專利名稱：恩替卡韋耐藥變異檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)個(gè)體恩替卡 韋耐藥變異遺傳的試劑盒，通過(guò)檢測(cè)恩替卡韋用藥靶向位點(diǎn)基因多態(tài)性來(lái)評(píng)估個(gè)體恩替卡 韋耐藥性。
背景技術(shù)：
恩替卡韋為鳥(niǎo)嘌呤核苷類似物，對(duì)乙肝病毒(HBV)多聚酶具有抑制作用。它能夠 通過(guò)磷酸化成為具有活性的三磷酸鹽，三磷酸鹽在細(xì)胞內(nèi)的半衰期為15小時(shí)。適用于病毒 復(fù)制活躍，血清轉(zhuǎn)氨酶ALT持續(xù)升高或肝臟組織學(xué)顯示有活動(dòng)性病變的慢性成人乙型肝炎 的治療?？诜锢枚雀?，血清蛋白結(jié)合力低(13%)，不是細(xì)胞色素同功酶的誘導(dǎo)劑、抑 制劑和底物。它通過(guò)腎臟排泄，以母藥形式出現(xiàn)在尿液中，細(xì)胞內(nèi)半衰期是0. 5-15h，經(jīng)腎臟 排泄。恩替卡韋耐藥相關(guān)變異是在rtM204V+rtL180M變異基礎(chǔ)上，再聯(lián)合rtT184、 rtS202或rtM250三個(gè)位點(diǎn)中至少一個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替代變異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種檢測(cè)個(gè)體恩替卡韋耐藥變異遺傳靶向位點(diǎn)基因多態(tài)性的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)拉rtM204V、rtL180M、rtT184、rtS202和rtM250位點(diǎn)多態(tài)性 的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，反應(yīng)緩沖液，去離 子水。本試劑盒中所述的特異性引物和熒光探針對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是能 夠輕易完成設(shè)計(jì)的，特異性引物和熒光探針對(duì)可用常規(guī)的DNA合成技術(shù)進(jìn)行合成。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例檢測(cè)試劑盒的使用步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)的體系為總 體積10 μ 1，包含濃度為20ng/ μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合 酶、20 μ M的有義引物和反義引物各0. 225 μ 1、10 μ M的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針 各0. 25μ 1，去離子水5. 325 μ 1。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟4:基因型分析根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)標(biāo)示的基因分型圖示對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因 型。
權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)個(gè)體恩替卡韋耐藥變異遺傳的試劑盒，包括特異性引物對(duì)及特異性熒光 探針對(duì)，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液和去離子水，其特征在 于所述的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)是針對(duì)rtM204V、rtL180M、rtT184、rtS202和 rtM250位點(diǎn)多態(tài)性設(shè)計(jì)的。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)個(gè)體恩替卡韋耐藥變異遺傳的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)恩替卡韋耐藥變異位點(diǎn)rtM204V、rtL180M、rtT184、rtS202和rtM250位點(diǎn)多態(tài)性的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)檢測(cè)恩替卡韋用藥靶向位點(diǎn)基因多態(tài)性來(lái)評(píng)估個(gè)體恩替卡韋耐藥性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102108390SQ20091020049
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者馮哲民, 賀憲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司