專利名稱：利用黑曲霉液體深層發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種新的纖維素酶制備方法，涉及微生物發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶。
背景技術(shù)：
纖維素酶指的是降解纖維素生成葡萄糖的一類酶的總稱，它不是單種酶，而是起 協(xié)同作用的多組分酶系，主要來自于真菌和細(xì)菌。其中3種主要酶組分是內(nèi)切β-1，4-葡 聚糖酶(EC3. 2. 1. 4) (Cx酶，CMC酶)；外切葡聚糖酶(EC3. 2. 1.91)(也稱C1酶，微晶纖維素 酶)；β -葡萄糖甘酶(EC3. 2. 1. 21)。纖維素酶是植物細(xì)胞壁的主要成分。纖維素酶一方面將纖維素水解成葡萄糖等 有效成分，另一方面它通過提高植物細(xì)胞壁的同透性而提高細(xì)胞內(nèi)含物(蛋白質(zhì)、脂肪、淀 粉)的提取率。要使纖維素充分將解和利用，就酶本身而言，主要考慮2個(gè)方面提高酶的 活力和改善纖維素酶系各組分的相對(duì)含量，以充分發(fā)揮它們之間的協(xié)同作用。纖維素酶具 有補(bǔ)充動(dòng)物內(nèi)源酶；促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收；消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的效果。它是一種高活性生物 催化劑，應(yīng)用極其廣泛，如釀造果汁與蔬菜加工，糧食加工、食品、飼料、造紙、中草藥有效成 分的提取，以及紡織工業(yè)、采油工程、廢水處理以及能源制造等各個(gè)方面。纖維素酶廣泛存 在于自然界的生物體中，如細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等，但研究和生產(chǎn)中所用的纖維素酶都是 用真菌發(fā)酵得到的，菌中大多是木霉、曲霉和青霉、根霉屬和漆斑霉屬等。而黑曲霉是公認(rèn) 安全的微生物，用其生產(chǎn)酶制劑安全、可靠，不產(chǎn)生毒素，而且生產(chǎn)快、發(fā)酵周期短、具有明 顯的優(yōu)越性，可望用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明用黑曲霉作為發(fā)酵菌株采用液體深層發(fā)酵 及變溫控制法生產(chǎn)纖維素酶。生產(chǎn)工藝比較簡單，設(shè)備要求低，產(chǎn)量高，可用于工業(yè)化大規(guī) 模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的纖維素酶生產(chǎn)方法，其步驟包括(1)配置營養(yǎng)鹽液準(zhǔn)確稱取2. OKH2PO4,1. 4g (NH4) 2S04，0. 3gMgS04 ·7Η2，0. 3gCaCl2，加 600ml 水使之溶 解。再稱取 5. OmgFeSO4 · 7H20,1. 6mgMnS04 · H20,1. 4mgZnS04 · 7H20, 2. OCoCl2,力卩 200ml 蒸 餾水使之溶解，將2種混合液混合再用HCl調(diào)節(jié)PH至5. 5，于容量瓶中定容至1000ml.此溶 液即為mandels營養(yǎng)鹽溶液，在此溶液中再加4gNaN03改進(jìn)mandels營養(yǎng)鹽溶液，將配置好 的營養(yǎng)鹽溶液放于冰箱中備用.(2)配置PDA斜面培養(yǎng)基準(zhǔn)確稱取6g馬鈴薯粉，2g葡萄糖，2g瓊脂再加IOOml蒸餾水使之溶解，分別倒入 5個(gè)試管中，于121°C高溫滅菌鍋中滅菌20min，冷卻，制成斜面培養(yǎng)基備用。(3)黑曲霉的選育及培養(yǎng)將菌種保藏培養(yǎng)基上的黑曲霉菌在無菌操作臺(tái)中接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，于 下放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5d。
(4)配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基用改良的Mandels氏營養(yǎng)鹽為底物配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基，加入玉米芯80g/L，蛋 白胨6g/L，麥芽糖10g/L，再加入一定量的ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04緩沖溶液調(diào)節(jié)PH于5. 8左右，配 200ml裝入IL的三角搖瓶。(5)接種發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的新鮮PDA斜面培養(yǎng)基上的菌體制成菌懸液，接種15ml到液體發(fā)酵培養(yǎng) 基中，于32°C、150r/min轉(zhuǎn)速下放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，然后下調(diào)溫度至28 V，繼 續(xù)培養(yǎng)3^!。(6)纖維素酶提取將攪拌發(fā)酵后的發(fā)酵液通過板框壓濾，濾布目數(shù)為768，壓濾速率為5噸/小時(shí)。 壓濾后的發(fā)酵液再經(jīng)超濾濃縮，使濾液濃度濃縮為原來的15-20倍。濃縮后的濾液經(jīng)噴霧 干燥后制得纖維素酶干粉。本發(fā)明生產(chǎn)操作工藝簡單，原料來源廣泛，生產(chǎn)成本低且無污染，適于工業(yè)化生 產(chǎn)，為一種理想的生產(chǎn)纖維素酶的方法。為研究實(shí)驗(yàn)中各種最優(yōu)化條件設(shè)計(jì)了幾個(gè)比較實(shí)驗(yàn)1.產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵特性研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)按25g/L的濃度加入麥秸粉、甘蔗渣和玉米芯等不同碳源，用營養(yǎng)液配 置，250ml三角瓶裝液量30!111，在^°C、200r/min震蕩培養(yǎng)，每隔24h取樣測(cè)定纖維素酶活
力，測(cè)得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下
權(quán)利要求
1.利用黑曲霉液體深層發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，其特征包括以下幾個(gè)步驟(1)配置營養(yǎng)鹽液以Mandels氏營養(yǎng)鹽為基礎(chǔ)再加入NaNO3 4. Og/Ι，配置成一種新的營養(yǎng)鹽備用。(2)黑曲霉的選育及培養(yǎng)將菌種保藏培養(yǎng)基上的黑曲霉菌接種到產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上，于下放入恒溫培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)4-5d。(3)配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基用改良的Mandels氏營養(yǎng)鹽為底物配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基，加入玉米芯80g/L，蛋白胨 6g/L,麥芽糖10g/L，再加入一定量的ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04緩沖溶液調(diào)節(jié)PH于5. 8左右，配200ml 裝入IL的三角搖瓶。(4)接種發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的新鮮產(chǎn)孢子斜面上的孢子制成菌懸液，接種15ml到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于 320C、150r/min轉(zhuǎn)速下放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，下調(diào)溫度至，繼續(xù)培養(yǎng)36h。(5)纖維素酶提取將攪拌發(fā)酵后的發(fā)酵液通過板框壓濾，濾布目數(shù)為768，壓濾速率為5噸/小時(shí)。壓濾 后的發(fā)酵液再經(jīng)超濾濃縮，使濾液濃度濃縮為原來的15-20倍。濃縮后的濾液經(jīng)噴霧干燥 后制得纖維素酶干粉。
2.如權(quán)利要求( 所訴，其特征在于所用的產(chǎn)孢子培養(yǎng)基為PDA斜面培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求(3)所訴，其特征在于以玉米芯為碳源，麥芽糖為輔助碳源，蛋白胨為氮 源時(shí)產(chǎn)酶效率最高。
4.如權(quán)利要求(4)所訴，其特征在于利用變溫調(diào)控培養(yǎng)(前24h控制溫度32°C，后36h 控制溫度)能使發(fā)酵產(chǎn)率和速度達(dá)到最大化。
5.如權(quán)利要求(5)所訴，其特征在于用噴霧干燥溫度為175°C，時(shí)間為3-8秒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的纖維素酶生產(chǎn)方法，其步驟包括將黑曲霉接種到產(chǎn)孢子培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d，培養(yǎng)完成后制成菌懸液，取15ml接種到配有200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的1L三角瓶中，于32℃、150r/min轉(zhuǎn)速下放于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后降低溫度到28℃繼續(xù)培養(yǎng)36h。發(fā)酵液經(jīng)板框過濾，超濾濃縮和噴霧干燥制得纖維素酶干粉。本發(fā)明操作工藝簡單，原料易得，生產(chǎn)成本低，無污染，為一種理想的纖維素酶制取方法。
文檔編號(hào)C12R1/685GK102071179SQ200910154638
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者史利斌, 吳菁 申請(qǐng)人:湖州來色生物基因工程有限公司