專利名稱：一種海捕蝦中多酚氧化酶活性狀態(tài)的檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及酚氧化酶活性狀態(tài)的檢測方法，尤其是一種海捕蝦酚氧化酶活性狀態(tài) 的檢測方法。
背景技術(shù)：
我國水產(chǎn)甲殼動物資源豐富，種類繁多。甲殼類的蝦、蟹以其味美及營養(yǎng)價值高 而深受人們喜愛。蝦、蟹既是我國漁業(yè)經(jīng)濟中的重要產(chǎn)業(yè)，又是出口創(chuàng)匯的主要產(chǎn)品之一。 2006年，我國甲殼類生產(chǎn)量達到341萬噸，接近水產(chǎn)品總產(chǎn)量的10%。海捕蝦中含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素及生理活性等營養(yǎng)物質(zhì)，其特有呈味物質(zhì) 所產(chǎn)生的口味與人們的最佳味覺非常吻合，味道鮮美，但水產(chǎn)甲殼動物極易腐敗和褐變，保 鮮困難，嚴重制約著它的商品價值。蝦、蟹等甲殼類保藏過程中的褐變現(xiàn)象是由于酪氨酸或其衍生物等色原物質(zhì)在酚 氧化酶的作用下經(jīng)過一系列生化反應最終形成黑色素引起的。酚氧化酶(Wienoloxidase， P0)，又稱多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PP0)或酪氨酸酶(EC 1. 14. 18. 1， Tyrosinase)，其分布與動物的生理功能息息相關，不同動物的酚氧化酶在體內(nèi)分布的部位 是不同的。酚氧化酶是一種含銅金屬酶，兼有加氧酶和氧化酶的雙重功能，能將單酚加氧成 二酚，并將內(nèi)源酚類物質(zhì)羥基化轉(zhuǎn)變?yōu)長-多巴(L-3，4-二羥基丙氨酸)和氧化L-多巴形 成多巴醌，多巴醌經(jīng)一系列反應后，形成黑色素。黑色素的生物合成是一個由酚氧化酶催化 體內(nèi)酪氨酸(Tyr)羥化而啟動一系列生化反應生成兩種黑色素的過程。酚氧化酶催化形成 黑色素的生物合成途徑，第一階段是由酚氧化酶催化酪氨酸羥化反應形成L-多巴(單酚酶 活性)，并進一步將L-多巴氧化生成多巴醌(二酚酶活性)。這兩步反應都是由酚氧化酶 催化的，酚氧化酶在這里顯示了獨特的雙重催化功能。第二階段以多巴醌為原料從兩個不 同途徑分別生成優(yōu)黑素(Eumelanin)和褐黑素(Pheomelanin)。酚氧化酶是黑色素合成的 關鍵酶，也是整個黑色素生成反應的限速酶。為了達到防腐、防黑變的目的，往往使用各種保鮮劑對海捕蝦進行保鮮處理。而檢 驗各種保鮮效果則需要測定加入保鮮劑前后的酶的活性性質(zhì)。因而，酶的活性測定成為一 個必不可少的手段。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡便快捷的海捕蝦中 多酚氧化酶活性性狀的檢測方法。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種海捕蝦中多酚氧化酶活性 性狀的檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)海捕蝦酚氧化酶的制備將原料蝦攪勻制漿，稱取一定質(zhì)量的蝦漿，按照料液 比1 1 1 3加入PH值7-9的tris-HCl緩沖溶液，采用震蕩儀震蕩均勻，2 10°C下靜置4 15分鐘后，利用高速冷凍離心機以轉(zhuǎn)速8000-10000r/min離心10-30分鐘，上清 液即為粗PPO酶液； 2)取試管1和試管2，依次向試管1中加入PH值7-9的Tris-HCl緩沖液2 細1 和0. 004 0. 05mol/L L-D0PA溶液1. 5 2. 5ml,向試管2中加入0. 8 1. 2ml PPO酶液， 將兩只試管在40-45°C水浴中放置10-20min，立即混勻；
3)將混合液在460-520nm波長下進行比色測定，每10 50秒記錄一次OD值隨時 間的變化，測定6-lOmin，以最初直線段的斜率計算酶活力。所述的步驟幻中Tris-HCl緩沖液的加入量優(yōu)選:3ml，L-DOPA加入量優(yōu)選^il，PPO 酶液量優(yōu)選1ml。所述的比色測定的波長優(yōu)選為490nm。最后，粗PPO酶液采用凝膠過濾和離子交換等手段進行再次提純即為提純后的 PPO酶液，再去水浴。一個酶活力單位定在測定條件下，每分鐘引起吸光度改變0. 001所需的酶量。酶活計算公式
權(quán)利要求
1.一種海捕蝦中多酚氧化酶活性狀態(tài)的檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)海捕蝦酚氧化酶的制備將原料蝦攪勻制漿，稱取一定質(zhì)量的蝦漿，按照料液比 1 1 1 3加入PH值7-9的tris-HCl緩沖溶液，采用震蕩儀震蕩均勻，2 10°C下靜 置4 15分鐘后，利用高速冷凍離心機以轉(zhuǎn)速8000-10000r/min離心10-30分鐘，上清液 即為粗PPO酶液；2)取試管1和試管2，依次向試管1中加入pH值7-9的Tris-HCl緩沖液2 細1和 0. 004 0. 05mol/LL-D0PA溶液1. 5 2. 5ml,向試管2中加入0. 8 1. 2ml PPO酶液，將 兩只試管在40-45°C水浴中放置10-20min，立即混勻；3)將混合液在460-520nm波長下進行比色測定，每10 50秒記錄一次OD值隨時間的 變化，測定6-lOmin，以最初直線段的斜率計算酶活力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海捕蝦中多酚氧化酶活性狀態(tài)的檢測方法，其特征在于步驟 2)中1Tris-HCl緩沖液的加入量優(yōu)選:3ml，L-DOPA加入量優(yōu)選^il，PPO酶液量優(yōu)選1ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海捕蝦中多酚氧化酶活性狀態(tài)的檢測方法，其特征在于比色 測定的波長優(yōu)選為490nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的海捕蝦中多酚氧化酶活性狀態(tài)的檢測方法，其特征 在于粗PPO酶液采用凝膠過濾和離子交換等手段進行再次提純即為提純后的PPO酶液，再 去水浴。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海捕蝦中多酚氧化酶活性狀態(tài)的檢測方法，先將原料蝦攪碎以料液比1∶1～1∶3加入pH值7-9的tris-HCl緩沖溶液，震蕩均勻后高速離心10-30分鐘后上清液即為粗酶液；取兩試管，試管1中加入pH值7-9的Tris-HCl緩沖液2～4ml和0.004～0.05mol/L L-DOPA溶液1.5～2.5ml，試管2中加入0.8～1.2ml PPO酶液，將兩只試管在40-45℃水浴中放置10-20min，立即混勻；在460-520nm波長下進行比色測定，每10～50秒記錄一次OD值隨時間的變化，測定6-10min，以最初直線段的斜率計算酶活力。本發(fā)明的優(yōu)點在于通過對海捕蝦酚氧化酶活性狀態(tài)的檢測，可以選擇一種適宜的保鮮劑來對海捕蝦進行保鮮，從而達到防腐、防黑變的目的，本檢測方法具有簡便、快捷、經(jīng)濟的特點。
文檔編號C12Q1/26GK102051405SQ200910154528
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者何巧力, 張海春, 楊會成, 王奮芬, 王陽光, 鄭斌, 郝云彬, 鐘明杰 申請人:浙江省海洋開發(fā)研究院