專利名稱：用于古細(xì)菌多樣性分析的針對(duì)16S rRNA基因的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一對(duì)用于PCR的引物。特別是一對(duì)用于古細(xì)菌多樣性分析的針對(duì)16S rRNA 基因的引物。
背景技術(shù)：
在過(guò)去的二十年中，微生物多樣性研究的方法有了飛速的發(fā)展。這些手段主要依賴 于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)目的基因的擴(kuò)增。16SrRNA基因是這類研究中使用最有效 最普遍的分子標(biāo)記。這些分子生物學(xué)方法的進(jìn)展使我們能對(duì)未能培養(yǎng)的微生物進(jìn)行一定 的研究，有助于我們對(duì)來(lái)自各種環(huán)境中的未知微生物群落進(jìn)行分類學(xué)和生態(tài)學(xué)層面上的 研究。古細(xì)菌在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)上都是多種多樣的。它們可以是球形、桿形、螺旋形、 不規(guī)則形和多態(tài)形等。有些是單細(xì)胞的，而有些是形成菌絲體或團(tuán)聚體。直徑范圍一般 在O. lum至15um， 一些菌絲體能長(zhǎng)到200 tx m。古細(xì)菌通常在極端生境中被發(fā)現(xiàn)，例如 產(chǎn)甲烷古細(xì)菌大量生長(zhǎng)在含豐富有機(jī)物的厭氧環(huán)境中沼氣池、動(dòng)物的瘤胃和腸道系統(tǒng)、 水域中的沉積物、沼澤濕地、溫泉，甚至是厭氧原生動(dòng)物體內(nèi)。目前，古細(xì)菌研究正在 世界范圍內(nèi)升溫，這不僅因?yàn)楣啪刑N(yùn)藏著遠(yuǎn)多于另兩類生物的、未知的生物學(xué)過(guò)程和 功能，以及有助于闡明生物進(jìn)化規(guī)律的線索，而且因?yàn)楣偶?xì)菌有著不可估量的生物技術(shù) 開(kāi)發(fā)前景。目前，微生物多樣性的研究主要依賴于對(duì)16SrRNA基因這類研究中使用最有 效最普遍的分子標(biāo)記的分析。而這種分析通常需要使用PCR技術(shù)。引物是PCR的關(guān)鍵， 直接影響到能否全面反映微生物多樣性。盡管有多種古細(xì)菌的16S rRNA引物在研究中被 用到，但缺乏適合于單方向測(cè)序可讀取長(zhǎng)度的的此類引物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一對(duì)用于古細(xì)菌多樣性分析的針對(duì)16S rRNA基因的引物。 為達(dá)至lj上述目的，本發(fā)明搜集了 Sw的<formula>formula see original document page 3</formula>
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的全長(zhǎng)16SrRNA基因，運(yùn)用MEGA4.0軟件進(jìn)行序列排列，挖掘其保守區(qū)段的序列。隨 后運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)?？紤]到后續(xù)測(cè)序能力，每條序列 單方向測(cè)序的有效讀取長(zhǎng)度一般小于1000個(gè)堿基，所以設(shè)計(jì)出擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約800個(gè)堿 基對(duì)的引物，該引物的堿基序列為
f， (5，-ACGGCTCAGTAACACG國(guó)3，)； r, (5，-CCGCCAATTCCTTTAAGT-3，)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的用于古細(xì)菌多樣性分析的針對(duì)16SrRNA基因的引物具有 很好的通用性和實(shí)用性，能良好反映實(shí)驗(yàn)對(duì)象中古細(xì)菌的多樣性，可以適用于來(lái)源于土 壤，沉積物，人畜胃腸道等環(huán)境樣品的分析。


圖l是實(shí)施例1中的PCR電泳圖，S為PCR產(chǎn)物
圖2是實(shí)施例2中，根據(jù)所構(gòu)建的16S rDNA克隆文庫(kù)的測(cè)序結(jié)果所建立的系統(tǒng)發(fā) 育進(jìn)化樹(shù)的一個(gè)小分支。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而
不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常
規(guī)條件，如分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中所述條
件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例一使用本發(fā)明引物進(jìn)行對(duì)環(huán)境微生物基因組DNA樣品的擴(kuò)增
取來(lái)源于沼氣池漿中微生物基因組DNA樣品，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系為
50 1: 10Xbuffer: 5 u 1， lOmM dNTP: 1 U 1， 10mM primer f: 2.5 u 1， 10mM primer r: 2.5
ul， Taq酶(2U/iU) : 1 lU， DNA:0.5ul， ddH20: 37.5 lU。 PCR參數(shù)設(shè)計(jì)如下起
始變性5分鐘，95°C; 30個(gè)循環(huán)(變性30秒，95°C;退火30秒，55°C;延伸50秒，72
°C);最后延伸7分鐘，72°C 。瓊脂糖凝膠電泳所用瓊脂糖濃度為1%的凝膠，含0.5 u g/mL
溴化乙錠，所用DNA分子量標(biāo)記(Marker)為北京天為時(shí)代科技有限公司的100bpladder。
電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。
實(shí)施例二由本發(fā)明擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)，并建立系統(tǒng) 發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。具體方法為使用實(shí)施例1中的方法得到PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物經(jīng)BODA PCR Purification Kit Columns純化，并與T載體連接，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化構(gòu)建16S rDNA克隆文
庫(kù)。從每個(gè)樣品中隨機(jī)挑選出克隆進(jìn)行96孔板擴(kuò)增培養(yǎng)，使用堿法板抽轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒。獲 得的質(zhì)粒使用DYEnamic ET Dynamic Terminator Sequencing Reagent (Applied Amersham)和2 pm的測(cè)序引物M13R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3，)做測(cè)序反應(yīng)，然 后使用MegaBACE4500 DNA測(cè)序儀(Applied Amersham)進(jìn)行單向測(cè)序。對(duì)獲得的序列 剔除屬于載體的序列和質(zhì)量值低于20的序列，保留可讀長(zhǎng)度約700個(gè)堿基的序列做進(jìn)一 步的系統(tǒng)分類分析。
序列經(jīng)MEGA 4.0排列。依據(jù)測(cè)序圖譜，對(duì)每條序列進(jìn)行人工編輯，只保留測(cè)序堿 基位點(diǎn)明確的序列做后續(xù)分析，引物的序列被去除。對(duì)所獲得序列使用MEGA 4.0建系 統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。圖2表示了進(jìn)化樹(shù)中的一個(gè)小分支，上部的兩條所得序列是和己知古細(xì) 菌菌禾中Memawaraeta cowcz7〃禾口 M"/zawward"af 5p.—致，說(shuō)明通過(guò)使用這對(duì)引物，能檢 測(cè)已知的古細(xì)菌；而下部13條序列與已知菌種的序列存在差異，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示的 進(jìn)化關(guān)系說(shuō)明它們屬于古細(xì)菌，這些序列在NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)的登錄號(hào) 為012F06，EU838472; 012B04, EU838440; 012D11, EU838458; 011E08, EU838404; 014C11, EU838558; 012F02, EU838469; 011D06, EU838394; 005H04, EU838491; 011H10, EU838431; 012C08, EU838450; 012B06, EU838368; 013D05, EU838526; 012A06, EU838435說(shuō)明通過(guò)使用這對(duì)引物，能檢測(cè)出樣品中所含古細(xì)菌的多樣性。
實(shí)施例三對(duì)由本發(fā)明擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物構(gòu)建16SrDNA克隆文庫(kù)進(jìn)行多樣性評(píng) 價(jià)對(duì)由實(shí)施例2得到的PCR-16S rDNA克隆文庫(kù)進(jìn)行多樣性評(píng)價(jià)。使用軟件 DOTUR(Distance-based OTUs and Richness)計(jì)算產(chǎn)生評(píng)價(jià)多樣性的Shannon指數(shù)。所有文 庫(kù)中的序列經(jīng)MEGA4.0整合的ClustalW程序進(jìn)行了排列，然后使用程序Philip計(jì)算出 距離矩陣。將距離矩陣作為輸入文件導(dǎo)入DOTUR程序進(jìn)行運(yùn)算，得到Shannon指數(shù)。 如下表所示
序列差異度Shannon指數(shù)
03.46207
0.012.62061
0.022.05837
0.031.90364
0. 041.81368
0. 051.73168
序列差異度的取值直接影響到Shannon指數(shù)的值，由表所示當(dāng)序列差異度取值為0.05 時(shí)，Shamion指數(shù)是1.73，說(shuō)明此文庫(kù)內(nèi)所含古細(xì)菌具有可觀的遺傳多樣性。因此表明本
發(fā)明引物能很好地來(lái)探測(cè)古細(xì)菌的多樣性。
序列表
<110>上海大學(xué)
<120>用于古細(xì)菌多樣性分析的針對(duì)16S rRNA基因的引物
<160> 2
<210> 1
<211> 16
<212> DNA <213>人工序列
<400> 1
ACGGC TCAGT A AC AC G 16
<210> 2
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<400> 2
CCGCC AATTC CTTTAAGT 18
權(quán)利要求
1.一種用于古細(xì)菌多樣性分析的針對(duì)16S rRNA基因的引物，其特征在于該引物的堿基序列為f5’-ACGGCTCAGTAACACG-3’；r5’-CCGCCAATTCCTTTAAGT-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及一對(duì)用于古細(xì)菌多樣性分析的針對(duì)16S rRNA基因的引物。該引物的堿基序列為f，(5’-ACGGCTCAGTAACACG-3’)；r，(5’-CCGCCAATTCCTTTAAGT-3’)。本發(fā)明可用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明能很好反映實(shí)驗(yàn)對(duì)象中古細(xì)菌的多樣性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101368214SQ200810200280
公開(kāi)日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2008年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月24日
發(fā)明者宋任濤, 莉 李, 佳 濮, 胡啟雯, 許政暟, 賀其其, 馬中良 申請(qǐng)人:上海大學(xué)