診斷結(jié)核病的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種診斷結(jié)核病的方法。具體地，本發(fā)明涉及活動性結(jié)核?。╝ctive tuberculosis(TB))的血清學診斷方法，該血清學診斷方法基于檢測哺乳動物受試者中針 對源于結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis)的脂質(zhì)抗原的抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 對于諸如TB的疾病，盡管已有報道在針對患有TB的患者血清中結(jié)核分枝桿菌的 各種抗原的抗體的研究上取得了極大的進展，但迄今一直沒有能足夠有效地保證TB診斷 結(jié)果的商業(yè)化血清學TB診斷測試（Weyer等人，2011年）。
[0003] 本發(fā)明提供一種通過檢測含有免疫球蛋白的體液樣品中的替代標記物抗體診斷 結(jié)核病的方法。替代標記物是疾病的指標，由宿主對感染的響應(yīng)產(chǎn)生，而不是由感染因子自 身產(chǎn)生。
[0004] 所述替代標記物抗體是特異性地識別源自結(jié)核分枝桿菌的分枝菌酸抗原的抗體 (Verschoor等人，1998年，US7, 122, 577)，且本申請人認識到，這樣的抗體的流行率不會 因HIV協(xié)同感染而受影響，HIV是引起AIDS的病毒（Schleicher等人，2002年）。本申請 人還認識到，可通過競爭性結(jié)合抑制免疫測定的手段檢測抗體，以便將該抗體與普遍存在 的交叉反應(yīng)抗膽固醇抗體區(qū)別（Verschoor等人，2005年，Thanyani等人，2008年，Benadie 等人，2008年）。本申請人進一步認識到，可使用稀釋的樣品利用生物傳感技術(shù)實時檢測抗 體與固定在傳感器表面上的含分枝菌酸抗原的脂質(zhì)體的結(jié)合，以提高檢測的靈敏度和特異 性相比于標準免疫測試如ELISA(Verschoor等人，2005,Thanyani等人，2008年，Lemmer等 人，2009年）。本申請人進一步認識到，使用電化學阻抗譜（EIS)技術(shù)，可以在具有嵌入分枝 菌酸抗原的自組裝脂質(zhì)單層上對替代標記物抗體進行終點檢測（Mathebula等人，2009年， Ozoemena等人，2010 年）〇
[0005] 在所引用的現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)給予適用于結(jié)核病的診斷的技術(shù)縮寫"MARTI"，即分 枝菌酸抗體實時抑制測試（Lemmer等人，2009年）。然而，由于所述MARTI-測試需要昂貴且 費力的生物傳感器技術(shù)，如表面等離子體共振（surfaceplasmonresonance)、伴隨低樣品 通量以及高維護要求，其應(yīng)用是具有挑戰(zhàn)性的。Mathebula等人（2009年）和Ozoemena等 人（2010年）的電阻抗譜技術(shù)試圖找到一種所述替代標記物抗體的生物傳感器檢測方法， 以更適合于實際診斷應(yīng)用。盡管技術(shù)上成功，但其偏離了將MARTI作為終點抗體結(jié)合檢測 測試予以實施的原理，當使用較多的血清樣品組進行驗證時，會預期到不足的靈敏度。
[0006] 本發(fā)明通過以新穎的方式配置電阻抗的測定，將電阻抗生物傳感器途徑應(yīng)用于 MARTI-測試的原理，對現(xiàn)有技術(shù)提供了改進。這需要排除抗體-抗原在電極傳感器表面暴 露后的洗滌步驟，并包含與含抗體的樣品結(jié)合的氧化還原探針或類似的導電物質(zhì)。這種設(shè) 置通過防止低親和力的生物標志物抗體連同未結(jié)合的血清成分的洗除提高了測試的靈敏 度。本發(fā)明利用價格低廉、耐化學溶劑、絲網(wǎng)印刷型、一次性的電極使MARTI-測試的原理適 用于高樣品通量。另外，本發(fā)明為抑制的樣品和非抑制的樣品提供了連續(xù)注射，即將所述抑 制的樣品和非抑制的樣品依次暴露于相同的傳感器表面，這使得每個樣品僅需要一個一次 性的電極即可進行全面分析。
[0007] 以前已經(jīng)探索了用于TB的檢測的各種方法。基于壓電的生物傳感器（He等人， 2002年，Ren等人，2008年）、基于DNA結(jié)合的生物傳感器（Das等人，2010年）、基于磁彈性 的生物傳感器（Pang等人，2008年），基于聲波的生物傳感器（He等人，2003年），以及基于 SPR的DNA傳感器（Duman和Erhan，2010)。然而，這些創(chuàng)新旨在直接的桿菌檢測，并未涉及 低親和力的抗體的洗除。Pang等人（2008年）的方法中使用痰樣品，并已知為適合HIV協(xié) 同感染的患者。用于TB檢測的生物傳感器具有巨大的科學和商業(yè)利益，但對肺外、兒科和 HIV協(xié)同感染的群體中還沒有提供解決方案。
[0008]Mathebula等人（2009年）為可使用電化學阻抗譜（EIS)檢測結(jié)核抗分枝菌酸抗 體的生物標志物提供了原理的證明。EIS本質(zhì)上是一種檢測具有電流的電極表面上的變化 的分析技術(shù)。這篇文獻建議使用共價連接的自組裝單層，以形成包含分枝菌酸的電容層。然 而，在其目前的配置中，所述方法由于費力的電極拋光和化學方法，不能用于高樣品通量。 本申請人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)絲網(wǎng)印刷電極（SPEs)與電化學阻抗譜結(jié)合可以用于檢測抗分枝菌酸的 抗體。
[0009] 絲網(wǎng)印刷技術(shù)或絲網(wǎng)印刷已知多年，并已成功地用于生產(chǎn)絲網(wǎng)印刷電極。在本發(fā) 明的方法中，金"墨水"用于圖1中所示的陶瓷氧化鋁載體上，以產(chǎn)生三個電極的系統(tǒng)?？?通過如圖2和圖3中所示的高溫固化或低溫固化將所述金電極固化。這避免了費力的拋光 的要求（Garcia-Gonzdilez等人，2008年）。在電極系統(tǒng)中，控制參數(shù)如表面粗糙度和自組 裝單層（SAM)的重現(xiàn)性是重要的。高通量抗體檢測要求用于控制所述表面粗糙度的方法應(yīng) 被優(yōu)化，以在獲得重現(xiàn)性結(jié)果中提供置信度。
[0010] 絲網(wǎng)印刷使高品質(zhì)的一次性的電極重復生產(chǎn)價格低廉。由于用于診斷目的的表面 再生是不切實際的，一次性是很重要的。當使用替代技術(shù)（例如，BiacoreSPR生物傳感器） 時，必須在每次分析前，對石英杯（cuvette)的金表面進行化學再生。這可能導致當使用自 組裝單層膜（SAMs)時，引起該表面的蝕刻。此外，促溶劑（chaotropicagents)如尿素可 能存在于血清中；這些試劑對電極具有破壞影響（Dijksma，2003年）。這可以通過不定誤 差（indeterminateerror)破壞重現(xiàn)性和精確度。由于這些因素，表征多次再生之間的表 面變化是極其困難、昂貴且不切實際的。一次性的SPEs為重現(xiàn)性和成本提供了解決方案。
[0011] 電化學阻抗譜是由OliverHeaviside(Barsoukov和MacDonald，2〇〇5 年）于 188〇 年首次提出的。大約125年后，電化學技術(shù)被證明適用于在自組裝單層（SAMs)上監(jiān)控結(jié)合 相互作用（Campuzano等人，2006年）。電荷轉(zhuǎn)移經(jīng)氧化還原探針發(fā)生在溶液中的工作電極、 參考電極和對電極上。簡單地說，在該池的E1/2處的恒定電壓保持在基于所定義的掃描參 數(shù)的一組不同頻率上。交流電流具有幅度和相位角。該相位角由于系統(tǒng)中的變化而發(fā)生改 變，包括由于增加的電容的離子擴散。頻率響應(yīng)分析（FRA)在本測定中測定。EIS用于研究 兩組參數(shù)：影響材料的例如導電性，介電常數(shù)，電荷迀移率，帶電荷種類的平衡濃度，主體反 應(yīng)速率的那些參數(shù)，以及屬于電極材料界面，包括吸附反應(yīng)速率常數(shù)，界面區(qū)域上的電容和 電極自身中的中性物質(zhì)的擴散系數(shù)的那些參數(shù)（Barsoukov和MacDonald，2005年）。SAMs 形成制約了電荷轉(zhuǎn)移的絕緣層，從而產(chǎn)生電容（Gebbert等人，1992年）。由于通過物理吸 附的抗體結(jié)合，在電解質(zhì)-SAM-工作電極界面產(chǎn)生電荷轉(zhuǎn)移電阻（RJ(Tudorache和Bala， 2007年）。可以使用EIS技術(shù)量化Ret，并在本文使用用作分析的基礎(chǔ)。
[0012] 在電位脈沖（脈沖電流檢測）的期間，可以通過阻抗測量實現(xiàn)抗體-抗原響應(yīng)的 直接、不含標記的檢測。通過結(jié)合蛋白質(zhì)在SAM上形成一個附加層，使得能夠檢測所引入的 電極的電容的改變和/或電荷轉(zhuǎn)移電阻的改變（Berggren和Johansson，1997年）。
[0013] 使用循環(huán)伏安法（cyclicvolta_etry)校準系統(tǒng)是需要的，以確定該系統(tǒng)的平衡 電位（E1/2)(見圖4)。該值用于EIS以測量在工作電極（WE)和對電極（counterelectrode) (CE)之間的電流擾動。當使用金作為該工作電極時，用于測量之前報道的SAMs的對電極 的例子為氯化銀，且氧化還原探針是鐵氰化物或[Fe(CN)6]4/[Fe(CN)6]3 (Mathebula等人， 2009 年）。
[0014] 工作電極作為在界面區(qū)域交換的電子的來源，必須是生物惰性的（換句話說，它 們將不會產(chǎn)生響應(yīng)所施加的電勢的電流）。金由于其惰性和導電性能，以前已經(jīng)用作工作電 極。它很容易與乙酰半胱氨酸或任何硫醇綴合，在硫和金表面之間形成高度穩(wěn)定的配位共 價鍵。如果所述硫是長鏈烷烴或類似分子的一部分，則會形成絕緣層。如果所述電極是會 被重新使用的，則必需去除形成的絕緣層。這要求所述電極在每次使用之間必需被清潔或 被拋光。這是不切實際的，且具有引入可測誤差（determinateerror)的可能性。
[0015] 使用一次性電極防止表面吸附效果和由于過度清潔造成的損傷，因此極大程度地 提高重現(xiàn)性。所述電極可在裝置外制備，且被設(shè)置應(yīng)用于電極拋光和電極涂覆是不切實際 的護理點（pointofcare) (P0C)中。
[0016] 在水溶液中，電極-電解質(zhì)界面可以使用由附著到所述電極表面的疏水性化合物 /分子/納米顆粒組成的SAMs進行改性。N-(2-巰基乙基）十八烷酰胺（ME0DA)之前已經(jīng) 被Ozoemena等人（2010年）和Mathebula等人（2009年）使用，以及11-硫醇癸酸（MEA) 已被Zhang等人（2009年）使用。Ozoemena等人（2010年）使用的Au-MEODA-MA原理包 括將半胱胺附著到金，隨后共價連接硬脂酸，并最終通過疏水相互作用結(jié)合分枝菌酸。被認 為，這定向了該分枝菌酸垂直于朝下的疏水部分，并且所述分枝菌酸的基序和其他親水基 團朝向SAM的外表面。這允許與抗分枝菌酸抗體結(jié)合，提供了可以使用EIS進行TB診斷所 需的證據(jù)。
[0017] 以前的工作已經(jīng)表明，自組裝單層膜（SAMs)阻礙電流的流動。由于金表面覆蓋有 長鏈烷基硫醇，幾乎所有的電流被所報道的用丁硫醇情況下的69 Ωcm2的動態(tài)電阻阻斷，相 比之下硫辛酸在40 Ωcm2具有較低電阻40 Ωcm2,其