專利名稱：一種直接用于解析微生物群落結構的土壤dna提取方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物學與分子生物學技術領域，具體涉及一種直接用于解析微生物群落結 構的土壤DNA提取方法。
背景技術：
土壤生物修復系統(tǒng)運行的有效性是建立在微生物種群的多樣性和功能性基礎上，因此在 遺傳水平上研究土壤微生物種群的多樣性及其動態(tài)變化，可以為土壤生物修復系統(tǒng)中的微生 物群落結構和功能解析提供了強大的技術支持。這就要求對土壤中微生物基因組DNA進行 提取，并用于進一步的分子操作。但是由于土壤中含有的腐殖酸類物質(zhì)和有機質(zhì)等成分會造 成DNA產(chǎn)率降低，尤其是土壤中的腐殖酸類物質(zhì)在提取過程中如果不能去除掉，將會直接 影響后續(xù)的PCR擴增、雜交、內(nèi)切酶消化等。近年來，國內(nèi)外學者采用不同的提取方法獲取 土壤微生物DNA，認為提取土壤微生物DNA的關鍵因素是最大限度地保證DNA的破膜釋 放，并且盡可能避免腐殖質(zhì)的污染。但是從土壤中高效地提取DNA并有效避免腐殖質(zhì)的污 染具有相當難度，常規(guī)方法獲得的DNA由于受到腐殖質(zhì)的污染很難滿足進一步的分子操作。 而且常規(guī)方法獲得的DNA產(chǎn)量偏低，同時所獲DNA也不能反映原始土壤樣品的物種豐度。
因此，需要研制適用于土壤微生物DNA提取的快捷、實用、有效的方法，解決使用常 規(guī)提取方法所獲得的DNA樣品存在雜質(zhì)多、細胞裂解程度低及腐殖質(zhì)污染等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種直接用于解析微生物群落結構的土壤DNA提取方法。其具體 方案為
(1) 稱取2.0g土壤樣品于10ml離心管中，加入5 ml O.IM磷酸緩沖液(pH 9.5)， 旋渦振蕩5min，在11000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液。按照上述方法 對分離出的土壤再洗滌2次。
(2) 向由步驟(l)得到的土壤中加入5ml裂解液后混勻。裂解液的組成為0.1-0.3M Tris-HCl， 0.05~0.15 M EDTA， 1.0~1.5 M NaCl， pH 8.0~8.5，十六烷基三甲胺
(0.5-1.5%)。然后加入1.5 mg蛋白酶K和4 g小玻璃珠，在5(TC條件下振蕩 30 min后加入1 ml十二烷基硫酸鈉溶液(100 g/L)，旋渦振蕩5 min后在65'C條 件下水浴振蕩lh，在11000r/min條件下離心10min，收集上清液得細胞裂解液。
(3) 向由步驟(2)得到的細胞裂解液中加入lml濃度為IOM的KSCN溶液(pH值 為6.0~6.5)，在35。C條件下水浴振蕩15min，在11000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。
(4) 將由步驟(3)得到的上清液加入到離心純化柱上，將離心純化柱放入離心管中， 在11000r/min條件下離心10min，倒去離心管中的液體。重復這一過程，直至所 有由步驟(3)得到的上清液都經(jīng)過離心純化柱純化。
(5) 向經(jīng)步驟(4)處理后的離心純化柱中加入0.7ml洗滌液，洗滌液的組成為10ml 4 M NaAc與90 ml無水乙醇混合后調(diào)pH值至7.5。在11000 r/min條件下離心5 min,倒去離心管中的液體。重復這一過程1次，即向該離心純化柱中再次加入 0.7 ml洗滌液，然后在11000r/min條件下離心5 min，倒去離心管中的液體。
(6) 向經(jīng)步驟(5)處理后的離心純化柱中加入0.7ml洗脫液，洗脫液的組成為10~15 mM Tris-HCl， 1.0~2.0 mM EDTA, pH 8.0。在65。C水浴中放置2min，在11000 r/min 條件下離心5min。將離心管中的液體重新加入到該離心純化柱中，在65'C水浴 中放置2min，在11000 r/min條件下離心5 min。離心管中液體即為土壤微生物 DNA溶液，在-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 所述步驟(2)中裂解液的組成優(yōu)選為0.2MTris-HCl， 0.15MEDTA， l.OMNaCl， pH 8.0，十六垸基三甲胺(1.5%)。
所述步驟(6)中洗脫液的組成優(yōu)選為12mMTris-HCl， l.OmMEDTA， pH8.0。 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果提取方法操作簡單，適用性強，提取的土壤微生物DNA的
OD26o/OD230及OD26o/OD28o值接近于標準值，可直接應用于分子操作，來解析土壤微生物群
落的結構。
具體實施例方式
下面結合實例進一步說明本發(fā)明。
材料
(1) 土壤樣品，小玻璃珠；
(2) 磷酸，蛋白酶K，三羥基甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸，十二烷基硫酸鈉，硫氰酸 鉀，無水乙醇，醋酸鈉，十六烷基三甲胺；
(3) 0.1M磷酸緩沖液(pH9.5);
(4) 裂解液l: O.lMTris-HCl， 0.05MEDTA， l.OMNaCl， pH 8.0，十六烷基三甲胺
(0.5%);
(5) 裂解液2: 0.2MTris-HCl， 0.1 M EDTA， 1.2MNaCl， pH 8.05，十六烷基三甲胺
(1.0%);
(6) 裂解液3: 0.3 MTris-HCl， 0.15MEDTA， 1.5MNaCl， pH8.5，十六烷基三甲(7) 濃度為100g/L十二烷基硫酸鈉溶液；
(8) 濃度為10M的KSCN溶液(pH值為6.0);
(9) 洗滌液4MNaAc與無水乙醇按l:9的比例混合后調(diào)pH值至7.5;
(10) 洗脫液l: lOmMTris-HCl， l.OmMEDTA， pH 8.0;
(11) 洗脫液2: 15mMTris-HCl， 1.5mMEDTA， pH 8.0。
DNA純度的檢測方法用分光光度計測定OD26o/OD23。， OD260/OD28(^，與標準值比較。 實施例l
稱取2.0g土壤樣品于10ml離心管中，加入pH值為9.5濃度為1M磷酸緩沖液5ml， 旋渦振蕩5 min后在11000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液。重復洗滌2次，加入5 ml 裂解液1后混合均勻。然后加入1.5 mg蛋白酶K和4 g小玻璃珠，在5(TC條件下振蕩30min 后加入濃度為100 的十二垸基硫酸鈉溶液1 ml,旋渦振蕩5 min后在65'C條件下水浴振 蕩1 h，在11000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。然后向收集到的上清液中加入濃度 為10 M的KSCN溶液1 ml，在35。C條件下水浴振蕩15 min，在11000 r/min條件下離心10 min, 收集上清液。將收集到的上清液加入到離心純化柱中，然后在11000r/min條件下離心10min， 倒去離心管中的液體。重復這一過程，直至所有的上清液都經(jīng)過離心純化柱純化。向離心純 化柱中加入0.7 ml洗滌液，在11000r/min條件下離心5min，倒去離心管中的液體。重復這 一過程一次，然后向離心純化柱中加入0.7ml洗脫液1，在65。C水浴中放置2min，在11000 r/min條件下離心5 min。將離心管中的液體重新加入到該離心純化柱中，在65'C水浴中放置 2 min，在11000 r/min條件下離心5 min。離心管中液體即為純化的土壤微生物DNA溶液， 在-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 用分光光度計測定OD23o， OD加和OD280，結果表明OD260/OD230=1.94， OD260/OD280
=1.67，接近于標準值(注OD26o/OD230標準值為2.0， OD26o/OD280標準值為1.6)，可直接
應用于分子操作，來解析土壤微生物群落的結構。 實施例2
稱取2.0g土壤樣品于10ml離心管中，加入pH值為9.5濃度為1M磷酸緩沖液5ml， 旋渦振蕩5min后在11000r/min條件下離心10min,棄去上清液。重復洗滌2次，加入5 ml 裂解液2后混合均勻。然后加入1.5 mg蛋白酶K和4 g小玻璃珠，在5(TC條件下振蕩30 min 后加入濃度為100 g/L的十二烷基硫酸鈉溶液1 ml，旋渦振蕩5 min后在65'C條件下水浴振 蕩lh，在11000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。然后向收集到的上清液中加入濃度
為10 M的KSCN溶液1 ml，在35。C條件下水浴振蕩15 min，在11000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。將收集到的上清液加入到離心純化柱中，然后在11000r/min條件下離心10min， 倒去離心管中的液體。重復這一過程，直至所有的上清液都經(jīng)過離心純化柱純化。向離心純 化柱中加入0.7ml洗滌液，在11000r/min條件下離心5min，倒去離心管中的液體。重復這 一過程一次，然后向離心純化柱中加入0.7ml洗脫液2，在65。C水浴中放置2min，在11000 r/min條件下離心5min。將離心管中的液體重新加入到該離心純化柱中，在65'C水浴中放置 2 min,在11000 r/min條件下離心5 min。離心管中液體即為純化的土壤微生物DNA溶液， 在-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 用分光光度計測定OD230， OD26o和OD280，結果表明OD260/OD230=1.97， OD260/OD280 =1.62，接近于標準值，可直接應用于分子操作，來解析土壤微生物群落的結構。 實施例3
稱取2.0g土壤樣品于10ml離心管中，加入pH值為9.5濃度為lM磷酸緩沖液5ml， 旋渦振蕩5 min后在11000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液。重復洗滌2次，加入5 ml 裂解液3后混合均勻。然后加入1.5 mg蛋白酶K和4 g小玻璃珠，在5(TC條件下振蕩30 min 后加入濃度為100 g/L的十二垸基硫酸鈉溶液1 ml，旋渦振蕩5 min后在65'C條件下水浴振 蕩lh，在11000 r/min條件下離心10 tnin，收集上清液。然后向收集到的上清液中加入濃度 為10 M的KSCN溶液1 ml，在35。C條件下水浴振蕩15 min，在11000 r/min條件下離心10 min, 收集上清液。將收集到的上清液加入到離心純化柱中，然后在11000r/min條件下離心10min, 倒去離心管中的液體。重復這一過程，直至所有的上清液都經(jīng)過離心純化柱純化。向離心純 化柱中加入0.7ml洗滌液，在11000r/min條件下離心5min，倒去離心管中的液體。重復這 一過程一次，然后向離心純化柱中加入0.7ml洗脫液2，在65。C水浴中放置2min，在11000 r/min條件下離心5min。將離心管中的液體重新加入到該離心純化柱中，在65。C水浴中放置 2min，在11000r/min條件下離心5min。離心管中液體即為純化的土壤微生物DNA溶液， 在-20"C保存?zhèn)溆谩?br> 用分光光度計測定OD230， OD26o和OD280，結果表明OD260/OD23o=1.89， OD260/OD280 =1.71，接近于標準值，可直接應用于分子操作，來解析土壤微生物群落的結構。
權利要求
1.一種直接用于解析微生物群落結構的土壤DNA提取方法，其特征在于，該技術的具體步驟如下(1)稱取2.0g土壤樣品于10ml離心管中，加入5ml 0.1M磷酸緩沖液(pH 9.5)，旋渦振蕩5min，在11000r/min條件下離心10min，棄去上清液。按照上述方法對分離出的土壤再洗滌2次。(2)向由步驟(1)得到的土壤中加入5ml裂解液后混勻。裂解液的組成為0.1～0.3MTris-HCl，0.05～0.15M EDTA，1.0～1.5M NaCl，pH 8.0～8.5，十六烷基三甲胺(0.5～1.5％)。然后加入1.5mg蛋白酶K和4g小玻璃珠，在50℃條件下振蕩30min后加入1ml十二烷基硫酸鈉溶液(100g/L)，旋渦振蕩5min后在65℃條件下水浴振蕩1h，在11000r/min條件下離心10min，收集上清液得細胞裂解液。(3)向由步驟(2)得到的細胞裂解液中加入1ml濃度為10M的KSCN溶液(pH值為6.0～6.5)，在35℃條件下水浴振蕩15min，在11000r/min條件下離心10min，收集上清液。(4)將由步驟(3)得到的上清液加入到離心純化柱上，將離心純化柱放入離心管中，在11000r/min條件下離心10min，倒去離心管中的液體。重復這一過程，直至所有由步驟(3)得到的上清液都經(jīng)過離心純化柱純化。(5)向經(jīng)步驟(4)處理后的離心純化柱中加入0.7ml洗滌液，洗滌液的組成為10ml4M NaAc與90ml無水乙醇混合后調(diào)pH值至7.5。在11000r/min條件下離心5min，倒去離心管中的液體。重復這一過程1次，即向該離心純化柱中再次加入0.7ml洗滌液，然后在11000r/min條件下離心5min，倒去離心管中的液體。(6)向經(jīng)步驟(5)處理后的離心純化柱中加入0.7ml洗脫液，洗脫液的組成為10～15mM Tris-HCl，1.0～2.0mM EDTA，pH 8.0。在65℃水浴中放置2min，在11000r/min條件下離心5min。將離心管中的液體重新加入到該離心純化柱中，在65℃水浴中放置2min，在11000r/min條件下離心5min。離心管中液體即為土壤微生物DNA溶液，在-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2. 根據(jù)權利要求1所述直接用于解析微生物群落結構的土壤DNA提取方法，其特征在 于，所述步驟(2)中裂解液的組成優(yōu)選為0.2 M Tris-HCl， 0.15MEDTA， l.OMNaCl， pH 8.0，十六烷基三甲胺(1.5%)。
3. 根據(jù)權利要求1所述直接用于解析微生物群落結構的土壤DNA提取方法，其特征在 于，所述步驟(6)中洗脫液的組成優(yōu)選為12mMTris-HCl， l.OmMEDTA， pH 8.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于微生物學與分子生物學技術領域的一種直接用于解析微生物群落結構的土壤DNA提取方法。稱取一定的土壤樣品于離心管中，加入磷酸緩沖液，旋渦振蕩后離心分離出洗滌后的土壤樣品。向洗滌后的土壤樣品中加入裂解液并混勻。然后加入蛋白酶K和小玻璃珠，振蕩后加入十二烷基硫酸鈉溶液，旋渦振蕩5min后在水浴中振蕩1h，離心分離出上清液。向收集到的上清液中加入KSCN溶液，水浴振蕩15mim后離心分離出上清液。將收集到的上清液加入到離心純化柱中，然后離心棄去液體。向離心純化柱中加入洗滌液，離心棄去液體。然后向離心純化柱中加入洗脫液，在水浴中放置2min，離心后收集離心管中液體即為純化的土壤微生物DNA溶液，在-20℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明具有提取方法操作簡單，適用性強等特點，提取的土壤微生物DNA可直接應用于分子操作，來解析土壤微生物群落的結構。
文檔編號C12Q1/68GK101514339SQ20081000722
公開日2009年8月26日 申請日期2008年2月20日 優(yōu)先權日2008年2月20日
發(fā)明者丁愛中, 豆俊峰 申請人:北京師范大學