一種蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，發(fā)酵培養(yǎng)基為：玉米粉6％，豆粕2％，無水乙醇0.3％，VB1 0.003％，磷酸二氫鉀0.15％，七水硫酸鎂0.075％，α?淀粉酶0.01％，pH為3，在25－28℃，160r/min，通氣比0.25－1.0V/V.min培養(yǎng)。發(fā)酵5—6天，至生物量達(dá)到30g/L以上，將發(fā)酵液分割到3－5個同體積發(fā)酵罐，一次性補(bǔ)充滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行反復(fù)補(bǔ)料發(fā)酵。依此工藝，視蜜環(huán)菌的生長狀況，可繼續(xù)分割2－5次，采用了反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，減少了種子培養(yǎng)周期，工作量減少，設(shè)備利用率提高；接種量增大，降低雜菌污染；可以縮短生產(chǎn)周期；生物量大；工藝穩(wěn)定。
【專利說明】
一種蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種蜜環(huán)菌分割發(fā)酵工藝，具體涉及蜜環(huán)菌的培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)條件，以及后續(xù)的工藝改進(jìn)，屬于液態(tài)發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蜜環(huán)菌是屬于擔(dān)子菌門、傘菌目、白蘑科、蜜環(huán)菌屬，其能與傳統(tǒng)中草藥豬苓和天麻有一種特殊的共生關(guān)系。根據(jù)生長和發(fā)育階段的不同，蜜環(huán)菌可分為菌絲體與子實(shí)體兩部分，菌絲體作為蜜環(huán)菌的營養(yǎng)器官，其有菌絲或菌索兩種形態(tài)存在，而子實(shí)體是蜜環(huán)菌發(fā)育成熟的蘑菇。蜜環(huán)菌液體深層發(fā)酵技術(shù)能獲得大批量的菌絲體以及代謝產(chǎn)物。液體深層發(fā)酵技術(shù)最早始于20世紀(jì)40年代中期抗生素的生產(chǎn)，它是利用給菌種提供最適的培養(yǎng)基成分，以及培養(yǎng)條件，從而獲得相關(guān)產(chǎn)物。實(shí)現(xiàn)藥用真菌工業(yè)化生產(chǎn)的主要途徑就是通過液體深層發(fā)酵技術(shù)，我國是在1958年開始研究真菌的液態(tài)深層發(fā)酵，在20世紀(jì)60末實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)藥用真菌。液體深層發(fā)酵技術(shù)與傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵相比，有能實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，縮短發(fā)酵周期以及產(chǎn)生豐富的生理活性物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，蜜環(huán)菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中有核苷類，多糖類，氨基酸類以及倍半萜類化合物等活性成分，其中核苷類化合物具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抗腫瘤，抗病毒等多種生理活性，多糖類化合物延緩衰老，增強(qiáng)免疫力以及輻射保護(hù)作用，氨基酸類是構(gòu)建生命體大分子活性物質(zhì)的原料，能為機(jī)體提供營養(yǎng)，蜜環(huán)菌菌絲體以及發(fā)酵液都具有良好的神經(jīng)調(diào)節(jié)，腦保護(hù)作用，還能增強(qiáng)血流量，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等生理活性，在這些方面具有跟天麻相同的藥理效果。
[0003]真菌類的發(fā)酵工藝一般都存在發(fā)酵周期過長，從而原料利用率低，生產(chǎn)能力低，大大提高了生產(chǎn)成本。分割發(fā)酵是利用菌種發(fā)酵到生長對數(shù)后期，分離出一定比例的發(fā)酵液，然后在加入相同比例的培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵，繼續(xù)連續(xù)分割，使菌種一直保持較快的生長速度，由于蜜環(huán)菌前期種子液生長緩慢，而分割發(fā)酵工藝能省去前期制備種子的過程，從而縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率，大大降低生產(chǎn)成本。分割發(fā)酵工藝對蜜環(huán)菌的發(fā)酵生產(chǎn)以及工藝質(zhì)量監(jiān)控有良好的指導(dǎo)作用，促進(jìn)蜜環(huán)菌產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有良好的應(yīng)用意義和現(xiàn)實(shí)意義，能帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益。
[0004]蜜環(huán)菌液態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)物經(jīng)離心或者過濾后分離得到菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)濃縮后得到蜜環(huán)菌濃縮液，隨著人們對蜜環(huán)菌相關(guān)藥理活性成分研究的深入，市場上關(guān)于蜜環(huán)菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)也越來越多，目前國內(nèi)有關(guān)產(chǎn)品主要有三類:①根據(jù)蜜環(huán)發(fā)酵液經(jīng)濃縮后制得產(chǎn)品，如腦心舒口服液，該產(chǎn)品主治滋補(bǔ)強(qiáng)壯，鎮(zhèn)靜安神。身體虛弱，心神不安，失眠多夢，神經(jīng)衰弱，頭痛眩暈的人可以服用。②根據(jù)蜜環(huán)菌發(fā)酵分離后的菌絲體制得產(chǎn)品，如蜜環(huán)菌片和暈痛片，蜜環(huán)菌片能有效降低高膽固醇血癥和高甘油三酯血病，暈痛定能有效預(yù)防頭痛，對神經(jīng)性疾病有很好的預(yù)防和治療效果。③對蜜環(huán)菌菌絲體進(jìn)行有效提取，然后跟發(fā)酵液一起混合而得到的相關(guān)產(chǎn)品有蜜環(huán)菌糖漿和健腦露，蜜環(huán)菌糖漿主治神經(jīng)衰弱，失眠多夢以及美尼爾綜合征，健腦露能有效增強(qiáng)體質(zhì)，降低高血壓以及神經(jīng)發(fā)弱等癥狀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:本發(fā)明提供一種利于蜜環(huán)菌液態(tài)培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件，以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分割發(fā)酵，確定分割時間，分割比例和分割培養(yǎng)時間，再進(jìn)行分割級數(shù)的確定，從而提高蜜環(huán)菌液態(tài)發(fā)酵生物量以及縮短發(fā)酵培養(yǎng)的時間。
[0006]技術(shù)方案:蜜環(huán)菌經(jīng)過固體種子、搖瓶種子、發(fā)酵罐種子培養(yǎng)過程，再進(jìn)入生產(chǎn)發(fā)酵罐，可以在生產(chǎn)發(fā)酵罐進(jìn)行2 — 5次的分割，然后進(jìn)行補(bǔ)料反復(fù)發(fā)酵。其工藝過程:
[0007](I)蜜環(huán)菌固態(tài)種子培養(yǎng)與活化
[0008](2)蜜環(huán)菌搖瓶種子培養(yǎng)[0009 ] (3)蜜環(huán)菌種子罐發(fā)酵培養(yǎng)
[0010](4)種子成熟后移種到生產(chǎn)發(fā)酵罐，控制條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)
[0011](5)當(dāng)培養(yǎng)至穩(wěn)定期，菌絲增長緩慢，將發(fā)酵液分割至3—5個同體積發(fā)酵罐，補(bǔ)充同樣發(fā)酵培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)
[0012](6)依此工藝，視蜜環(huán)菌的生長狀況，繼續(xù)分割2 — 5次。
[0013]—種蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，進(jìn)一步的技術(shù)方案是:
[0014]蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，種子罐培養(yǎng)基為:糊精30g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，七水硫酸鎂0.75g/L，pH為3，在22 — 25 °C，160r/min，通風(fēng)比0.5-1.0V/V.min發(fā)酵培養(yǎng)8天，菌絲量大于30g/L。
[0015]蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，發(fā)酵培養(yǎng)基為:玉米粉6%，豆柏2%，無水乙醇
0.3%,VBl 0.003%,磷酸二氫鉀0.15%,七水硫酸鎂0.075%,α-淀粉酶0.01%,pH為3，培養(yǎng)條件為:溫度25 — 28 0C，攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，通氣比0.5 — 1.0V/V.min。
[0016]蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)5— 6天，菌絲生物量達(dá)到30g/L以上，將發(fā)酵液分割至3 — 5個同體積發(fā)酵罐，一次性補(bǔ)充滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。
[0017]蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，可分割級數(shù)為2— 5次。當(dāng)分割后培養(yǎng)6天，菌絲量低于25g/L時，分割工藝全程結(jié)束。
[0018]有益效果:1.本發(fā)明闡述了蜜環(huán)菌液態(tài)發(fā)酵工藝最佳培養(yǎng)基成分以及最佳培養(yǎng)條件，大大提高了蜜環(huán)菌液體發(fā)酵生物量。2.本發(fā)明結(jié)合分割發(fā)酵工藝，分割比例為20 —30%，培養(yǎng)5 —6天，此時菌絲量干重可達(dá)30g/L以上。且在此條件下能連續(xù)分害U2 —5次，大大縮短了發(fā)酵培養(yǎng)時間，效率高，工藝簡易穩(wěn)定，容易操作控制，適合大工業(yè)生產(chǎn)，成本低。3.蜜環(huán)菌液態(tài)發(fā)酵后，菌絲體可制成蜜環(huán)菌片以及相關(guān)產(chǎn)品，發(fā)酵液經(jīng)濃縮后可制成腦心舒口服液，具有廣闊市場前景以及良好經(jīng)濟(jì)價值。
【附圖說明】
[0019]圖1為蜜環(huán)菌種子培養(yǎng)生長曲線
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例一:
[0021]1.制備固體試管種子
[0022]試管下層:80g/L麩皮與40g/L玉米粉混勻，煮成糊狀后填于試管底部5-7cm高；試管上層:馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，磷酸二氫鉀lg/L，磷酸一氫鉀0.5g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，瓊脂17g/L，pH自然。待麩皮下層裝入后向試管內(nèi)倒入5ml上層培養(yǎng)基，115°C20min滅菌。在無菌條件下，用接種鏟將蜜環(huán)菌菌種接種到固體試管培養(yǎng)基上，菌絲塊鋪滿試管平面即可，28°C培養(yǎng)15-20天，待白色菌絲長滿試管底部即可。
[0023]2.種子活化
[0024]糊精30g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，七水硫酸鎂0.75g/L，調(diào)節(jié)pH至3，然后分裝至250ml的三角瓶中，裝液量為100ml，于115°C20min滅菌。在無菌條件下，將固體試管培養(yǎng)基活化好的菌種用接種鏟鏟取0.25cm2大小的菌苔3-4塊接種到滅過菌的三角瓶中，于搖床上，25°C、160r/min培養(yǎng)7-10天左右。
[0025]3:搖瓶種子液制備
[0026]種子液培養(yǎng)基:玉米粉6%，豆柏2%，無水乙醇0.3%，VB1 0.003%，磷酸二氫鉀
0.15%,七水硫酸鎂0.075%,α-淀粉酶0.01%；調(diào)節(jié)pH 3，然后分裝至三角瓶中，裝液量為100ml，于115°C20min滅菌。在無菌條件下，接種1ml活化培養(yǎng)基種子液于種子液培養(yǎng)基中，25°C，160r/min培養(yǎng)8 天。
[0027]4.發(fā)酵種子液制備
[0028]發(fā)酵種子液培養(yǎng)基配方:糊精30g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氫鉀
1.5g/L，七水硫酸鎂0.75g/L，pH為3，于115 °C 20min滅菌。在無菌條件下，接種1ml種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在240C，160r/min，通風(fēng)比1.0V/V.min，發(fā)酵培養(yǎng)8天，菌絲量達(dá)到30g//L以上。
[0029]5.第一次發(fā)酵培養(yǎng)
[0030]發(fā)酵培養(yǎng)基配方:玉米粉6%，豆柏2%，無水乙醇0.3%，VB1 0.003%，磷酸二氫鉀
0.15%,七水硫酸鎂0.075%, α-淀粉酶0.01%, pH為3。115 °C 30min滅菌后，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積接入10%的種子液，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:溫度25°C，攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，通氣比
0.5V/V.min，培養(yǎng)5天，菌絲生物量達(dá)到30g/L。
[0031]6.分割補(bǔ)料發(fā)酵
[0032]當(dāng)?shù)谝淮伟l(fā)酵培養(yǎng)5天，菌絲生物量達(dá)到30g/L，將發(fā)酵液分割成3個同體積發(fā)酵罐，一次性補(bǔ)充滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，即玉米粉6%，豆柏2%，無水乙醇0.3%，VB10.003%，磷酸二氫鉀0.15%,七水硫酸鎂0.075%, α-淀粉酶0.01%, pH為3。培養(yǎng)條件為:溫度26 °C，攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，通氣比0.5V/V.min，培養(yǎng)6天，菌絲生物量達(dá)到30g/L以上。
[0033]7.分割發(fā)酵終點(diǎn)控制
[0034]當(dāng)經(jīng)過3次分割后，蜜環(huán)菌培養(yǎng)6天，菌絲量低于25g/L時，分割工藝全程結(jié)束。
[0035]實(shí)施例二:
[0036]1.制備固體試管種子、種子活化、搖瓶種子液制備、發(fā)酵種子液制備等培養(yǎng)基配方與操作同實(shí)施例一；
[0037]2.第一次發(fā)酵培養(yǎng)
[0038]發(fā)酵培養(yǎng)基配方:玉米粉6%，豆柏2%，無水乙醇0.3%，VB1 0.003%，磷酸二氫鉀
0.15%,七水硫酸鎂0.075%, α-淀粉酶0.01%, pH為3。115 °C 30min滅菌后，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積接入10%的種子液，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:溫度26°C，攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，通氣比
0.7V/V.min，培養(yǎng)5天，菌絲生物量達(dá)到33g/L。
[0039]3.分割補(bǔ)料發(fā)酵
[0040]當(dāng)?shù)谝淮伟l(fā)酵培養(yǎng)5天，菌絲生物量達(dá)到33g/L，將發(fā)酵液分割成4個同體積發(fā)酵罐，一次性補(bǔ)充滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，即玉米粉6%，豆柏2%，無水乙醇0.3%，VB10.003%，磷酸二氫鉀0.15%,七水硫酸鎂0.075%, α-淀粉酶0.01%, pH為3。培養(yǎng)條件為:溫度26 °C，攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，通氣比0.7V/V.min，培養(yǎng)6天，菌絲生物量達(dá)到33g/L以上。
[0041]4.分割發(fā)酵終點(diǎn)控制
[0042]當(dāng)經(jīng)過4次分割后，蜜環(huán)菌培養(yǎng)6天，菌絲量低于25g/L時，分割工藝全程結(jié)束。
[0043]實(shí)施例三:
[0044]1.制備固體試管種子、種子活化、搖瓶種子液制備、發(fā)酵種子液制備等培養(yǎng)基配方與操作同實(shí)施例一；
[0045]2.第一次發(fā)酵培養(yǎng)
[0046]發(fā)酵培養(yǎng)基配方:玉米粉6%，豆柏2%，無水乙醇0.3%，VB1 0.003%，磷酸二氫鉀
0.15%,七水硫酸鎂0.075%,α-淀粉酶0.01%, pH為3。115 °C 30min滅菌后，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積接入10%的種子液，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:溫度28°C，攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，通氣比
1.0V/V.min，培養(yǎng)5天，菌絲生物量達(dá)到35g/L。
[0047]3.分割補(bǔ)料發(fā)酵
[0048]當(dāng)?shù)谝淮伟l(fā)酵培養(yǎng)5天，菌絲生物量達(dá)到35g/L，將發(fā)酵液分割成5個同體積發(fā)酵罐，一次性補(bǔ)充滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，即玉米粉6%，豆柏2%，無水乙醇0.3%，VB10.003%，磷酸二氫鉀0.15%,七水硫酸鎂0.075%, α-淀粉酶0.01%, pH為3。培養(yǎng)條件為:溫度28 °C，攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，通氣比0.9V/V.min，培養(yǎng)6天，菌絲生物量達(dá)到35g/L以上。
[0049]4.分割發(fā)酵終點(diǎn)控制
[0050]當(dāng)經(jīng)過5次分割后，蜜環(huán)菌培養(yǎng)5天，菌絲量低于25g/L時，分割工藝全程結(jié)束。
[0051]本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍不限于上述實(shí)施例。
[0052]附:蜜環(huán)菌種子培養(yǎng)生長曲線確定
[0053]糊精30g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，七水硫酸鎂0.75g/L，pH為3，在25°C，160r/min，通風(fēng)比1.0V/V.min，發(fā)酵培養(yǎng)11天，每天測定菌絲量，以時間(天)和菌絲干重含量(g/L)制定曲線，見附圖1。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，其特征在于，蜜環(huán)菌經(jīng)過I次種子培養(yǎng)過程，進(jìn)入生產(chǎn)發(fā)酵罐，在生產(chǎn)發(fā)酵罐進(jìn)行2 — 5次的分割，然后進(jìn)行補(bǔ)料反復(fù)發(fā)酵，其工藝過程為:(I)蜜環(huán)菌種子罐發(fā)酵培養(yǎng)，(2)種子成熟后移種到發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)，(3)當(dāng)培養(yǎng)至穩(wěn)定期，將發(fā)酵液分割至3—5個同體積發(fā)酵罐，補(bǔ)充培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)(4)依此工藝，視蜜環(huán)菌的生長狀況，可繼續(xù)分割2 — 5次。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，其特征在于，種子罐培養(yǎng)基為:糊精30g/L，葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，七水硫酸鎂0.75g/L，pH為3，在22 — 25°C，160r/min，通風(fēng)比0.5 — 1.0V/V.min發(fā)酵培養(yǎng)8天，菌絲量大于30g/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基為:玉米粉6%，豆柏2%，無水乙醇0.3%，VB1 0.003%，磷酸二氫鉀0.15%，七水硫酸鎂0.075%，α-淀粉酶0.01 %，PH為3，培養(yǎng)條件為:溫度25 — 28°C，攪拌轉(zhuǎn)速160r/min，通氣比0.25-1.0V/V.mino4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，其特征在于當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)5— 6天，菌絲生物量達(dá)到30g/L以上，將發(fā)酵液分割至3 — 5個同體積生產(chǎn)發(fā)酵罐，一次性補(bǔ)充滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜜環(huán)菌反復(fù)分割補(bǔ)料發(fā)酵工藝，其特征在于可分割級數(shù)為2—5次，當(dāng)分割后培養(yǎng)6天，菌絲量低于25g/L時，分割工藝全程結(jié)束。
【文檔編號】C12R1/645GK105861327SQ201610341615
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月21日
【發(fā)明人】石振拓, 劉宇, 黃小莉
【申請人】湖北諾克特藥業(yè)股份有限公司