用于診斷結(jié)核的傳感器技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于診斷由結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis)細(xì)菌引起的結(jié)核的傳感 器技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核（TB)是常見(jiàn)的由分枝桿菌--主要由結(jié)核分枝桿菌--引起的傳染性疾病。 它通常攻擊肺（如肺結(jié)核），但也可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、生殖泌尿系 統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、骨骼、關(guān)節(jié)以及甚至皮膚。TB容易通過(guò)小飛沫的空中傳播擴(kuò)散。超過(guò)90%的 每年新TB病例和死亡發(fā)生在資源匱乏和發(fā)展中的國(guó)家。
[0003] 痰涂片顯微術(shù)是用于診斷TB的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法。該方法超過(guò)100年，并且不能檢測(cè) 超過(guò)一半的所有活性病例（Lalvani等，Br. Med. Bull. 93, 69-84(2010))。結(jié)核菌素皮膚測(cè) 試的解釋依賴傳染的個(gè)體流行病學(xué)危險(xiǎn)度系數(shù)。因此，該測(cè)試在某些生物條件下往往不準(zhǔn) 確并且在潛伏TB與活性TB傳染之間不能夠區(qū)分。此外，對(duì)于患者以及健康護(hù)理的提供者， 其是勞動(dòng)密集的。TB的另一個(gè)診斷測(cè)試包括痰樣品的抗酸桿菌染色。然而，該測(cè)試不能將 結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌區(qū)分開(kāi)，并且它需要8周后的額外陽(yáng)性涂片培養(yǎng)物，用于 肺TB的確定性診斷。
[0004] 在TB負(fù)荷相對(duì)低的工業(yè)化國(guó)家中，TB診斷依靠于分子分析和分枝桿菌培養(yǎng)物。在 這些國(guó)家中，使用測(cè)定培養(yǎng)物中微生物產(chǎn)生二氧化碳或消耗氧的分析，可以獲得早期陽(yáng)性 結(jié)果。然而，需要大約20天來(lái)獲得準(zhǔn)確的陽(yáng)性結(jié)果。
[0005] 在2-7小時(shí)內(nèi)識(shí)別呼吸系統(tǒng)內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌的核酸擴(kuò)增測(cè)試（NAAT)和y干擾 素釋放分析是兩種最近開(kāi)發(fā)的用于TB診斷的方法。這些方法被認(rèn)為更快速、準(zhǔn)確和靈敏。 然而，這些方法中使用的設(shè)備是昂貴的并且它要求技術(shù)專業(yè)和/或測(cè)試需要使用放射性材 料和處理它們。因此，當(dāng)前的診斷技術(shù)或者不準(zhǔn)確且耗費(fèi)時(shí)間或者昂貴且需要非常精密的 實(shí)驗(yàn)室，其不能用于資源匱乏和發(fā)展中的國(guó)家。
[0006] 近些年，由于呼出的揮發(fā)性有機(jī)化合物（V0C)在肺病診斷中的潛在作用，它們 已經(jīng)吸引了增加的興趣。包括特異性識(shí)別和量化呼吸樣品中的V0C的化學(xué)分析已經(jīng)揭 示了與對(duì)照樣品對(duì)比受若干肺病折磨的患者的呼吸組成之間的關(guān)鍵區(qū)別。這些肺病包 括哮喘、慢性阻塞性肺疾患、囊性纖維化和肺癌（W02010/079491 ;U. S. 2013/143247 ;和 U. S. 2013/150261)。
[0007] 已經(jīng)執(zhí)行通過(guò)檢測(cè)從被感染的細(xì)胞和/或周圍的微環(huán)境發(fā)出的V0C來(lái)診斷傳染 病。該診斷基于下面的細(xì)胞生物學(xué)原理。細(xì)菌的細(xì)胞膜主要由兩親磷脂、碳水化合物和許 多整合膜蛋白構(gòu)成，對(duì)于不同的細(xì)胞類型，其是有區(qū)別的。當(dāng)疾病進(jìn)展時(shí)，細(xì)胞經(jīng)歷結(jié)構(gòu)變 化，該變化通常導(dǎo)致氧化應(yīng)激，即細(xì)胞膜過(guò)氧化，其引起V0C發(fā)出。已經(jīng)顯示了每個(gè)類型 的傳染病由特有的 V0C 組成表征（Dummer 等，Trends Anal. Chem. ,30,960-967(2011))。 這些V0C可以從體液樣品或包含被感染的細(xì)胞和/或組織的容器的頂部空間檢測(cè)到或 直接從呼出的呼吸檢測(cè)到，在呼出的呼吸中通過(guò)經(jīng)由血液或直接經(jīng)由肺氣道的交換反 映疾病相關(guān)的變化（Zhu 等，J. Clic. Microbiol, 48, 4426-4431 (2010);和 Naraghi 等， Sens. Actual. B，146, 521-526(2010) ;Abaffy 等，PLOSONE，5(11)，el3813, doi: 10. 1371/ journal, pone. 0013813 (2010) ;Sahgal 等，Br.J. Dermatol, 155，1209-1216 (2006); Turner，Exp. Rev. Mol. Diag.，11，497-503 (2011);和 Pennazza 等，Sens. Actual B，154, 288-294(2011))。
[0008] TB陽(yáng)性個(gè)體的尿和呼吸樣品的V0C組成中的特異性改變已經(jīng)被報(bào)道 (Banday 等，Anal. Chem.，83(14)，5526-5534(2011))。Phillips 等使用與質(zhì)譜聯(lián)用 的氣相色譜（GC-MS)來(lái)識(shí)別TB-相關(guān)的V0C，其部分出現(xiàn)在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物中 (Tuberculosis, 90, 145-151(2010);和 Tuberculosis, 87, 44-52(2007))。使用圖像識(shí)別 (pattern recognition)算法分析這些V0C提供80-84%樣品的準(zhǔn)確分類（Phillips等， Tuberculosis, 92, 314-320(2012))。Banday 等使用 GC-MS 顯示了從 TB 患者收集的尿樣品 中 V0C 濃度的顯著改變（Anal. Chem.，83, 5526-5534(2011))。
[0009] 對(duì)于用于臨床醫(yī)療點(diǎn)（point-of-care)應(yīng)用，使用GC-MS分析檢測(cè)作為TB的呼吸 生物標(biāo)記的V0C具有若干缺點(diǎn)。特別是，該技術(shù)利用相對(duì)昂貴且操作復(fù)雜的龐大的設(shè)備。另 外，它包含預(yù)濃縮步驟，其增加了分析物的污染和/或損失的風(fēng)險(xiǎn)（Buszewski等，Biomed. Chromatogr.，21，553-566(2007))。此外，在這些測(cè)量中獲得的準(zhǔn)確性是相對(duì)低的并且它不 能滿足TB篩查測(cè)試所需要的標(biāo)準(zhǔn)。Syhre等使用GC-MS用于特異性檢測(cè)作為活性TB指示 的煙酸（Tuberculosis, 89, 263-266(2009))。該方法在測(cè)量之前需要體外甲基化煙酸。此 外，該方法對(duì)于吸煙個(gè)體不能提供可靠的結(jié)果。Peled等使用GC-MS分析識(shí)別被牛分枝桿菌 (牛型結(jié)核）感染的牛的呼吸中特有V0C或V0C分布（profile)。特有的V0C分布被用于 設(shè)計(jì)基于納米技術(shù)的傳感器陣列，用于通過(guò)呼吸檢測(cè)牛分枝桿菌感染的牛（Sens. Actuat. B，171-172, 588-594(2012);圖 11)。
[0010] U. S. 2010/0291617和U. S. 2009/0239252公開(kāi)了用于識(shí)別樣品中結(jié)核分枝桿菌細(xì) 菌的方法和裝置，該方法和裝置包括檢測(cè)一種或多種揮發(fā)性有機(jī)化合物，這些揮發(fā)性有機(jī) 化合物指示該樣品中結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌的存在或響應(yīng)樣品中結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌的處理或 抗性。
[0011] U. S. 2010/0137733公開(kāi)了用于檢測(cè)對(duì)象是否有結(jié)核或監(jiān)測(cè)結(jié)核對(duì)象的方法，所述 方法包括：使來(lái)自所述對(duì)象的呼吸與設(shè)備接觸，所述設(shè)備具有氣相色譜，其中所述氣相色譜 流動(dòng)連接至檢測(cè)器陣列，以產(chǎn)生信號(hào)；和分析來(lái)自檢測(cè)器陣列的所述信號(hào)以確定所述對(duì)象 是否具有結(jié)核。
[0012] U. S. 2007/0062255公開(kāi)了用于收集和檢測(cè)人呼吸樣品中的化合物的設(shè)備，該設(shè) 備包括：手持樣品收集器，該收集器包括吸著劑相（sorbent phase);呼吸分析儀，該分析 儀包括熱解吸柱；兩個(gè)或更多個(gè)用于檢測(cè)呼吸化合物的傳感器；和流量控制器，該控制器 用于控制呼吸化合物從樣品收集器進(jìn)入呼吸分析儀的轉(zhuǎn)移，其中手持樣品收集器和呼吸分 析儀被配置為彼此流體連通，以便來(lái)自樣品收集器的呼吸化合物可進(jìn)入呼吸分析儀進(jìn)行檢 測(cè)。
[0013] U. S. 2004/0127808公開(kāi)了用于評(píng)估對(duì)象內(nèi)疾病的方法，所述方法包括：收集來(lái)自 對(duì)象呼吸的濃縮物，所述濃縮物具有乙酸或乙酸酯濃度或乙酸和乙酸酯濃度兩者；測(cè)試所 述濃縮物以測(cè)定所述乙酸或乙酸酯濃度或乙酸和乙酸酯濃度兩者；和評(píng)估所述乙酸或乙酸 酯濃度或所述乙酸和乙酸酯濃度兩者以確定對(duì)象內(nèi)疾病的存在、不存在或狀態(tài)。
[0014] 目前，沒(méi)有可用于TB診斷、適合群體篩查的簡(jiǎn)單且可靠的技術(shù)。依然對(duì)快速、準(zhǔn)確 和成本有效的TB診斷工具存在未滿足的需要，該工具可以被用在資源匱乏的健康設(shè)施中， 其包括中心基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院和臨床實(shí)驗(yàn)室，和最終在醫(yī)療點(diǎn)使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明涉及用于診斷對(duì)象內(nèi)由結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌引起的結(jié)核的傳感器，該傳感器 包括十二烷硫醇涂覆的金納米顆粒和2-甲基-2-丁烯涂覆的單壁碳納米管中的至少一種。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括多個(gè)傳感器、檢測(cè)裝置和圖像識(shí)別分析儀的系統(tǒng)和其以非侵入方式 診斷由結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌引起的結(jié)核的用途。
[0016] 本發(fā)明部分基于如此出乎意料的發(fā)現(xiàn)：包括十二烷硫醇涂覆的金納米顆粒的單個(gè) 傳感器或包括2-甲基-2- 丁烯涂覆的單壁碳納米管的單個(gè)傳感器對(duì)揮發(fā)性生物標(biāo)記提供 增強(qiáng)的靈敏性和選擇性，該生物標(biāo)記指示對(duì)象內(nèi)由結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌引起的活性結(jié)核的存 在。使用多個(gè)傳感器結(jié)合圖像識(shí)別算法提供具有超過(guò)90%的靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性的TB 陽(yáng)性和對(duì)照群體之間的辨別，由此提供超過(guò)至今為止使用的診斷測(cè)試的顯著優(yōu)勢(shì)。靈敏性、 特異性和準(zhǔn)確性不受致混淆因素影響，所述致混淆因素包括吸煙習(xí)慣、HIV感染、藥物消耗 和/或其組合。本發(fā)明由此提供快速和可靠的結(jié)核診斷，適合群體篩查。
[0017] 根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于診斷對(duì)象內(nèi)由結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌引起的結(jié)核的傳 感器，該傳感器包括十二烷硫醇涂覆的金納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方式中，傳感器基本上由 十二烷硫醇涂覆的金納米顆粒構(gòu)成。在另一個(gè)實(shí)施方式中，十二烷硫醇涂覆的金納米顆粒 處于選自1D線、2D膜和3D組合體（assembly)的構(gòu)型。每種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí) 施方式。在額外的實(shí)施方式中，金納米顆粒具有選自立方、球面和球體形態(tài)的形態(tài)。每種可 能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，金納米顆粒具有范圍從大約 3納米至大約5納米的直徑。
[0018] 根據(jù)另一個(gè)方面，發(fā)明提供用于診斷對(duì)象內(nèi)由結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌引起的結(jié)核的傳 感器，該傳感器包括2-甲基-2-丁烯涂覆的單壁碳納米管。在一個(gè)實(shí)施方式中，傳感器基 本上由2-甲基-2- 丁烯涂覆的單壁碳納米管構(gòu)成。在另一個(gè)實(shí)施方式中，2-甲基-2- 丁烯 涂覆的單壁碳納米管以隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)型組織。在額外的實(shí)施方式中，單壁碳納米管具有范圍 從大約0. 9納米至大約5納米的直徑和范圍從大約1微米至大約50微米的長(zhǎng)度。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的傳感器進(jìn)一步包括基底和所述基底上的多個(gè)電極。 在各種實(shí)施方式中，十二烷硫醇涂覆的金納米顆粒或2-甲基-2- 丁烯涂覆的單壁碳納米管 形成電極之間的導(dǎo)電路徑。在某些實(shí)施方式中，在十二烷硫醇或2-甲基-2-丁烯涂層上吸 附至少一種指示由結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌引起的結(jié)核的V0C后，電極之間的電導(dǎo)率變化，由此 提供指示結(jié)核的可測(cè)量的信號(hào)。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的傳感器以選自電容傳感器、電阻傳感器、化學(xué)電阻 (chemiresistive)傳感器、阻抗傳感器和場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器的形式配置。每種可能性代 表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。在示例性實(shí)施方式中，傳感器被配置為化學(xué)電阻器。
[0021] 在某些實(shí)施方式中，傳感器進(jìn)一步包括檢測(cè)裝置，該裝置包括用于測(cè)量電阻、電 導(dǎo)、交流電流（AC)、頻率、電容、阻抗、電感、迀移率、電勢(shì)、光學(xué)性質(zhì)或電壓閥值的變化的設(shè) 備。每種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。
[0022] 在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于診斷對(duì)象內(nèi)由結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌引起的結(jié) 核的傳感器，該傳感器基本上由十二烷硫醇涂覆的金納米顆粒和2-甲基-2-丁烯涂覆的單 壁碳納米管中至少一種、基底、所述基底上多個(gè)電極和檢測(cè)裝置構(gòu)成。
[0023] 在若干實(shí)施方式中，本發(fā)明的傳感器連同呼吸濃縮器和除濕單元中任何一個(gè)使 用。每種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。
[0024] 在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明的傳感器連同化學(xué)電阻器、化學(xué)電容器、石英晶體微量 天平、體聲波（BAW)和表面聲波（SAW)共振器、電化學(xué)電池、表面等離子共振（SPR)和光學(xué) 分光鏡中任何一個(gè)使用。每種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。
[0025] 根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明