還將其他糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的內(nèi)酯，優(yōu)選二糖，其中還原 糖為葡萄糖，但也有其他還原糖。由于這種糖正常不存在于人的血液中，基于sPQQGDH的 酶測試通常得到對應(yīng)于葡萄糖濃度的結(jié)果。然而，某些醫(yī)學(xué)治療包含施用物質(zhì)，該物質(zhì)的 一種分解產(chǎn)物為麥芽糖，麥芽糖被sPQQGDH氧化并且因此不希望地影響測量結(jié)果(T.G. Schleis, Pharmacotherapy 27 [9]，1313-1321 (2007))。在診斷方法中或者作為藥物的佐 劑施用木糖和半乳糖時，測定這些糖自身。因此以適當(dāng)?shù)姆绞揭种苨PQQGDH的輔助活性是 有意義的。
在文獻以及在專利說明書中，描述了許多通過引入突變來改善sPQQGDH的底物特 異性的嘗試(S. Igarashi等，Biomol. Eng 21 [2],81-89 (2004))。為此，在酶的催化位 點(EP1666586A1)以及在其他位點(US7132270B2)的區(qū)域內(nèi)的單個氨基酸通過定向誘變被 其他氨基酸取代，或者通過插入來插入單個氨基酸(EP1367120A2)。此外，描述了各種突變 的組合(EP1666586A1，US7132270B2)。另外，已經(jīng)描述了在sPQQGDH的一個位點插入兩個氨 基酸的變體。然而，結(jié)果沒有獲得底物特異性的顯著改善(W02006085509)。盡管存在這些結(jié)果，但仍然需要sPQQGDH的變體，因為至今還未描述過在與葡萄 糖足夠高的反應(yīng)性下能夠充分識別葡萄糖和其他糖的變體。這里重要的是，更特別地，即使 在葡萄糖和其他糖的混合物的存在下，酶使葡萄糖濃度可靠地測定的能力。所描述的變體 沒有充分地顯示這種性質(zhì)
發(fā)明內(nèi)容
考慮到現(xiàn)有技術(shù)，因此本發(fā)明的目的是提供使可靠的葡萄糖測 定成為可能的葡萄 糖脫氫酶，即使在葡萄糖和其他糖的混合物的存在下。更特別地，本發(fā)明的目的是提供葡萄 糖脫氫酶，使用該葡萄糖脫氫酶可以在麥芽糖的存在下可靠地測定葡萄糖。此外，本發(fā)明的 目的是提供可以生產(chǎn)和鑒別這種葡萄糖脫氫酶的方法，在其他糖的存在下，更特別地在麥 芽糖的存在下，該葡萄糖脫氫酶特別適合用于葡萄糖的測定?，F(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，在底物結(jié)合區(qū)域的范圍內(nèi)插入3-5個氨基酸的sPQQ葡萄糖脫 氫酶，與酶的原型相比顯示改善的葡萄糖特異性。因此，本發(fā)明的主題是與酶的原型相比具有改善的葡萄糖特異性的SPQQ葡萄糖 脫氫酶，其特征在于，在底物結(jié)合區(qū)域的范圍內(nèi)插入3-5個氨基酸?？梢酝ㄟ^所述的天然存在的野生型菌株通過誘變獲得的基因編碼根據(jù)本發(fā)明的 sPQQGDH，諸如醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus) LMD 79.41 (K. Kojima K.等，Biotechnology Letters 22,1343-1347 (2000))，以及不動桿菌(Acinetobacter) 屬的其他菌株(P. J. Bouvet P.J.和 0·Μ· Bouvet, Res. Microbiol. 140 [8], 531-540 (1989))，更特別地具有增強的熱穩(wěn)定性的那些，諸如在EP1623025A1中描述的不動桿菌屬 菌株。優(yōu)選的菌株為EP1623025A1中描述的不動桿菌屬菌株P(guān)T16、K0Z62、K0Z65、PTN69、 KG106、PTN26、PT15、KGN80、KG140、KGN34、KGN25 和 KGNlOO ；更特別優(yōu)選的是菌株 K0Z65。為了能夠獲得根據(jù)本發(fā)明的sPQQGDH，密碼子必須插入到對應(yīng)于適合這種方式的 sPQQGDH基因中的底物結(jié)合位點的位置。許多sPQQGDH的空間結(jié)構(gòu)是已知的并且儲存于 公共數(shù)據(jù)庫中(A. Oubrie 等，J. Mol. Biol. 289 [2]，319-333 (1999) ；A. Oubrie 等， EMBO J. 18 [19] ,5187-5194 (1999))。因此，可以估算各個氨基酸位置與結(jié)合底物的距 離。這種估算，例如，可能使用蛋白質(zhì)的可視化程序，諸如由互聯(lián)網(wǎng)上可以獲得的軟件程 Ιψ Cn3D(http//www. ncbi. ηlm. nih. gov/Structure/CN3D/cn3d. shtml)。 & Jf 的 X—身寸 線結(jié)構(gòu)的序列是基于醋酸鈣不動桿菌的sPQQGDH，其長度為455個氨基酸。更優(yōu)選的來 自菌株K0Z65的sPQQGDH的原型具有456個氨基酸，就像鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)的酶一樣。在兩種情況中，這樣的原因是由于位置289之后其他的谷氨酰胺殘 基。以下是與更短的、在X-射線結(jié)構(gòu)中所用的sPQQGDH序列有關(guān)的各個氨基酸位置的細節(jié)， 所述sPQQGDH來源于菌株醋酸鈣不動桿菌LMD 79.41。據(jù)報道位于那里的氨基酸在該位置前面的氨基酸的單字母密碼中。距離底物不大于5埃的氨基酸區(qū)域，諸如，例如，位置076、0143、0168、￥343和各 自鄰近的氨基酸殘基，對于誘變而言是優(yōu)選的。因此，3個或更多個氨基酸的插入可以，例 如，在一個特定的位置之前或之后出現(xiàn)，以便改變底物結(jié)合位點的空間結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選的是在 位置Q168和L169之間的其他氨基酸的插入。在該位點具有插入的K0Z65的變體主要令人 驚奇地表現(xiàn)出，與葡萄糖相比大比例的顯著降低的對麥芽糖的活性。特別優(yōu)選的是在位置 Q168和L169之間具有表1所列的插入序列的sPQQGDH。作為比較，野生型顯示于第一行中。 如表1所概述，根據(jù)本發(fā)明的sPQQGDH具有增加的底物特異性(更低的麥芽糖/葡萄糖比和 葡萄糖/麥芽糖混合物中更低的葡萄糖干擾值)。表 1:
SEQ ID起葡萄糖比Mfl: [U/ragj(IMO it, Κ:<·] W性的比HA (5 irt Il 萄ff!.++ S ill麥身糖》wl-GDH K02653000mo63514S-t -E10AYQ12407,45I45-20-E7AWL213110,5-45146-OS-EtAFV32366.55I46-I0-E4GYl43515J-93SIil-Of-GOAYV57J85.45I81-13-A12AFQ618813.7-15.75138-11-Λ 2AGRM7!Ol9 515.55152-21-EICLAVI16611.7-20.75I52-20-A7MGRFL953079S5.65381-05-C4VSTFF102649.51.2 i53S1-06-C12VSKNH(1229IO3.8 ‘53SI-0 -F!0SSRNH122039.54.25381-09-AllSGRIL134116.65.35386-08-D10VGRLT142726.45 75386-O-F10AERNY15IlO7,60.25386-19-09MESHN16EK8.27.853M-15-C8VGHVT172966,23.i5388-19-F3VGRYQIS1S87.34J
本發(fā)明的主題還進一步是用于生產(chǎn)和鑒別sPQQGDH的方法，所述sPQQGDH與野生型相 比顯示增強的底物特異性。通過定域隨機誘變，根據(jù)本發(fā)明的方法可以生成多種變體，該變 體在sPQQGDH序列的所需位點具有3個、4個、5個或更多個插入的氨基酸。將生成的酶進行底物特異性篩選，選擇最好的變體。根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于，在第一步中生產(chǎn)載體，在該載體中在所需插入位 點之前和之后的合適序列區(qū)域已經(jīng)被刪除并且被該載體的獨特限制位點所替代。在第二 步中向使用該限制性內(nèi)切酶開放的載體-DNA中插入雙鏈寡核苷酸序列，以便得到基因產(chǎn) 品，所述雙鏈寡核苷酸序列通過PCR擴增生產(chǎn)并且除了載體中刪除的序列外還含有所需的 插入，所述基因產(chǎn)品除了在所需位點的3個或更多個氨基酸的插入外，對于其氨基酸序列， 不含有其他改變。借助PCR由合成的寡核苷酸生產(chǎn)的待插入的雙鏈片段含有3個或更多 個用于改變底物特異性的其他隨機密碼子，以及載體中刪除的密碼子。為此所選擇的密 碼子可以特別好地表達于E. coli.中。因此除了插入?yún)^(qū)域外，該核苷酸序列與K0Z65的 sPQQGDH-基因的核苷酸序列不同，而不是與氨基酸序列不同。使用3個其他氨基酸的插入時，8000個酶變體是可能的；在使用4個其他氨基酸 時，數(shù)量為160,000 ；和在使用5個其他氨基酸時，存在320萬個變體。因此除了完全隨機 的序列，誘變的寡核苷酸的合成可以利用，諸如在某些或所有位置含有對于每個待插入氨 基酸的簡并密碼子的序列?？梢赃@樣使用以便減少所有可能性的數(shù)量，避免終止密碼子或 有利于特定位置的個別氨基酸。在根據(jù)本發(fā)明方法的第三步中，將以如上所述方式生產(chǎn)的重組載體轉(zhuǎn)換到合適的 宿主細菌中，并且該宿主細菌在合適的生長培養(yǎng)基中增殖。由微生物克隆基因的方法和它 們在另外的宿主中的表達以及分離和改變核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見， 例如，Molecular Cloning - A Laboratory Manual ；第 1 卷；Sambrook, J.禾口 Russel, D. W.；第3版，CSHL Press 2001)。培養(yǎng)微生物和從其中純化重組體酶也是本領(lǐng)域已知的 (參見同上；第3卷)。在根據(jù)本發(fā)明方法的第四步中，測試菌落對各種糖的活性，由此鑒別出最好的。根 據(jù)本發(fā)明，本文不但完成了對各種糖的活性的測試，而且還完成了各種糖的干擾的測試。可以以比活性測定該活性，即，每時間單位通過確定量的酶轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)換率。在葡萄 糖氧化酶的情況中，比活性(U/mg)通常是指在確定的反應(yīng)條件下每分鐘被1毫克酶氧化 的以微摩爾計的葡萄糖的量。相對于酶，葡萄糖通常是過量存在的，以便消除葡萄糖濃度對 反應(yīng)速率的影響。通過隨時間示蹤試劑(Edukts)的分解或產(chǎn)物的形成確定轉(zhuǎn)換率。隨時 間示蹤可以通過例如光度測定進行。為了確定反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)換率，可以參考物理化學(xué)教科 書(例如，Peter Atkins, Physical Chemistry, W. H. Freeman & Co ；第 7 版，2002)。最初，分離各個菌落，使用葡萄糖作為底物進行酶試驗(確定比活性)，使用第二 種糖例如麥芽糖作為底物進行第二酶試驗。在對葡萄糖具有最高活性而同時對第二種糖 (例如，麥芽糖)具有最小活性的菌落的情況中，還測定了對葡萄糖和第二種糖(例如，麥芽 糖)的混合物的活性。這是因為其特別出現(xiàn)在對作為唯一底物的麥芽糖具有非常低的相對 反應(yīng)性的某些變體的研究中，令人驚奇地，變體的這種性質(zhì)并不總是伴有獨立的性質(zhì)，即當(dāng) 葡萄糖和麥芽糖兩種糖作為混合物存在時對葡萄糖和麥芽糖的可靠識別。這會導(dǎo)致存在于 該混合物中的葡萄糖濃度的高估和低估。因此在尋找用于測定測試樣品中葡萄糖濃度的酶 中，對葡萄糖和其他糖的混合物的高葡萄糖特異性是至關(guān)重要的，或者換句話說，所討論的 糖的盡可能低的干擾。糖的干擾通過由葡萄糖和干擾的糖的混合物測定的酶活性減去由相 同濃度的葡萄糖單獨測定的活性，標(biāo)準化至該葡萄糖活性進行計算(參見等式1)。
權(quán)利要求
1.可溶性吡咯并喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶(SPQQGDH)，其特征在于，與不動桿菌 屬的一種野生型菌株諸如，例如，醋酸鈣不動桿菌(AcinetcAacter calcoaceticus) LMD 79.41的sPQQGDH相比，其在底物結(jié)合區(qū)域的范圍內(nèi)具有3_5個氨基酸的插入。
2.如權(quán)利要求1所述的sPQQGDH，其特征在于，插入位點距離底物結(jié)合區(qū)域不超過5埃。
3.如權(quán)利要求1或2所述的sPQQGDH，其特征在于，基于野生型醋酸鈣不動桿菌LMD 79. 41的序列，插入位點在位置Q168和L169之間。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的sPQQGDH，其特征在于，其通過誘變由PT16、K0Z62、 Κ0Ζ65、ΡΤΝ69、KG106、ΡΤΝ26、ΡΤ15、KGN80、KG140、KGN34、KGN25、KGN100 系列的菌株產(chǎn)生。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的sPQQGDH，其具有3個氨基酸的插入，其中插入的氨 基酸在位置1具有A或G，在位置2具有Y、F或W，和在位置3具有Q、L、V或I。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的sPQQGDH，其具有4個氨基酸的插入，其中插入的氨 基酸在位置1具有A或G，在位置2具有G、D或L，在位置3具有R或A，和在位置4具有M 或V。
7.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的sPQQGDH，其具有5個氨基酸的插入，其中插入的氨 基酸在位置1具有A、M、S或V，在位置2具有E、G或S，在位置3具有H、K、R、S或T，在位 置4具有F、H、I、L、N、V或Y，和在位置5具有F、H、L、N、Q、T或Y。
8.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的sPQQGDH，其具有選自系列SEQID I-SEQ ID 18的 插入序列。
9.基因，其編碼一種如權(quán)利要求1-8中任一項所述的蛋白質(zhì)。
10.載體，其特征在于，其在插入位點的范圍內(nèi)具有一個唯一的限制位點，以便可以在 該位點插入編碼如權(quán)利要求1-6中任一項所述的sPQQGDH的寡核苷酸序列。
11.如權(quán)利要求10所述的載體，其具有序列SEQID 27。
12.用于生產(chǎn)和鑒別如權(quán)利要求1-8中任一項所述的sPQQGDH的方法，其特征在于，在 第一步中生產(chǎn)在插入位點的范圍內(nèi)具有唯一的限制位點的載體，在第二步中將多種不同的 寡核苷酸序列插入載體中，在第三步中將這樣獲得的重組載體轉(zhuǎn)化到宿主細菌中并使細菌 增殖，在第四步中篩選細菌產(chǎn)生的sPQQGDH，以便測定sPQQGDH對至少兩種不同的糖的單獨 活性以及至少一種糖與至少另一種糖的干擾作用，和在第五步中選擇與未修飾的野生菌株 的sPQQGDH相比具有改善的底物特異性的那些sPQQGDH。
13.葡萄糖傳感器，其包含權(quán)利要求1-8的sPQQGDH。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的PQQ依賴性可溶性葡萄糖脫氫酶(sPQQGDH)，與野生型相比較而言，其具有增加的底物特異性，而且還涉及用于其生產(chǎn)和鑒別的方法。
文檔編號C12Q1/00GK102076846SQ200980124063
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者欣德勒 M., 梅斯基斯 R., 科克 R., 莫爾勒 V., 韋歇爾 W. 申請人:拜爾技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司