專利名稱：用于評價植物根系微生物群落多樣性的土壤dna間接提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于評價植物根系微生物群落多樣性的土壤DNA間接提取方法。
背景技術：
大多數(shù)土壤微生物似乎極其適應它所處的環(huán)境并在一般的實驗室條件下是不能培養(yǎng)的。從自然環(huán)境中提取基因組DNA是非常有用的方法，可用于檢測不可培養(yǎng)的微生物，跟蹤某些目標菌株或重組基因在自然環(huán)境中的行為；也可以用來揭示植物根際土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中的基因的多樣性及其隨環(huán)境的變化。這就要求從環(huán)境樣品中抽提和純化土壤微生物基因組DNA。 基因組DNA提取的主要目標是獲得最高的DNA回收，從而從微生物群落中獲得最具代表性的DNA，并進行進一步的分子操作(如PCR、SSCP、DGGE、TGGE、AFLP等)。但是來自環(huán)境中的樣品含有非常復雜的成分，尤其是土壤中的腐質(zhì)酸類物質(zhì)在提取過程中不能去除掉，腐殖質(zhì)有類似于核酸的物理化學性質(zhì)。因此，腐殖質(zhì)連同被吸附的有機分子一起與DNA共同被萃取。腐殖酸直接影響后續(xù)的PCR擴增、雜交、內(nèi)切酶消化和細菌轉化等。在大多數(shù)宏基因組研究中，分離出不含腐殖質(zhì)的宏基因組DNA，仍然是一個難題。此外，細胞裂解后粗提DNA的每一個純化步驟，例如在DNA分子研究之前進行的重復性純化步驟，不可避免的引起了 DNA的損失。大部分基因組DNA間接提取方法全都存在缺陷，例如細胞裂解不完全，DNA吸附于土壤表層，土壤提取物中含有酶抑制劑以及DNA的丟失、降解和剪切。
因此，需要研究適用于植物根際土壤微生物DNA提取的方便、快捷、實用的方法，以解決使用常規(guī)方法所獲得的DNA樣品存在腐殖酸等PCR抑制物以及細胞裂解率低、DNA損失嚴重等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種用于評價植物根系微生物群落多樣性的土壤DNA間接提取方法，利用細菌的平均密度(1. liig/cm3)遠小于土壤礦物質(zhì)的平均密度(2.6i!g/cn^)，在細胞裂解以前對樣品進行前處理，將微生物細胞從它們土壤樣品中分離出來，以解決在于土壤微生物細胞裂解后，由于腐殖質(zhì)有類似于核酸的物理化學性質(zhì)，純化步驟存在腐殖質(zhì)去除困難和DNA回收率低等問題。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案來實現(xiàn) —種用于評價植物根系微生物群落多樣性的土壤DNA間接提取方法，包括以下步驟 (1)向0. l-5g 土壤樣品中加入0. l-5mL預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩5-20分鐘分鐘，然后加入0. l-5mL勻漿緩沖液A，漩渦震蕩5-20分鐘，低速(50-400g)室溫離心10min，收集上清液轉移至另一離心瓶中。 (2)向由上述步驟(1)得到的沉淀物中加入O. 2-10mL預冷的勻槳緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩5-20分鐘，低速(50-400g)室溫離心10min，取上清液，與步驟(1)所得上清液合并。 (3)將由上述步驟(2)得到的上清液，室溫下6000-15000rmp離心10-60分鐘以回收菌體細胞。 (4)向由上述步驟(3)得到的菌體細胞中加入l-150ml的洗滌液C，洗滌2_10分鐘，室溫下6000-15000rmp離心10-60分鐘以沉淀菌體細胞，其中洗滌液C為lg/L焦磷酸鈉。 (5)向由上述步驟(4)得到的菌體細胞加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K(20mg/ml)，37。C水浴10-40min，然后加入100-500 yl細胞裂解液D到樣品中，輕輕顛倒混勻1-10分鐘，6000-15000rmp離心5-10min，沉淀碎片。 (6)將由上述步驟(5)得到上清轉移到一個干凈的離心管中，加入250-1500 iU蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5-10分鐘，8000-15000rmp離心3-10min以沉淀蛋白質(zhì)。 (7)將由上述步驟(6)得到上清轉移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (8)將由上述步驟(7)得到混合液加入2ml收集管中結合柱中，室溫放置l-5min，3000-10000rmp離心l_3min，倒掉收集管中的廢液，將結合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (9)將由上述步驟(8)收集管中結合柱放置在一個新的離心管中，加入500 iU洗滌液G到結合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (10)將由上述步驟(9)收集管中結合柱重新放回收集管中，并加入650iU洗滌液H到結合柱中，8000-15000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次。
(11)將由上述步驟(10)收集管中結合柱重新放回收集管，8000-15000rmp離心l一5min。 (12)將由上述步驟(11)收集管中結合柱裝入新的1.5ml離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-50 iU洗脫液I，不要戳破膜，室溫放置2min，8000-15000rmp離心l-3min，離心管中即為分離的DNA，貯存于_20°C 。其中洗脫液I為0.lmM Tris-HCl， pH = 9. 0。 其中，上述提取方法中，所述勻槳緩沖液A由20-400mM Tris、 15_200mMEDTA、50-250mM NaC1、0. 5-3 % pvpp組成，pH = 6. 0-9. 0 ;優(yōu)選由200mM Tris、200mM EDTA、300mMNaCl、2% pvpp組成，pH = 7. 5。 所述勻槳緩沖液B為10-200mM Tris、5-100mM EDTA、25-150mM NaC1、0. 2-1. 5%pv卯組成，pH = 6. 0-9. 0 ;優(yōu)選由100mM Tris、100mM EDTA、 150mMNaCl、 1 % pvpp組成，pH=7. 5。所述細胞裂解液D由lwt% SDS、20-60mM Tris、 100_200慮NaCl、40-100mM EDTA組成，pH = 8. 0 ;優(yōu)選由1% SDS、40mM Tris、150mM NaCl、60mM EDTA組成，pH = 8. 0。
所述蛋白去除液E由2-5M KAc、2-8wt^冰醋酸組成；優(yōu)選由3M KAc、4wt^冰醋酸組成。所述DNA聯(lián)接液F由6-10M異硫氰酸胍、200-600mM醋酸鉀組成，pH為4. 5-6. 0 ;優(yōu)選由8M異硫氰酸胍、500mM醋酸鉀組成，pH = 5. 5。
所述洗滌液G由5. 5M異硫氰酸胍、23mM檸檬酸鈉組成。
所述洗滌液H由70wt%乙醇、200mM醋酸鉀組成，pH = 5. 0。
本發(fā)明的間接提取方法，具有以下優(yōu)點 1.本發(fā)明所述的DNA間接提取方法操作簡單，不需要較為復雜的設備，常規(guī)生物化學或微生物學實驗室就可完成；并且涉及的試劑均為常規(guī)分析、分子生物學使用的試劑，相對于市場上的試劑盒成本低。 2.本發(fā)明所述的DNA間接提取方法是在細胞裂解以前對樣品進行前處理，將微生物細胞從它們土壤樣品中分離出來，避免了純化步驟存在腐殖質(zhì)去除困難和DNA回收率低的問題。 3.本發(fā)明所述的DNA間接提取方法適用性強，提取的土壤微生物DNA的OD26。/OD23。及OD26。/OD28。接近標準值，可直接應用于分子操作，來評價植物根系微生物群落多樣性。
4.提取過程不使用酚、氯仿，減少對實驗人員的身體健康傷害、所獲DNA完整，分子片段大于10kb，產(chǎn)量高。
具體實施例方式
以下結合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術方案。 三羧基甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) 、 NaCl、乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、pvpp(交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮，百分含量單位g/L)、焦磷酸鈉、醋酸鉀(KAc)、冰醋酸、異硫氰酸胍、檸檬酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純藥品。
溶菌酶和蛋白酶K為上海生工進口分裝。
實施例1 (1)向0. 5g西甜瓜根系土壤樣品中加入0. 5ml預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩10分鐘分鐘，然后加入0. 5ml勻漿緩沖液A，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，收集上清液轉移至另一離心瓶中。 (2)加入lml預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，取上清液，合并所得上清液，室溫下10000rmp離心30分鐘以回收菌體細胞，棄上清。 (3)加入1. 5ml的洗滌液C，洗滌5分鐘，室溫下10000rmp離心30分鐘以沉淀菌體細胞。向菌體細胞加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K(20mg/ml) ， 37。C水浴30-40min，然后加入122 yl細胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5_20分鐘。13000rmp離心10min，沉淀碎片。 (4)將上清轉移到一個干凈的離心管中，加入250ia蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rmp離心5min。 (5)將上清轉移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (6)將混合液加入2ml收集管中結合柱中，室溫放置2min。 6000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將結合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。
(7)將結合柱放置在一個新的離心管中，加入500ii1洗滌液G到結合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (8)將結合柱重新放回收集管中，并加入650ii1洗滌液H到結合柱中，13000rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次。 (9)將結合柱重新放回收集管，13000rmp離心2min。 (10)將結合柱裝入新的1. 5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30 ii 1洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2min。 13000rmp離心lmin，離心管中即為分離的DNA，貯存于-2(TC。 以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的量的增加，而成比例增加。用分光光度計測定OD23。、OD26。和0D28。，結果表明OD26。/OD23。 = 2. 00， OD26。/OD28。=
1. 81，接近于標準值(注OD，/OD，標準值為2. O，OD，A)D，標準值為1. 6)，可直接應用于
分子操作，來評價評價植物根系微生物群落多樣性。
實施例2 (1)向0. 5g草莓根系土壤樣品土壤樣品中加入0. 5ml預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩10分鐘分鐘，然后加入0. 5ml勻漿緩沖液A，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，收集上清液轉移至另一離心瓶中。 (2)加入lml預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，取上清液，合并所得上清液，室溫下10000rmp離心30分鐘以回收菌體細胞，棄上清。 (3)加入1. 5ml的洗滌液C，洗滌5分鐘，室溫下10000rmp離心30分鐘以沉淀菌體細胞。向菌體細胞加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K(20mg/ml) ， 37。C水浴30-40min，然后加入122 yl細胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5_20分鐘。13000rmp離心10min，沉淀碎片。 (4)將上清轉移到一個干凈的離心管中，加入250ia蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rmp離心5min。 (5)將上清轉移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (6)將混合液加入2ml收集管中結合柱中，室溫放置2min。 6000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將結合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (7)將結合柱放置在一個新的離心管中，加入500ia洗滌液G到結合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (8)將結合柱重新放回收集管中，并加入650ii1洗滌液H到結合柱中，13000rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次。 (9)將結合柱重新放回收集管，13000rmp離心2min。 (10)將結合柱裝入新的1. 5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30 ii 1洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2min。 13000rmp離心lmin，離心管中即為分離的DNA，貯存于-2(TC。 以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的量的增加，而成比例增加。
7[OOSO] 用分光光度計測定0D23。、 0D26。和0D28。，結果表明OD26。/OD23。 = 2. 01， OD26。/OD280 =1. 81，接近于標準值(注0D，/0D，標準值為2. O，OD，A)D，標準值為1. 6)，可直接應用于
分子操作，來評價評價植物根系微生物群落多樣性。
實施例3 (1)向0. 5g水稻根系上壤樣品中加入0. 5ml預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩10分鐘分鐘，然后加入O. 5ml勻漿緩沖液A，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，收集上清液轉移至另一離心瓶中。 (2)加入lml預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，取上清液，合并所得上清液，室溫下10000rmp離心30分鐘以回收菌體細胞，棄上清。 (3)加入1. 5ml的洗滌液C，洗滌5分鐘，室溫下10000rmp離心30分鐘以沉淀菌體細胞。向菌體細胞加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K(20mg/ml) ， 37。C水浴30-40min，然后加入122 yl細胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5_20分鐘。13000rmp離心10min，沉淀碎片。 (4)將上清轉移到一個干凈的離心管中，加入250ia蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rmp離心5min。 (5)將上清轉移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (6)將混合液加入2ml收集管中結合柱中，室溫放置2min。 6000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將結合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (7)將結合柱放置在一個新的離心管中，加入500ii1洗滌液G到結合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (8)將結合柱重新放回收集管中，并加入650ii1洗滌液H到結合柱中，13000rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次。 (9)將結合柱重新放回收集管，13000rmp離心2min。 (10)將結合柱裝入新的1. 5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30 ii 1洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2min。 13000rmp離心lmin，離心管中即為分離的DNA，貯存于-2(TC。 以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的量的增加，而成比例增加。用分光光度計測定0D23。、 0D26。和0D28。，結果表明OD26。/OD23。 = 2. 01， OD26。/OD280 =
1. 81，接近于標準值(注OD，/OD，標準值為2. O，OD，A)D，標準值為1. 6)，可直接應用于
分子操作，來評價評價植物根系微生物群落多樣性。
實施例4 (1)向0. 5g糯玉米根系土壤樣品中加入0. 5ml預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩10分鐘分鐘，然后加入0. 5ml勻漿緩沖液A，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，收集上清液轉移至另一離心瓶中。 (2)加入lml預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，取上清液，合并所得上清液，室溫下10000rmp離心30分鐘以回收菌體細胞，棄
8上清。 (3)加入1. 5ml的洗滌液C，洗滌5分鐘，室溫下10000rmp離心30分鐘以沉淀菌體細胞。向菌體細胞加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K(20mg/ml) ， 37。C水浴30-40min，然后加入122 細胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5_20分鐘。13000rmp離心lOmin，沉淀碎片。 (4)將上清轉移到一個干凈的離心管中，加入250ia蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rmp離心5min。 (5)將上清轉移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (6)將混合液加入2ml收集管中結合柱中，室溫放置2min。 6000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將結合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (7)將結合柱放置在一個新的離心管中，加入500ii1洗滌液G到結合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (8)將結合柱重新放回收集管中，并加入650ii1洗滌液H到結合柱中，13000rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次。 (9)將結合柱重新放回收集管，13000rmp離心2min。 (10)將結合柱裝入新的1. 5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30 ii 1洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2min。 13000rmp離心lmin，離心管中即為分離的DNA，貯存于-2(TC。 以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的量的增加，而成比例增加。
用分光光度計測定0D23。、 0D26。和0D28。，結果表明OD26。/OD23。 = 2. 02， OD26。/OD280 =1. 81，接近于標準值(注OD，/OD，標準值為2. O，OD，A)D，標準值為1. 6)，可直接應用于分子操作，來評價評價植物根系微生物群落多樣性。 最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍中。
權利要求
一種用于評價植物根系微生物群落多樣性的土壤DNA間接提取方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向0.1-5g土壤樣品中加入0.1-5ml預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩5-20分鐘分鐘，然后加入0.1-5ml勻漿緩沖液A，漩渦震蕩5-20分鐘，低速50-400g室溫離心10min，收集上清液轉移至另一離心瓶中；(2)向由上述步驟(1)得到的沉淀物中加入0.2-10mL預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩5-20分鐘，低速50-400g室溫離心10min，取上清液，與步驟(1)所得上清液合并；(3)將由上述步驟(2)得到的上清液，室溫下6000-15000rmp離心10-60分鐘以回收菌體細胞；(4)向由上述步驟(3)得到的菌體細胞中1-150ml的洗滌液C，洗滌2-10分鐘，室溫下6000-15000rmp離心10-60分鐘以沉淀菌體細胞，其中洗滌液C為1g/L焦磷酸鈉；(5)向由上述步驟(4)得到的菌體細胞加入160ul溶菌酶和20ul蛋白酶K，37℃水浴10-40min，然后加入100-500μl細胞裂解液D到樣品中，輕輕顛倒混勻1-10分鐘，6000-15000rmp離心5-10min，沉淀碎片；(6)將由上述步驟(5)得到上清轉移到一個干凈的離心管中，加入250-1500μl蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5-10分鐘，8000-15000rmp離心3-10min以沉淀蛋白質(zhì)；(7)將由上述步驟(6)得到上清轉移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻1-5min；(8)將由上述步驟(7)得到混合液加入2ml收集管中結合柱中，室溫放置1-5min，3000-10000rmp離心1-3min，倒掉收集管中的廢液，將結合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢；(9)將由上述步驟(8)收集管中結合柱放置在一個新的離心管中，加入500μl洗滌液G到結合柱中，13000rmp離心1min，倒掉收集管中的廢液。(10)將由上述步驟(9)收集管中結合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗滌液H到結合柱中，8000-15000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次；(11)將由上述步驟(10)收集管中結合柱重新放回收集管，8000-15000rmp離心1-5min；(12)將由上述步驟(11)收集管中結合柱裝入新的1.5ml離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-50μl洗脫液I，不要戳破膜，室溫放置2min，8000-15000rmp離心1-3min，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20℃。其中洗脫液I為0.1mM Tris-HCl，pH＝9.0。
2. 根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液A由20-400mM Tris、15-200mM EDTA、50-250mM NaC1、0. 5-3% pvpp組成，pH = 6. 0-9. 0。
3. 根據(jù)權利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液A優(yōu)選由200rnMTris、200mM EDTA、300mMNaCl、2% pvpp組成，pH = 7. 5。
4. 根據(jù)權利要求l所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液B由10-200mM Tris、5-100mM EDTA、25-150mM NaC1、0. 2-1. 5% pvpp組成，pH = 6. 0-9. 0。。
5. 根據(jù)權利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液B優(yōu)選由100mMTris、100mM EDTA、 150mMNaCl、 1 % pvpp組成，pH = 7. 5。
6. 根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述細胞裂解液D由lwt% SDS、 20-60mM Tri s、100-200mM NaCl、40-100mM EDTA組成，pH = 8. 0。
7. 根據(jù)權利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述胞裂解液D優(yōu)選由1% SDS、40mM Tris、150mM NaCl、60mM EDTA組成，pH = 8. 0。
8. 根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白去除液E由2-5M KAc、 2-8wt^冰醋酸組成。
9. 根據(jù)權利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白去除液E優(yōu)選由3M KAc、 4wt^冰醋酸組成。
10. 根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述DNA聯(lián)接液F由6-10M異硫氰 酸胍、200-600mM醋酸鉀組成，pH為4. 5_6. 0。
11. 根據(jù)權利要求10所述的提取方法，其特征在于，所述DNA聯(lián)接液F優(yōu)選由8M異硫 氰酸胍、500mM醋酸鉀組成，pH = 5. 5。
12. 根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述洗滌液G由5. 5M異硫氰酸胍、 23mM檸檬酸鈉組成。
13. 根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述洗滌液H由70wt^乙醇、200mM 醋酸鉀組成，pH二 5.0。
14. 根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶菌酶濃度為50mg/mL，所述蛋 白酶K的濃度為20mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于評價植物根系微生物群落多樣性的土壤DNA間接提取方法。利用細菌的平均密度遠小于土壤礦物質(zhì)的平均密度，在細胞裂解以前對樣品進行前處理，將微生物細胞從它們土壤樣品中分離出來，避免了純化步驟存在腐殖質(zhì)去除困難和DNA回收率低的問題。本發(fā)明提取過程不使用酚、氯仿，減少了對實驗人員的身體健康傷害、所獲DNA完整，分子片段大于10kb，產(chǎn)量高。所提取的土壤微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近標準值，可直接應用于分子操作，以評價植物根系微生物群落多樣件。
文檔編號C12N15/10GK101717771SQ20091020068
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權日2009年12月24日
發(fā)明者劉華, 吳瀟, 唐雪明, 朱宏, 王利剛, 王金斌, 蔣玲曦, 譚芙蓉, 趙凱, 陶世如 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院