專利名稱：：用于牛結(jié)核病診斷的重組蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組蛋白，特別是涉及一種用于牛結(jié)核病診斷的重組蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：牛結(jié)核病(bovinetuberculosis)主要是由牛分技桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的一種牛慢性消耗性傳染病。該病一年四季均可發(fā)生，呈世界流行性，在流行嚴(yán)重的地區(qū)，感染率可達(dá)60%。世界上包括美國、加拿大、澳大利亞等十多個國家已經(jīng)實現(xiàn)了無結(jié)核牛的報道，但近年來，由于野生動物以及人類結(jié)核病的發(fā)生與流行，使這些結(jié)核病控制良好國家的牛群也處在不斷檢疫和高度警惕之中。牛結(jié)核不僅導(dǎo)致了養(yǎng)牛業(yè)自身生產(chǎn)力的下降，更重要的是對人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。人對牛結(jié)核比較敏感，很多病例與感染動物有接觸史。由于牛和人類的關(guān)系(牛奶、牛肉及制品等)較其他動物更為密切，因此約10%左右的人結(jié)核病是由牛分枝桿菌引起；有研究表明，在有結(jié)核病奶牛的地區(qū)，人的結(jié)核感染率可以高達(dá)750/。。要從根本上控制牛結(jié)核病的發(fā)生與流行，首先必須加強對本病的診斷學(xué)的研究，事實上，國內(nèi)外學(xué)者也從未間斷過對牛結(jié)核病診斷方法的不斷改進。目前普遍采用結(jié)核菌素純蛋白衍生物(proteinpurifiedderivative,PPD)為抗原進行變態(tài)反應(yīng)(皮內(nèi)試驗，TST試驗)進行牛結(jié)核病的診斷。PPD試驗存在主觀性強、耗時耗力、短時間內(nèi)不能進行重復(fù)檢測以及對免疫妥協(xié)患牛、近期受感染的個體敏感性很低等缺點。90年代后期囯外發(fā)展起來的以PPD為抗原的干擾素(IFN)-Y釋放試驗明顯提高了牛結(jié)核分枝桿菌診斷的靈敏性，該方法避免了對機體的侵入性實驗，可以短時間內(nèi)多次重復(fù)實驗，同時也摒棄了結(jié)核菌素試驗中操作和解釋上的主觀性，試驗中沒有抗原的滲入以及耗時縮短，目前國外已有商品化的診斷試劑盒生產(chǎn)。但是由于PPD包含的抗原成分復(fù)雜，這些抗原在環(huán)境分技桿菌、結(jié)核分枝桿菌、牛分技桿菌中廣泛存在，致使其特異性很差；同時有研究表明，PPD并不能安全區(qū)分BCG接種的個體和被環(huán)境分枝桿菌感染的個體，其特異性差等問題仍然存在。為了提高牛結(jié)核分技桿菌檢測的特異性，國內(nèi)外學(xué)者做了大量研究以改進該檢測方法，他們利用基因重組和表達(dá)技術(shù)將牛結(jié)核分技桿菌ESAT6、MPB64、MPB70、MPB63、hsp65、Ag85B、CFP10等多種蛋白成份進行了重組表達(dá)，并以這些重組蛋白進行了牛結(jié)核病的診斷研究，雖然重組表達(dá)的單個抗原的特異性有所提高，但敏感性還不夠理想。本研究對以上各種蛋白進行了配伍，并用不同分枝桿菌感染的豚鼠進行動物模型試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESAT6和CFP10二者混合后不僅對牛結(jié)核的診斷具有良好的特異性，而且具有令人滿意的敏感性。以上研究結(jié)果在后來800頭牛的臨床試驗中得到了證實。雖然已有體外表達(dá)CFP10和ESAT6的研究報道，但目前尚未有人將2者的表達(dá)產(chǎn)物或共表達(dá)產(chǎn)物用作致敏原對牛進行皮試試驗(TST)，用以檢測牛結(jié)核感染。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對牛PPD存在的非特異性，及PPD制備繁瑣的不足，提供一種高特異性和高敏感性的PPD替代的重組蛋白，用于牛結(jié)核病的診斷。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案提供一種用于牛結(jié)核病診斷的重組蛋白，釆用如下方法得到提取牛結(jié)核分支桿菌基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板擴增出CFP10和ESAT6基因片段，用基因拼接技術(shù)擴增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因，將其經(jīng)克隆、轉(zhuǎn)化后獲得的重組菌按常規(guī)方法誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后即得。本發(fā)明的重組蛋白，其中所述用基因拼接技術(shù)擴增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因的方法，可以釆用重疊PCR的方法通過兩次PCR實現(xiàn)目的基因的拼接。其具體操作可以為(1)設(shè)計4條引物Pl為CFP10上游引物，如SEQIDNo.l所示；P2第1-45位為連接序列Linker,后面為ESAT6基因下游引物，如SEQIDNo.2所示；P3第1-45位為與引物P2連接序列互補的堿基序列，后面為ESAT6基因上游引物，如SEQIDNo.3所示；P4為ESAT6基因下游引物，如SEQIDNo.4所示；(2)PCR擴增首先以P1、P2和P3、P4分別為引物，以牛結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板，擴增出CFP10和ESAT6基因片段，回收PCR產(chǎn)物，再以等量的兩回收產(chǎn)物為模板，以Pl、P4為引物，擴增出CFP10-ESAT6融合基因，回收目的片段。本發(fā)明的重組蛋白，上述方法擴增得到的CFP10-ESAT6融合基因的序列如SEQIDNo.5所示，其中第301-345位為重疊序列。本發(fā)明的重組蛋白，在得到目的基因CFP10-ESAT6融合基因后，后續(xù)的克隆和轉(zhuǎn)化可釆用常規(guī)方法，將目的基因表達(dá)。其中一種可選的方法是將目的基因CFP10-ESAT6融合基因片段連接入表達(dá)載體pET-32a并轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌BL21(DE3)中，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切初步篩選陽性克隆，并經(jīng)序列測定驗證克隆。得到的含陽性質(zhì)粒的重組菌-大腸埃希氏菌誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體4°C、5000-12000r/min離心10-20min，將沉淀以8-12倍濃縮比例重懸于PBS中，超聲波裂解菌體，取上清，過NI-NTA柱，通過咪唑濃度梯度洗脫法純化重組蛋白。其中超聲波功率優(yōu)選200W,工作10s，間歇10s。上述得到的重組蛋白用作致敏原對牛進行皮試試驗(TST),用以檢測牛結(jié)核感染。一種重組蛋白皮試試驗的方法及結(jié)果判定可以如下述所示試驗方法將重組蛋白用生理鹽水稀釋成10-20pig/mL,不論牛只大小，一律于頸中部上l/3處剪毛(或提前一天剪毛，以避免因剪毛不慎引起局部炎癥而影響結(jié)果判定)，注射重組蛋白前先用卡尺測量擬注射部位的皮皺褶厚度(即雙層皮厚)，作好記錄。用酒精消毒注射部位后，皮內(nèi)注射0.1亳升。(小于三月齡牛也可在肩胛部進行試驗。)注射后48小時，觀察注射部位有無炎性反應(yīng)，并用卡尺測量皮皺褶厚度。結(jié)果判定將注射后48小時所測得的皮皺褶厚度減去注射前所測得的皮皺褶厚度后，再依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)作結(jié)果判定。陽性反應(yīng)試驗局部有明顯的炎癥反應(yīng)，皮厚差大于或等于3.0mm。疑似反應(yīng)試驗局部炎性反應(yīng)不明顯，皮厚差大于或等于2.0mm，小于3.0mm。陰性反應(yīng)試驗局部無炎性反應(yīng)，皮厚差小于2.0mm。凡是判定為疑似反應(yīng)的牛只，應(yīng)于第一次試驗的60天后進行第二次試驗，如結(jié)果仍為疑似反應(yīng)，則經(jīng)過60天后再試驗，還為疑似反應(yīng)，應(yīng)判定為陽性反應(yīng)。對于陰性和疑似反應(yīng)的牛，應(yīng)于注射后的72小時和96小時再分別觀察一次結(jié)果，以防個別牛出現(xiàn)較遲的變態(tài)反應(yīng)。據(jù)此，本發(fā)明還提供一種牛結(jié)核病診斷試劑，其包含有10-20嗎/mL的上述所述的重組蛋白。本發(fā)明試劑產(chǎn)品分液體制品和凍干制品，均在2-8'C保存，凍干制品的有效期為IO年，液體制品的有效期為2年。本發(fā)明還提供一種牛結(jié)核病診斷試劑盒，其包含上述的診斷試劑。上述技術(shù)方案具有如下優(yōu)點1、本發(fā)明中所用的診斷抗原為牛結(jié)核感染早期介導(dǎo)細(xì)胞免疫的主要優(yōu)勢抗原，結(jié)核感染后該抗原在體內(nèi)能持續(xù)存在，但禽結(jié)核、副結(jié)核、及卡介苗等極易干擾牛結(jié)核診斷的細(xì)菌不表達(dá)該蛋白質(zhì)。因此，該試劑不僅能及時診斷出牛結(jié)核的感染，在鑒別診斷上也有較大的意義。2、應(yīng)用基因拼接(Genesplicingbyoverlapextension)的方法進行兩基因的連接，并且在兩基因的中間引入一段疏水氨基酸linker,能夠在連接的同時最大可能的保證兩抗原間的空間結(jié)構(gòu)，以保持蛋白的天然活性，避免了分別表達(dá)2個蛋白，進行2種蛋白純化的工作，節(jié)省了生產(chǎn)成本。3、經(jīng)典的TST試驗中需要使用PPD,而使用PPD時需要動用牛結(jié)核強毒株，增加了生物安全控制成本。本發(fā)明只需要用無致病性的大腸桿菌發(fā)酵即可獲得大量的靶蛋白。4、使用本發(fā)明提供的重組蛋白及診斷試劑診斷牛結(jié)核病成本低、速度快、高敏感性和特異性。圖la是本發(fā)明實施例l的基因PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，其中l(wèi)、2:ESAT6PCR條帶，大小為288bp;3、4:CFP10PCR條帶，大小為300bp;5:DL2000Marker。圖lb是本發(fā)明實施例1的基因PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，其中1、2:為CFP10-ESAT6PCR產(chǎn)物；3:DL2000Marker。圖2是重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果，其中1:中等蛋白分子Marker;2:含pET-32a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌體裂解物上清，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；3:含pET-32a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌體裂解物上清，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；4:含pCFP10-ESAT6重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌體裂解物上清，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；5:含pET-CFP10-ESAT6重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)菌體裂解物上清，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；6:經(jīng)M-NTA柱純化后的重組表達(dá)產(chǎn)物。具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細(xì)描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例l:1、目的基因的擴增本發(fā)明釆用基因拼接技術(shù)(Genesplicingbyoverlapextension)，即重疊PCR的方法通過兩次PCR實現(xiàn)目的基因的拼接。共設(shè)計4條引物，PI為CFP10上游引物；P2前半段(劃線部分)為連接序列(Linker,編碼15個疏水氨基酸)，后半段為ESAT6基因下游引物；P3前半段(劃線部分)是與引物P2劃線部分互補的堿基序列(Linker)，后半段為ESAT6基因上游引物；P4為ESAT6基因下游引物。首先用引物P1、P2擴增出CFP10基因，用引物P3、P4擴增出ESAT6基因，然后取2種基因產(chǎn)物等體積混合后作為模板，用引物PI和P4擴增出CFP10-ESAT6基因。具體操作方法如下1.1引物設(shè)計根據(jù)GenBank中的鄉(xiāng)co^c&n'wm6ov&AF2122/97(登陸號NC002945)設(shè)計引物Pl:5，-GCGAATTCATGGCAGAGATGAAG-3，，如SEQIDNo.l所示；P2:5,-GCTTCCACCTCCTCCGCTTCCACCACCTCCGCTTCCACCGCCACCGAAGCCCATTTGCG-3，，如SEQIDNo.2所示；P3:5，-GGTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGTGGAAGCGGAGGAGGTGGAAGCATGACAGAGCAGCAG-3，,如SEQIDNo.3所示；P4:5'-CCCTCGAGTTACTATGCGAACATCCCAGTG-3，，如SEQIDNo.4所示；Pl、P4劃線部分分別為、7//w/m酶切位點，P2、P3劃線部分為互補的45個堿基的linker。1.2目的片段的擴增PCR擴增條件為:94。C/10min，94。C/30s、55°C/30s、72°C/2min(30個循環(huán))，72°C/10min。首先以P1、P2和P3、P4分別為引物，以牛結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板，擴增出CFP10和ESAT6基因片段(見圖la)，回收PCR產(chǎn)物，再以等量的兩回收產(chǎn)物為模板，以Pl、P4為引物，擴增出CFP10-ESAT6融合基因(見圖lb)。PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段。2、重組表達(dá)質(zhì)粒pCFP10-ESAT6的構(gòu)建用I、///>^///分別雙酶切回收的CFP10-ESAT6PCR產(chǎn)物及pET-32a，將兩酶切產(chǎn)物回收后按100:l(摩爾比)連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切初步篩選陽性克隆，并經(jīng)序列測定驗證克隆。3、重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析將含陽性質(zhì)粒的重組菌一一大腸埃希氏菌pCFP10-ESAT6株菌(2009年7月6日本菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.3168)在LB液體培養(yǎng)基中37。C振蕩培養(yǎng)過夜，按1:100接種LB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)3h，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，30。C繼續(xù)培養(yǎng)6h。收集未誘導(dǎo)及6h誘導(dǎo)的菌液lmL,離心取沉淀，用200pL的pH7.4的PBS重懸，加入50|iL的5xloadingBuffer，混勻后煮沸5min，各取lO(iL上清液與標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Maker進行SDS-PAGE電泳(見圖2),后用考馬斯亮藍(lán)染色。4、重組蛋白的純化將表達(dá)后菌體4°C5000r/min離心15min或12000r/min離心10min，棄上清，將沉淀以10倍濃縮比例重懸于pH7.4PBS中，超聲波(功率200W，工作10s，間歇lOs)裂解菌體20min,再次4°C5000r/min離心20min,收集上清，經(jīng)0.45pm濾膜過濾后，過NI-NTA柱，通過咪唑濃度梯度洗脫法純化重組蛋白，并根據(jù)Bradford法確定重組蛋白濃度。5、重組蛋白皮試試驗方法將重組蛋白用生理鹽水稀釋成10-20昭/mL,不論牛只大小，一律于頸中部上l/3處剪毛(或提前一天剪毛，以避免因剪毛不慎引起局部炎癥而影響結(jié)果判定)，注射重組蛋白前先用卡尺測量擬注射部位的皮皺褶厚度(即雙層皮厚)，作好記錄。用酒精消毒注射部位后，皮內(nèi)注射O.l亳升。(小于三月齡牛也可在肩胛部進行試驗。)注射后48小時，觀察注射部位有無炎性反應(yīng)，并用卡尺測量皮皺褶厚度。6、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)將注射后48小時所測得的皮鈹褶厚度減去注射前所測得的皮鮍褶厚度后，再依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)作結(jié)果判定。陽性反應(yīng)試驗局部有明顯的炎癥反應(yīng)，皮厚差大于或等于2,5mm。疑似反應(yīng)試驗局部炎性反應(yīng)不明顯，皮厚差大于或等于1.5mm，小于2.5mm。陰性反應(yīng)試驗局部無炎性反應(yīng)，皮厚差小于1.5mm。凡是判定為疑似反應(yīng)的牛只，應(yīng)于第一次試驗的60天后進行第二次試驗，如結(jié)果仍為疑似反應(yīng)，則經(jīng)過60天后再試驗，還為疑似反應(yīng)，應(yīng)判定為陽性反應(yīng)。對于陰性和疑似反應(yīng)的牛，應(yīng)于注射后的72小時和96小時再分別觀察一次結(jié)果，以防個別牛出現(xiàn)較遲的變態(tài)反應(yīng)。試驗例地點山東某奶牛場。時間2007.4試驗頭數(shù)28頭檢驗方法將實施例l提供的重組蛋白用生理鹽水稀釋成20pg/mL，不論牛只大小，一律于頸中部上l/3處剪毛(或提前一天剪毛，以避免因剪毛不慎引起局部炎癥而影響結(jié)果判定)，注射重組蛋白前先用卡尺測量擬注射部位的皮皺褶厚度(即雙層皮厚)，作好記錄。用酒精消毒注射部位后，皮內(nèi)注射0.1毫升。(小于三月齡牛也可在肩胛部進行試驗。)注射后48小時，觀察注射部位有無炎性反應(yīng)，并用卡尺測量皮皺褶厚度。試驗同時在牛頸中部上同一側(cè)進行常規(guī)PPD對照。試驗結(jié)果見表l表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根據(jù)本專利中確定的陰、陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，4#、5#、10#、11#、13#判為陽性，1#、8#、18#、19#、24#判為可疑。根據(jù)PPD的判斷標(biāo)準(zhǔn)，5#、10#、13#、19#、24#判為可疑。用進口試劑盒檢測，結(jié)果4#、5#、10#、11#、13#、19#為陽性，與本專利中申報的重組蛋白檢驗結(jié)果吻合性最好，陽性樣品100%吻合，只有第19#樣品用重組蛋白檢驗判為可疑，而試劑盒檢測為陽性。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。序列表<110>廣東大華農(nóng)動物保健品有限公司<120>用于牛結(jié)核病診斷的重組蛋白及其應(yīng)用<130>KHP09112896.6<160>5〈170>Patentlnversion3.5<210>1〈211>23<212>畫<213>人工序列<400>1gcgaattcatggcsgagstgaag23〈210>2<211>59<212>畫〈213>人工序列<400>2gcttccacctcctccgcttccaccacctccgcttccaccgccaccgaagcccatttgcg59<210>3<211>60〈212>DNA<213>人工序列<400>3ggtggcggtggaagcggaggtggtggaagcgg鄉(xiāng)aggtggaagcatgacagagcagcag60<210>4〈211>30〈212>DNA<213>人工序列〈400〉4ccctcgagttactatgcgaacatcccagtg〈210>5〈211>633〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉5atggcagagatgaagaccgatgccgctaccctcgcgcaggatctccggcgacctgaaaacccagatcgaccaggtggagtggccagtggcgcggcgcggcggggacggccgcccaggccggcagccaataagcatgaagcaggaactcgatcgagatctcgagtcc犯tactcgagggccgacgaggagcagcagcaggcgcggtggcggtgg犯tcggaggtggtgg卿cgg鄉(xiāng)aggtgtggaatttcgcgggtatcgaggccgcggcaagcgcaatcccattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagcagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagc肌aaatgggaacaacgcgctgcagaacctggcgcggacgatcagggaagaccgaaggcaacgtcactgggatgttcgcatag3ggC3ggt犯cgacggcaggcggtggtgcgcgaatattcgtgtcctcgcag犯gcatgax;鄉(xiāng)g3組gttcgcagcggcacgccacggcccggtcaggctttcg3gcggttcgttgcagcttcca3g犯tcaggccggcaatgggcttccacgtccattctggggcggttaccgagctg犯tggcttcg306012018024030036042048054060063權(quán)利要求1、一種用于牛結(jié)核病診斷的重組蛋白，其特征在于，是采用如下方法得到的提取牛結(jié)核分支桿菌基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板擴增出CFP10和ESAT6基因片段，用基因拼接技術(shù)擴增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因，將其經(jīng)克隆、轉(zhuǎn)化后獲得的重組菌按常規(guī)方法誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后即得。2、如權(quán)利要求1所述的重組蛋白，其特征在于，所述用基因拼接技術(shù)擴增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因的方法，是釆用重疊PCR的方法通過兩次PCR實現(xiàn)目的基因的拼接。3、如權(quán)利要求2所述的重組蛋白，其特征在于，所述兩次PCR包括以下操作(1)設(shè)計4條引物Pl為CFP10上游引物，如SEQIDNo.l所示；P2第1-45位為連接序列Linker,后面為ESAT6基因下游引物，如SEQIDNo,2所示；P3第1-45位為與引物P2連接序列互補的堿基序列，后面為ESAT6基因上游引物，如SEQIDNo.3所示；P4為ESAT6基因下游引物，如SEQIDNo.4所示；(2)PCR擴增首先以P1、P2和P3、P4分別為引物，以牛結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板，擴增出CFP10和ESAT6基因片段，回收PCR產(chǎn)物，再以等量的兩回收產(chǎn)物為模板，以Pl、P4為引物，擴增出CFP10-ESAT6融合基因，回收目的片段。4、如權(quán)利要求3所述的重組蛋白，其特征在于，所述擴增得到的CFP10-ESAT6融合基因的序列如SEQIDNo.5所示。5、如權(quán)利要求1-4任一項所述的重組蛋白，其特征在于，將得到的目的基因CFP10-ESAT6融合基因的片段連接入表達(dá)載體pET-32a并轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌BL21(DE3)中，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切初步篩選陽性克隆，并經(jīng)序列測定驗證克隆。6、如權(quán)利要求5所述的重組蛋白，其特征在于，將得到的含陽性質(zhì)粒的重組菌-大腸埃希氏菌誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體4'C、5000-12000r/min離心10-20min,將沉淀以8-12倍濃縮比例重懸于PBS中，超聲波裂解菌體，取上清，過NI-NTA柱，通過咪唑濃度梯度洗脫法純化重組蛋白。7、如權(quán)利要求6所述的重組蛋白，其特征在于，所述超聲波功率200W，工作10s,間歇10s。8、權(quán)利要求1-7任一項所述的重組蛋白在制備檢測牛結(jié)核感染的致敏原中的應(yīng)用。9、一種牛結(jié)核病診斷試劑，其特征在于，包含10-20pg/mL的權(quán)利要求l-7任一項所述的重組蛋白。10、一種牛結(jié)核病診斷試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求9所述的診斷試劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于牛結(jié)核病診斷的重組蛋白，采用如下方法得到提取牛結(jié)核分支桿菌基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板擴增出CFP10和ESAT6基因片段，用基因拼接技術(shù)擴增出目的基因CFP10-ESAT6融合基因，將其經(jīng)克隆、轉(zhuǎn)化后獲得的重組菌按常規(guī)方法誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后即得。使用本發(fā)明所提供的重組蛋白及診斷試劑診斷牛結(jié)核病成本低、速度快、高敏感性和特異性。文檔編號C12P19/00GK101684160SQ200910089180公開日2010年3月31日申請日期2009年8月3日優(yōu)先權(quán)日2009年8月3日發(fā)明者徐家華,陳瑞愛申請人:廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司