專利名稱：具有粘孢子蟲孢子壁降解能力的幾丁質(zhì)酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有粘孢子蟲孢子壁降解能力的幾丁質(zhì)酶及其編碼基因。

背景技術(shù)：
粘孢子蟲(Myxosporidia)，粘孢子蟲綱的通稱，是變溫動物體內(nèi)常見的原生動物類寄生蟲，種類很多，現(xiàn)在報道的有近千種，除極少數(shù)寄生于兩棲動物、爬行類動物體內(nèi)外，其中絕大多數(shù)是專性魚類寄生蟲，寄生在魚類體內(nèi)外組織或腔隙器官中。粘孢子蟲的寄生引起的粘孢子蟲病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失(章晉勇，吳英松，魯義善，汪建國.魚類微孢子蟲的研究進展.水生生物學(xué)報.2004，5545-568)。
粘孢子蟲種類繁多，幾乎每年都有新種發(fā)現(xiàn)，其中每一種都會對它的寄主魚類產(chǎn)生不同程度的影響，因此粘孢子蟲病對漁業(yè)生產(chǎn)的危害極大。在粘孢子蟲病防治方面，由于粘孢子蟲的成熟孢子外有一層幾丁質(zhì)殼瓣，具有強耐藥力，至今也未篩選出一種低廉、安全、高效的藥物，使粘孢子蟲病的防治成為一個難題。目前對于粘孢子蟲病的防治，主要存在兩種意見一是以免疫預(yù)防為主，這種方法有一定效果，但由于粘孢子蟲抗原成分復(fù)雜且抗原性弱，較難制成高效的疫苗；另一種意見認為以藥物防治為主是比較好的防治方法，但因為很難找到對粘孢子蟲孢子具有專一性殺傷作用的藥物，而且藥物防治對水環(huán)境副作用大，不利于水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。我們注意到有研究證明粘孢子蟲孢子的殼瓣由幾丁質(zhì)構(gòu)成(Julius Luke，PetrVolf，Jiri Lom.Detection of chitin in spores of Myxobolus muelleri and M.subepitheliMis(Myxosporea，Myxozoa).Parasitol Res.1993.79439-440)由于幾丁質(zhì)的穩(wěn)定性使其具有很強的耐藥性，因此擬從幾丁質(zhì)降解酶入手尋找魚類粘孢子蟲防治的新途徑。
幾丁質(zhì)酶(Chitinase)廣泛存在于病毒、細菌、真菌、昆蟲、高等植物和動物中(ParkJ.K.，Morita K.，F(xiàn)ukumoto I.，Yamasaki Y.，Nakagawa T.，Kawamukai M.，MatsudaH.Purification and characterization of the Chitinase(ChiA)fromEnterobacter sp.G-1.Biosci Biotechnol Biochem，1997，61684-689)。并且發(fā)揮著不同的作用。目前，幾丁質(zhì)酶作為幾丁質(zhì)降解的主要生物酶，已經(jīng)進行了大量的研究，并建立了完整的酶學(xué)研究方法，但尚未見到將其應(yīng)用于粘孢子蟲幾丁質(zhì)殼瓣降解的報道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有粘孢子蟲孢子壁降解能力的幾丁質(zhì)酶及其編碼基因。由于粘孢子蟲的主要抗藥能力集中在其幾丁質(zhì)殼瓣上，因此本試驗的目的是從這一環(huán)境中分離得到具有降解其殼瓣能力的微生物，并對相關(guān)的幾丁質(zhì)酶基因進行克隆、表達和性質(zhì)研究，以期找到粘孢子蟲病防治的新思路。
本發(fā)明所提供的幾丁質(zhì)酶，來源于氣單胞菌(Aeromonas sp.)，名稱為ChiCD3，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì) (a)由序列表中SEQ ID №2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
(b)將SEQ ID №2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與幾丁質(zhì)酶相關(guān)的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №2由1017個氨基酸殘基組成。
所述一個或數(shù)幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
為了使(a)中的ChiCD3便于純化，可在由序列表中SEQ ID №2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
表1標簽的序列 上述(b)中的ChiCD3的編碼基因可通過將序列表中SEQ ID №1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
所述幾丁質(zhì)酶(ChiCD3)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述幾丁質(zhì)酶(ChiCD3)的編碼基因為如下1)或2)或3)的DNA分子 1)序列表中SEQ ID №1所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述幾丁質(zhì)酶的DNA分子； 3)與序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列具有80％以上的同源性的且編碼蛋白具有與幾丁質(zhì)酶相關(guān)功能的核苷酸序列。
序列表中的SEQ ID №2由3685個核苷酸組成。自SEQ ID №2的5′端第325-3378位核苷酸為編碼序列。
所述嚴格條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
含有所述幾丁質(zhì)酶的編碼基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明還提供一種含有上述基因的可降解粘孢子蟲孢子壁的菌株，即氣單胞菌(Aeromonas sp.)CD3 CGMCC NO.3169。該氣單胞菌(Aeromonas sp.)CD3，已于2009年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCC №.3169。
實驗證明，本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶具有降解幾丁質(zhì)的活性，并且可以破壞粘孢子蟲孢子壁，因此，本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶及其編碼基因可以用于防治粘孢子蟲病，特別是魚類的粘孢子蟲病。



圖1為菌株分離篩選結(jié)果；A為未與細菌共培養(yǎng)的完整粘孢子蟲孢子；B為CD3菌株對粘孢子蟲孢子降解情況，比例尺＝2μm。
圖2為TAIL-PCR引物設(shè)計圖示 圖3為chiCD3基因全長PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析 圖4為Smart預(yù)測幾丁質(zhì)酶蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域 圖5為大腸桿菌表達載體pET30a(+)/chiCD3的構(gòu)建過程示意圖 圖6為DNS法葡萄糖濃度標準曲線 圖7為本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶ChiCD3的最適反應(yīng)pH測定結(jié)果 圖8為本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶ChiCD3的最適反應(yīng)溫度測定結(jié)果 圖9為BL21-pET30a(+)/chiCD3表達ChiCD3的SDS-PAGE分析 圖10為粘孢子蟲基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳 圖11為粘孢子蟲18S rDNA片段電泳圖 圖12為本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶對粘孢子蟲的作用檢測結(jié)果
具體實施例方式 下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明做詳細說明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述百分含量如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、粘孢子蟲孢子壁降解能力的幾丁質(zhì)酶及其編碼基因的獲得 一、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選及幾丁質(zhì)酶基因片段的克隆 1、實驗材料 1)材料 DNA分子量Marker購自天根生化科技(北京)有限公司。
幾丁質(zhì)酶底物幾丁質(zhì)為Sigma公司產(chǎn)品。酵母提取物和蛋白胨購自O(shè)xford公司。其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。
2)溶液 (1)PBS緩沖液NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L，pH 7.2。
(2)50×TAE242g Tris堿，57.1mL冰乙酸，100mL EDTA(0.5mol/L，pH 8.0)，用去離子水溶解并定容至1000mL。
(3)溶菌酶混合液2mg/mL溶菌酶，50μg/mL RNaseA，0.3mol/L蔗糖，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25mmol/L EDTA(pH 8.0)。
(4)裂解緩沖液100mm Tris-HCl，100mm Na2EDTA，1.5M NaCl，10g/L CTAB，20g/L SDS，pH 8.0。
3)培養(yǎng)基 (1)LB培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，自然pH(固體培養(yǎng)基含1.8％瓊脂)。
(2)膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基NaNO3 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 3g/L，瓊脂18g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.15g/L，膠體幾丁質(zhì)2g/L，pH 7.0。
(3)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基NaNO3 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 3g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.15g/L，膠體幾丁質(zhì)2g/L，pH 7.0。
(4)培養(yǎng)基離子溶液NaNO3 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 3g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.15g/L，pH 7.0。
以上培養(yǎng)基按比例配制溶解后，121℃高壓濕熱滅菌20min。
2、實驗方法和結(jié)果 1)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株的分離 (1)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株的篩選 稱取池塘底泥樣1g，加入100ml PBS緩沖液，即成10-2菌液；制成10-2～10-7各種稀釋度的溶液，選取10-5、10-6、10-7的3個濃度各100μL分別涂布在幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)48h。挑取單菌落再劃線分離純菌。將得到的單菌株接入LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。菌種采用500μL菌液和500μL 40％甘油混合，-70℃保藏。
(2)對粘孢子蟲孢子有降解作用菌株的篩選 將收集到粘孢子蟲孢子(采自天津淡水鯉魚鰓絲的孢囊，并按照實施例二中的步驟二的步驟2所示方法鑒定，魯義善，聶品.淡水魚類粘孢子蟲的18S rDNA分子系統(tǒng)學(xué)研究.水生生物學(xué)報，2004，654-591，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所)用70％乙醇反復(fù)沖洗，用滅菌水重懸后加入到滅菌的培養(yǎng)基離子溶液中，作為細菌生長的唯一碳源；再向培養(yǎng)基中接入步驟(1)篩選得到的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌，20℃，220r/min搖床培養(yǎng)3d得到誘導(dǎo)培養(yǎng)液。
吸取菌液進行光鏡檢測，觀察細菌對粘孢子蟲孢子降解情況。將誘導(dǎo)培養(yǎng)液8,000r/min離心5min，上清液直接測定幾丁質(zhì)酶活力；菌體用20mmol/LTris-HCl(pH 8.0)重懸，然后用超聲波破碎儀(4℃，每次超聲4sec，共20次)進行裂解，裂解液測定幾丁質(zhì)酶活力。幾丁質(zhì)酶活力測定方法如下所述 底物制備膠體幾丁質(zhì)的制備在4℃下，將幾丁質(zhì)(SIGMA公司生產(chǎn)，分析純)10g放入研缽中，加丙酮40mL研磨10min；邊研磨邊緩緩加入冷濃HCl 400mL，充分研磨，使呈糊狀.于4℃放置24h，之后用玻璃棉過濾，將濾液緩緩加入到盛有2,000ml體積分數(shù)50％乙醇的燒杯中，邊加邊劇烈攪拌，然后靜置，待膠態(tài)幾丁質(zhì)析出后去除清液，收集膠態(tài)幾丁質(zhì)；用蒸餾水沖洗膠態(tài)幾丁質(zhì)至pH 7.0，以蒸餾水定容至1,000ml得到10g/L的膠體幾丁質(zhì)，冷藏備用。
幾丁質(zhì)酶酶活力單位定義在上述酶反應(yīng)體系中，酶活以每小時分解膠體幾丁質(zhì)釋放出1μg的還原糖定義為一個酶活力單位(U)。反應(yīng)產(chǎn)物中還原糖的濃度對照下述標準曲線(圖6)確定。
標準曲線的繪制 將0.01g的分析純葡萄糖準確配制成100μg/mL，用此再稀釋成6種質(zhì)量濃度0，20，40，60，80，100μg/mL。然后取幾支干凈的試管，分別加入6種不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液1mL，加入1mL DNS溶液，置于100℃水浴10min，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白對照，在540nm處測吸光度，以吸光度的減少量(各濃度吸光度與0濃度的吸光度之差)為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線，圖6。
DNS法(Berger I.R.，Reynolds D.M.The chitinase system of a strain ofstreptomyces griseus.Biochim Biophys Acta，1958，29522-534)測定培養(yǎng)液和菌體中的幾丁質(zhì)酶活力采用DNS比色法測還原糖。取4支試管，分別加入0.5mL酶液(誘導(dǎo)培養(yǎng)液上清液和菌體裂解液)和0.5mL上述制備的1％幾丁質(zhì)膠體，其中三支試管于40℃水浴60min(實驗樣品)，另外一支于4℃放置(作為對照)；水浴2h后，在樣品和對照中均加入1.5mL DNS，沸水浴10min，離心取上清液在540nm測定其OD值。根據(jù)標準曲線的結(jié)果，得出其酶活單位計算公式 酶活(y)＝(454.3x+1.4508)×50×N/2 x540nm處的光吸收。
N酶液稀釋倍數(shù)。
50將20uL酶液中的酶活折算為1mL的酶活性。
2反應(yīng)2h。
凡是能夠在培養(yǎng)液或菌體破碎液中能夠測到幾丁質(zhì)酶活力的菌株即確認為產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌。同時能夠在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長的菌株也具有侵蝕、利用粘孢子蟲孢子幾丁質(zhì)殼瓣生長的潛力。光鏡檢測細菌對粘孢子蟲降解情況(部分結(jié)果如圖1所示)。步驟1)中幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株的篩選平板共分離到4株菌CD1、CD2、CD3、CD4。按照上述步驟2)的方法以粘孢子蟲孢子做唯一碳源，對四株菌進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。按照上述DNS法測定幾丁質(zhì)酶活結(jié)果如表2所示，四株菌中CD3號幾丁質(zhì)酶活性最高。
表2.產(chǎn)幾丁質(zhì)酶微生物16S rDNA基因序列BLAST比對分析結(jié)果及幾丁質(zhì)酶產(chǎn)酶情況 2)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株的種屬鑒定 采用溶菌酶裂解法提取了產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細菌CD1、CD2、CD3和CD4的基因組DNA，并以其為模板PCR擴增16S rDNA序列。細菌16S rDNA擴增選用16S rDNA通用引物27F和1492R，以分離菌株的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。
27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 1492R5’-TACCTTGTTACGACTT-3’ 反應(yīng)體系 10×PCR buffer 5μL； dNTP mixture(2.5mmol/L each) 4μL； Taq酶(5U/μL)0.5μL； 27F(20μmol/L) 1μL； 1492R(20μmol/L) 1μL； 基因組DNA(30ng/uL)1μL； ddH2O 37.5μL； 總體積50μL。
PCR反應(yīng)參數(shù)為 95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min 30sec，25個循環(huán)；72℃延伸5min。
PCR產(chǎn)物用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出的16S rDNA片段為1,500bp左右； 擴增得到的16S rDNA的PCR產(chǎn)物由北京擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。測序引物為16S rDNA擴增用引物。測序得到的rDNA序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST比對分析，根據(jù)比對結(jié)果相似性鑒定rDNA序列所對應(yīng)菌種的種屬關(guān)系。比對結(jié)果如表2所示，結(jié)果將4株菌分別歸類于4個屬，包括Enterobacter sp.(腸桿菌屬)，Acinetobacter sp.(不動桿菌屬)，Aeromonas sp.(氣單胞菌屬)，Pseudomonas sp.(假單胞菌屬)。其中CD3屬于Aeromonas sp.(氣單胞菌屬)，將其命名為氣單胞菌(Aeromonas sp.)CD3。該氣單胞菌(Aeromonas sp.)CD3，已于2009年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCC №.3169。氣單胞菌(Aeromonassp.)CD3 16S rDNA序列如序列表中序列3所示。
3)幾丁質(zhì)酶基因片段的克隆 簡并引物的設(shè)計簡并引物的設(shè)計主要參考CODEHAP primer引物設(shè)計的原理。其設(shè)計的基本原理大體上是5’端保守3’端簡并(Rose T.M.，Schultz E.R.，Henikoff J.G.，Pietrokovski S.，McCallum C.M.，Henikoff S.Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification ofdistantly related sequences.Nucleic Acids Res.1998，261628-1635)。對糖苷水解酶第18家族微生物來源的幾丁質(zhì)酶蛋白序列進行分析。利用找到的一對保守區(qū)域的氨基酸序列，根據(jù)上述原理和密碼子的簡并性設(shè)計簡并引物GH18F和GH18R。其序列如下 GH18F5’-GGIGG ITGGA CIYTI WSICC-3’ (I表示次黃嘌呤，Y表示C或T，W表示A或T，S表示C或G) GH18R5’-ATGCA ITAYG AYTTY CAYGG-3’ (I表示次黃嘌呤，Y表示C或T) 以Aeromonas sp.CD3菌的DNA做為模板，用GH18F和GH18R引物進行PCR擴增。其中，PCR反應(yīng)體系為10×PCR buffer 5μL，dNTP mix(2.5mmol/L each) 4μL，Taq酶(5U/μL) 0.5μL，GH18F(100μmol/L) 2μL，GH18R(100μmol/L) 2μL，基因組DNA(30ng/μL)1μL，ddH2O 35.5μL，總體積 50μL。
PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃5min；94℃30sec，55℃30sec(每個循環(huán)后復(fù)性溫度下降1.0℃)，72℃30sec，5個循環(huán)；然后94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，30個循環(huán)；72℃5min。
PCR產(chǎn)物連接T載體測序，得到405bp片段，得到的序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLASTx比對分析，比對結(jié)果證明擴增得到的為幾丁質(zhì)酶基因片段。自序列表中序列1的第1556到第1961位核苷酸。
二、幾丁質(zhì)酶基因(chiCD3)全長的克隆及其分析 1、實驗材料 1)菌株，載體，工具酶，試劑 DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒和DNA純化試劑盒為TakaRa公司產(chǎn)品；實驗所用的DNA聚合酶購自TakaRa公司；各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司。DNA分子量Marker購自天根生化科技(北京)有限公司。
幾丁質(zhì)酶底物幾丁質(zhì)為Sigma公司產(chǎn)品。酵母提取物和蛋白胨購自O(shè)xford公司。其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。
2、幾丁質(zhì)酶基因全長的克隆 1)使用TAIL-PCR技術(shù)擴增幾丁質(zhì)酶基因側(cè)翼序列 根據(jù)步驟一所獲得的氣單胞菌(Aeromonas sp.)CD3的基因片段DNA序列，分別設(shè)計三條特異性引物設(shè)計方向為需要擴增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計在sp1的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規(guī)定，長度一般22-40nt，退火溫度在60-65℃。并將它們分別命名為CD3usp1，CD3usp2，CD3usp3(上游特異性引物)，CD3dsp1，CD3dsp2，CD3dsp3(下游特異性引物)(表3)。引物由上海生工生物工程有限公司和北京英駿生物技術(shù)有限公司合成。
表3.所用引物序列 (表中，I表示次黃嘌呤，Y表示C或T，W表示A或T，S表示C或G，N表示A、T、C或G) 以已經(jīng)擴增到的chiCD3基因片段為基礎(chǔ)，設(shè)計特異性sp引物(表3)，以基因組DNA為模板，使用TAIL-PCR方法克隆幾丁質(zhì)酶基因全長。引物設(shè)計圖示見圖2； 以CD3基因組DNA為模板，每條sp引物(CD3usp1、CD3usp2、CD3usp3)分別與11條AD引物(表3中所示的AD1-AD11)兩兩配對，進行三輪嵌套PCR反應(yīng)。
第一輪TAIL-PCR擴增 反應(yīng)體系 2×GC PCR buffer10μL dNTP mix(2.5mmol/L each)1.6μL TakaRa LA Taq酶(2.5U/μL) 0.2μL CD3uSp1(20μmol/L) 0.5μL AD引物(100μmol/L) 1.0μL 基因組DNA(30ng/μL) 1.0μL ddH2O 5.7μL 總體積 20μL PCR反應(yīng)程序為先95℃2min，進行1個循環(huán)；再94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，進行5個循環(huán)；再94℃30sec，30℃3min，(0.2℃/sec)，72℃2min，進行1個循環(huán)；再94℃30sec，44℃30sec，72℃2min，進行5個循環(huán)；再94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，94℃30sec，44℃30sec，72℃2min，進行12個循環(huán)；最后72℃5min，進行1個循環(huán)。
第二輪TAIL-PCR擴增 將第一輪TAIL-PCR的產(chǎn)物稀釋100倍后作為第二輪TAIL-PCR的模板。
反應(yīng)體系2×GC PCR buffer 10μLdNTP mix(2.5mmol/L each) 1.6μLTakaRa LA Taq(2.5U/μL)0.2μLCD3usp2(20μmol/L) 0.5μLAD引物(100μmol/L) 1.0μL第一輪TAIL-PCR產(chǎn)物稀釋100倍1.0μLddH2O 5.7μL 總體積 20μL PCR反應(yīng)程序為先95℃2min，進行1個循環(huán)；再94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，94℃30sec，44℃30sec，72℃2min，進行12個循環(huán)；最后72℃5min，進行1個循環(huán)。
第三輪TAIL-PCR擴增 將第二輪TAIL-PCR的產(chǎn)物稀釋100倍后作為第三輪TAIL-PCR的模板。
反應(yīng)體系 2×GC PCR buffer 25μL dNTP mix(2.5mmol/L each) 4μL TakaRa LA Taq酶(2.5U/μL) 0.4μL CD3usp3(20μmol/L) 1μL AD引物(100μmol/L) 2μL 第二輪TAIL-PCR產(chǎn)物稀釋100倍1μL ddH2O 16.6μL 總體積 50μL PCR反應(yīng)程序為先95℃2min，進行1個循環(huán)；再94℃30sec，57℃30sec，72℃2min，94℃30sec，57℃30sec，72℃2min，94℃30sec，44℃30sec，72℃2min，進行12個循環(huán)；最后72℃5min，進行1個循環(huán)。
三輪TAIL-PCR全部擴增完成后，第二、三輪PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析(每條AD引物對應(yīng)的第二，第三輪的產(chǎn)物并排點樣)。電泳緩沖液為1×TAE，電壓1-5V/cm，時間約30min。EB染色，紫外燈下觀察。
結(jié)果表明，使用TAIL-PCR技術(shù)從氣單胞菌(Aeromonas sp.)CD3中克隆幾丁質(zhì)酶基因片段chiCD3的側(cè)翼序列(圖2)。
2)幾丁質(zhì)酶基因序列的分析 將步驟1)獲得的側(cè)翼序列與幾丁質(zhì)酶基因片段拼接，最終得到共3,685個堿基，使用NCBI提供的BLAST工具和ORF finding工具進行分析，結(jié)果顯示擴增得到的序列中包括上游324bp、下游307bp的序列以及一個完整的幾丁質(zhì)酶基因開放閱讀框，命名為chiCD3。基因全長約為3,054bp。
經(jīng)菌液PCR鑒定含有外源片段的重組質(zhì)粒由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司進行測序，測序引物為T載體通用M13F和M13R引物。測序得到的序列與同源克隆得到的幾丁質(zhì)酶基因片段序列采用VectorNTI suite7軟件包的Contigexpress程序進行序列裝配。裝配后的序列通過BLAST工具與GenBank中已有幾丁質(zhì)酶序列進行比對，同時使用NCBI網(wǎng)站提供的ORF finder預(yù)測可能的幾丁質(zhì)酶基因完整ORF。結(jié)合BLAST和ORF finder的結(jié)果確認幾丁質(zhì)酶基因全長序列。
結(jié)果表明，從幾丁質(zhì)酶微生物中克隆到一個幾丁質(zhì)酶基因chiCD3，基因全長為3,054bp，其序列如序列表中序列1所示，自序列1的第325-3378位核苷酸為編碼序列，編碼1,017個殘基(序列如序列表中序列2所示)和一個終止密碼子。通過BLASTx比對，與該蛋白序列一致性最高的有功能驗證的蛋白序列是來源于Pseudoalteromonas sp.S9的幾丁質(zhì)酶，一致性為45％。
3)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的分析 應(yīng)用在線的smart軟件進行氨基酸的序列分析，推導(dǎo)出的前體蛋白質(zhì)包含有四個保守的功能域。Glyco_18為糖苷水解酶第18家族的催化結(jié)構(gòu)域(318-766殘基)，其e值為7.46e-108；ChtBD3為兩個底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(37-88殘基；972-1014殘基)e值分別為2.80e-08和2.98e-03；PfamChiC為一個幾丁質(zhì)酶C催化結(jié)構(gòu)域(775-951殘基)e值為2.40e-67。
應(yīng)用在線軟件SignalP 3.0 Server進行信號膚序列分析。Neuralnetworks(NN)法分析表明最有可能的裂解點位于第33和第34個氨基酸之間；HiddcnMarkovmodels(HMM)法分析，分析表明具有信號肽的可能性為0.754，最有可能的成熟加工剪切位點在第33和第34個氨基酸之間，其概率為0.998。兩種分析方法的結(jié)果一致。綜上所述，幾丁質(zhì)酶ChiCD3具有一長33氨基酸的信號肽，屬于分泌型蛋白。
應(yīng)用VectorNTI suite7軟件翻譯氨基酸序列并預(yù)測蛋白分子量和等電點。結(jié)果表明該基因所編碼成熟蛋白的理論分子量為110kD，預(yù)測等電點為5.5。
實施例2、本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶及其編碼基因的粘孢子蟲孢子壁降解能力的功能驗證 一、幾丁質(zhì)酶基因ChiCD3在大腸桿菌中的表達 1實驗材料 1)菌株，載體，工具酶，試劑 大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司。pET-30a(+)載體為Novagen公司產(chǎn)品。
DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒和DNA純化試劑盒為TakaRa公司產(chǎn)品，實驗所用的Taq DNA聚合酶購自TakaRa公司，各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司，DNA分子量標準購自天根生化科技(北京)有限公司。
底物幾丁質(zhì)為Sigma公司產(chǎn)品，蛋白低分子量標準購自中國科學(xué)院上海生化研究所，丙烯酰胺和N，N’-甲叉雙丙烯酰胺購自Sigma公司，酵母提取物和蛋白胨購自O(shè)xford公司，其余化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純試劑。
2)引物合成 引物由上海生工生物工程有限公司和北京英駿生物技術(shù)有限公司合成。
3)溶液 (2)5×蛋白上樣緩沖液100mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)，200mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，40g/L SDS，2g/L溴酚藍，100g/L甘油。
(3)30％丙烯酰胺溶液29g丙烯酰胺，1g N，N′-亞甲叉丙烯酰胺，加去離子水定容至100mL。
(4)考馬斯亮藍染液0.24g考馬斯亮藍R250溶于90mL甲醇∶水(1∶1，v/v)，再加入10mL冰乙酸。
(5)乙酸鈉溶液配制3mol/L乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH為5.2。
4)培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，自然pH(固體培養(yǎng)基含1.8％瓊脂)。
2、大腸桿菌表達載體及其重組菌的構(gòu)建 大腸桿菌表達載體pET30a(+)/chiCD3的構(gòu)建過程示意圖如圖5所示，具體方法如下所示 1)chiCD3基因全長的擴增 根據(jù)已克隆的chiCD3幾丁質(zhì)酶全基因序列設(shè)計引物pETCD3F和pETCD3R，在引物pETF的末端引入酶切位點Hind III，在引物pETR的末端引入Xho I酶切位點，以氣單胞菌(Aeromonas sp.)CD3CGMCC NO.3169基因組DNA為模板，進行PCR擴增。
pETCD3F Hind III 5’CCC

GCCAGGCCGCTTATCCCGCC pETCD3R Xho I 5’CCG

TAAATAGCTACAGGCAGACTT 反應(yīng)體系10×PCR buffer 5μLdNTP mix(2.5mmol/L each)4μLpfu聚合酶(5U/μL) 0.5μLpETF(10μmol/L) 1μLpETR(10μmol/L) 1μL DB5基因組DNA(30ng/μL)1μL ddH2O 37.5μL 總體積50μL PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃2.5min，32個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化并測序表明得到ChiCD3基因全長序列(序列表中序列1)。
2)大腸桿菌表達載體pET30a(+)/chiCD3的構(gòu)建 將步驟1)獲得的chiCD3基因用Hind III和Xho I雙酶切后插入到質(zhì)粒pET-30a(+)的Hind III和Xho I酶切位點之間得到重組載體，將該重組載體進行酶切和測序鑒定，將鑒定正確的含有chiCD3基因的重組載體命名為pET30a(+)/chiCD3。
3)pET30a(+)/chiCD3重組載體的轉(zhuǎn)化 將pET30a(+)/chiCD3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。以培養(yǎng)的菌液直接作為模板進行菌液PCR鑒定引物為表達引物pETCD3F和pETCD3R，PCR反應(yīng)體系如下 10×PCR buffer 2μL dNTP mix(2.5mmol/L each)1.5μL Taq酶(5U/μL) 0.2μL F primer(10μmol/L) 0.4μL R primer(10μmol/L) 0.4μL 菌液1μL ddH2O 14.5μL 總體積 20μL PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃10min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min，33個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析。
然后由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司進行測序，測序引物為pET載體通用測序引物。PCR擴增和測序結(jié)果均表明重組質(zhì)粒pET30a(+)/chiCD3已轉(zhuǎn)化入宿主大腸桿菌BL21(DE3)。
3、重組幾丁質(zhì)酶在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達 (1)將含有幾丁質(zhì)酶重組質(zhì)粒pET-30a(+)/chiCD3的大腸桿菌BL21(DE3)菌株接種于3mL含100μg/mL Kan LB培養(yǎng)基中，37℃，220r/min搖床培養(yǎng)過夜活化菌種； (2)取100μL活化菌種接種至含100μg/mL Kan的10mL LB培養(yǎng)基，37℃，220r/min搖床培養(yǎng)約2h，直至OD600為0.6左右。
(3)加入10μL 1mol/L的IPTG，20℃，220r/min搖床培養(yǎng)進行誘導(dǎo)表達48h。
4、重組幾丁質(zhì)酶在大腸桿菌中的檢測 (1)酶活性檢測 取步驟3誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液500μL，10,000r/min離心5min。分別取上清液直接檢測幾丁質(zhì)酶活性；離心后的菌體用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4.0)洗一次，然后用500μL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4.0)重懸菌體，超聲波細胞破碎儀破碎細胞，每次工作時間6s，間隔15s，超聲10次。超聲破碎過程中樣品置于冰浴保持低溫。超聲破碎后的液體12,000r/min離心5min，上清檢測幾丁質(zhì)酶活性。幾丁質(zhì)酶活力測定方法按照實施例1中步驟一的步驟2所示DNS法進行，菌體破碎液酶活為3.45U/mL誘導(dǎo)培養(yǎng)液。
(2)最適pH值和最適溫度 40℃下、在不同pH的緩沖體系(pH 2～8)中測定粗酶液的活性。重組幾丁質(zhì)酶最適pH值的測定結(jié)果如圖7，ChiCD3的最適pH值為4，在pH 7.0時，仍有66％的酶活。
在pH 4.0條件下，分別在不同溫度(20℃～70℃)測定重組幾丁質(zhì)酶的活性。最適溫度測定結(jié)果表明，ChiCD3的最適反應(yīng)溫度為60℃。將最適反應(yīng)溫度下的酶活力定義為100％，反應(yīng)溫度在20℃到30℃之間時，ChiCD3的相對酶活在50％以上(圖8)。
(3)SDS-PAGE分析 將上述菌體超聲破碎后的上清液用丙酮濃縮10倍，此濃縮液進行SDS-PAGE分析。同時以含有pET-30a(+)空載體、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的、含有幾丁質(zhì)酶重組質(zhì)粒pET-30a(+)/chiCD3的大腸桿菌BL21(DE3)菌株做對照。SDS-PAGE分析表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒pET-30a(+)-chiCD3的大腸桿菌BL21在約110kD的位置有一條明顯的蛋白帶(圖9，泳道1，箭頭示)，而作為對照的兩菌株在此處無蛋白帶(圖9，泳道2、3)。說明幾丁質(zhì)酶基因在大腸桿菌中得到表達，幾丁質(zhì)酶理論分子量為110kD，表達蛋白的分子量與理論分子量相符。
二、本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶ChiCD3對粘孢子蟲的作用 1、實驗材料 粘孢子蟲孢子采自天津淡水鯉魚鰓絲的粘孢子蟲孢囊；吳英松，汪建國.圓形碘泡蟲和關(guān)橋碘泡蟲孢子的光鏡及掃描電鏡觀察.水生生物學(xué)報，2003，27264-268；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所。
裂解緩沖液500mm NaCl、50mm Tris-HCl、pH 8.0、50mm EDTA、4％SDS，滅菌121℃、20min。
2、本發(fā)明幾丁質(zhì)酶對粘孢子蟲孢子的作用檢測 1)粘孢子蟲基因組DNA的提取 總DNA提取方法參照文獻(Zhongtang Yu and Mark Morrison.Improvedextraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples.BioTechniques，2004，36808-812)，在無菌操作臺稱取約0.25g粘孢子蟲孢子樣品置于2mL裂解管，加入1mL裂解緩沖液，再加入0.3g直徑0.1mm和0.1g直徑0.5mm氧化鋯珠；珠磨儀(Mini-BeadbeaterTM，USA)振蕩3min；70℃水浴15min；4℃16,000g離心5min，將上清倒入2mL離心管中；加入300μL新鮮裂解液到裂解管中，重復(fù)以上步驟，合并兩次上清。
在合并的上清中加入260μL 10M(NH4)Ac溶解產(chǎn)物，混勻，冰浴5min。4℃16,000g離心10min。將上清移入兩個1.5mL離心管中，每個管中加等體積異丙醇沉淀，冰浴30min。4℃16,000g離心15min，吸取上清，加入70％乙醇洗DNA沉淀，真空干燥3min。最后用100μL TE(pH 8.5)溶解DNA，并合并兩管中DNA。
在DNA樣品中加12μL RNA酶(濃度10mg/mL)，37℃水浴15min。再加20μL蛋白酶K 70℃水浴10min。加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液(酚、氯仿和異戊醇體積比為25∶24∶1)混勻，離心5min，將上清液轉(zhuǎn)入另一只離心管中，加入1∶1的氯仿和異戊醇的混合液(氯仿和異戊醇的體積比為24∶1)抽提上清液，9,000r/min離心5min，在上清液中加入0.6倍體積異丙醇，4℃過夜沉淀，12,000r/min離心15min，棄上清液，70％冰乙醇清洗兩次，無菌風(fēng)吹干，用100μL TE緩沖液溶解沉淀得到總DNA。瓊脂糖凝膠電泳分析所提取的基因組DNA長度大于10kb(圖10)。提取的基因組DNA用于后期的18S rDNA擴增。圖10中，泳道1為得到的粘孢子蟲總DNA，泳道M為分子量maker。
2)粘孢子蟲18s rDNA的PCR擴增和測序 粘孢子蟲18S rDNA擴增選用18S rDNA通用引物myxoF和myxoR，以上述獲得的粘孢子蟲的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。
myxoF5′-CGCGGTAATTCCAGCTCCAGTAG-3′； myxoR5′-ACCAGGTAAGTTTTCCCGTGTTGA-3′。
反應(yīng)體系 10×PCR buffer 5μL， dNTP mixture(2.5mmol/L each)4μL， Taq酶(5U/μL) 0.5μL， myxoF(20μmol/L)1μL， myxoR(20μmol/L)1μL， 基因組DNA(30ng/μL) 1μL， ddH2O 37.5μL， 總體積 50μL。
PCR反應(yīng)參數(shù)為 95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，25個循環(huán)；72℃延伸5min。
PCR產(chǎn)物用(1％)瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳緩沖液為1×TAE，電壓1-5V/cm，時間約30min。EB染色，紫外燈下觀察。PCR產(chǎn)物連接pEASY-T3載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，陽性克隆被挑選測序。
粘孢子蟲樣品18s rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖11所示，圖11中泳道1為粘孢子蟲18S rDNA片段，泳道M為分子量Marker。
18s rDNA測序結(jié)果進行BLAST分析。粘孢子蟲樣品18s rDNA序列與粘孢子蟲綱、雙殼目、碘泡蟲屬、單極蟲、Thelohanellus hovorkai具有96％的相似性。
3)幾丁質(zhì)酶對粘孢子蟲的作用 取誘導(dǎo)表達后的培養(yǎng)液，10,000r/min離心5min。離心后的菌體用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 7.0)重懸，超聲波細胞破碎儀破碎細胞。超聲破碎過程中樣品置于冰浴保持低溫。超聲破碎后的液體12,000r/min離心5min，上清為幾丁質(zhì)酶粗酶液。
取500μL過濾除菌的幾丁質(zhì)酶粗酶液與離心收集到的粘孢子蟲混合，調(diào)節(jié)pH值為7.0，20℃水浴2h。取出粘孢子蟲孢子進行鏡檢。
結(jié)果如圖12所示，結(jié)果表明粘孢子蟲孢子經(jīng)幾丁質(zhì)酶處理2h后能夠檢測到孢子被不同程度的侵蝕破壞(圖12)，證明本試驗中克隆到的幾丁質(zhì)酶基因chiCD3在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達產(chǎn)物能夠侵蝕破壞粘孢子蟲孢子。圖12中A為未經(jīng)幾丁質(zhì)酶作用的完整粘孢子蟲孢子；B，C，D均為被本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶不同程度降解的粘孢子蟲孢子。比例尺＝2μm。
序列表
<160>3
<210>1
<211>3685
<212>DNA
<213>氣單胞菌(Aeromonas sp.)
<400>1
ttactgatta agcagctctc tggagcttgt ggccattcgc cagcctgttc tgctgtttgc 60
caatcagcca cttcatgtta atgataattc tccttgagaa taaagattga ggggatcttg 120
tcgccttcct atactgggtt cgttcctcac agaacccagg taaagggcaa accggcagtg 180
atgtcggggc gcaatgcttc cggtctcgat cgtggatcca gatagcgggg tttccctggg 240
tgaggggtgg tttttgtggc aggtccattg ccagttgtct gcgcccatca tgcaggttgc 300
gattgttctt tgccgtggtg accaatgcca agacaaaaca aggaagataa cgatatgcaa 360
cagctcttca gacccagcag gcttgccatg ctggtcgccc ttgcggctgc gcccgcctgg 420
gcccaggccg cttatcccgc ctataaatcc ggtactgcct acaaggctgg cgatatagtc 480
agcaacgtcg gtgccctcta cgagtgcaaa gaattcccct attcaggctg gtgcggggca 540
tccccctatc actacgagcc gggggtaggc gtggtctggg cagatgcctg gaagccctat 600
ggtggcgagg tacctcctcc tgcattcggt gtggcagtca gctcaccggc tgccggtgcc 660
agctacaacg aaggagccag catggcgctg gcagtgaccc tgagcggccc ggtaacggcc 720
ttggcccggg tggaatatct tgtcgacggc acgctggccg ccacggcgag cgcctcgcca 780
tggagtgcca gctggagcgc cgccggagtg ggggcccata ccctcaaggc tcgcgcgctg 840
gataaagatg gcaaggtact gagcggggcg gattcgagct tcaacgtcgc cgccgtggtc 900
gcgcccgagg cacccaaggt gagcatcagc agcccggcca gcggcgccaa ggtgacgctg 960
ggtcgcagtg tggcggtgag cggtaacgtc accgatgcca acaacgatgt ggccaaagtc1020
gagctctatg tcgacggcaa gaaggtgggc gaagatacca ctgccccctg gcaggtgaac1080
tggacaccgg atgccaaagg cagtgccgcc ctcaagctgg tggccactga caagaccaat1140
ctgagcgacg agtcggcggc ggtgaccgtc aatgtcgagg aggccgcgct gccgcccacc1200
ggtggcaacc tctcttgtga cattcgccag gtctatcgcc cggatggcta cgagtgcatg1260
ggggatgacc atgcccgccg ggtcatcggc tacttcacct cctggcgcac cggcaagaac1320
ggcctgcccg cctatctggt gagcgatatt ccatggaaca agatcaccca catcaactac1380
gccttcgcgg cggtggatga gcagagccac accatcaagg tggacgatgc agccaccaag1440
atgacctggg atggcgtgcc gggtgccgag atggatcctg aattcgccta caagggccac1500
ttcaacctgc tgtcgaaata caagaagcag tatccggacg tgaagaccct catctcggtc1560
gggggctggg ccgatacccg cggcttctac actgccacta ccaagggtga ctgctcggtc1620
aatactgccg gtatcaacac cctggctgac tcggcagtga gctttatccg ccagtacggc1680
tttgacgggg tcgatatcga ctacgaatac cccacctcga tgaaggatgc gggcaacccc1740
aacgacttcc cgctctccaa ccagtgccgg gccaagctgt ttgccaacta cgaggtgctg1800
atgaagacct tgcgggcgcg gctcgacaac gccggtaacg aagatggtcg caagtatatg1860
ctgaccatcg cctcaccggc ctcggcctat ctgctgcgcg ggatggagaa cttccaggtc1920
acccagtacc tcgattacgt caacctgatg acctatgact tccacggtgc ctggaaccac1980
tttgtcggtc acaacgctgc cctgttcgac aacaatgccg accccgagct ctcccattgg2040
ggcgtctata cccagaccca gtttggcggt atcggttacc tcaacgcggc ctggtctgcc2100
cactacttcc gcggtgcgct ggcggctggc aagatcaacg ttggcgtgcc tatacacccg2160
cggttggcag ggtgaacgtg cagtcatggg ctgggtggca aggcagccct gccgagccag2220
aacgagtgcc agccgggcac aggtggcagc accattccgt gcggcaacgg ggcggtcggc2280
atcgacaaca tctggcatga tctcgacaag aacggcaaag agatcggcgg aggcgccgtg2340
cccatgtggc atgccaaaaa cctggagcat gcagccagcc tcggcatcac cacgctgccg2400
agttatggca ctgcctgggg tctggatccc aacaatccgg ctcacgtgat gcagggcaag2460
tatgtgcgtt actacgatga caaggcccac gcgccctggc tgtggaacga agagaagaag2520
gtgttcctct caaccgaaga tgaagagtcc atgggccaca agctcgacta catcatcaag2580
cgcggtctgg gtggcgtgat gttctgggag atggcgggtg attacgcctt cgatccggcc2640
aagaacgagt acggcatggg cagtactctg accaccctgg cttatgagaa gtttgccaag2700
gcaactctgt acaacaccaa gcaaaacgat ctggccgcgc cgagcgccca gctcgacatc2760
cagctcagcc tctccggctt caaggaaggg gactctaact atccgatcaa cccgaaactc2820
aagctggtca acaagtcgac ccagaccatt ccgggcggcg cgcgcatcga gtttctggtg2880
cccacctcaa cctctgacac catcacggat cagagtggca tgggcctgaa agtggtggag2940
agcggtggca acgacaactc ggaaggtatt gccaatgaga aggacttcca caaggtcgcc3000
atgagcctgc cgggatggca gactctggca ccgggggccg agattgaagt cgccatgacc3060
tactacctgc ccgccgctgg cgtgccgagc ggtatgcgca tcatcagcgg cagccagacc3120
attggtctca aggccgagtt cccgaccctg ccggaggccg tgctgggctc gggtggtggc3180
gagaatccgg gtaccatctg cagcagccag aacgtcaatc cggcggccta caaggcctat3240
ccgagctggc cacaggggga tcatgccaat ggcggcgatc gcattaccca taacaaggta3300
gtgtggcagg ccaactggtg gaccagcagc gagcccaagg caaccgatgg cagctggaag3360
tctgcctgta gctattgatg attttaaaat caatgagata agtgaggctt cggcctcact3420
ttttttgtct gattggtcgc tctggttgaa aatgcgcctg cctttcctgg cgggcagcct3480
ctataataga gtcgattaat aatcagatgg atatcagcgt atggcgagta tattggattc3540
cgttgatcaa cgaactcaac tggtgggtga aaaccgcctc gagttgttga tgtttcgtct3600
cggcacccgt cagatgttcg ccatcaacgt cttcaaggta cgggaagtgg tcaagttgcc3660
ccatctgagc tggatgtcga gctgg 3685
<210>2
<211>1017
<212>PRT
<213>氣單胞菌(Aeromonas sp.)
<400>2
Met Pro Arg Gln Asn Lys Glu Asp Asn Asp Met Gln Gln Leu Phe Arg
1 5 10 15
Pro Ser Arg Leu Ala Met Leu Val Ala Leu Ala Ala Ala Pro Ala Trp
20 25 30
Ala Gln Ala Ala Tyr Pro Ala Tyr Lys Ser Gly Thr Ala Tyr Lys Ala
35 40 45
Gly Asp Ile Val Ser Asn Val Gly Ala Leu Tyr Glu Cys Lys Glu Phe
50 55 60
Pro Tyr Ser Gly Trp Cys Gly Ala Ser Pro Tyr His Tyr Glu Pro Gly
65 70 75 80
Val Gly Val Val Trp Ala Asp Ala Trp Lys Pro Tyr Gly Gly Glu Val
85 90 95
Pro Pro Pro Ala Phe Gly Val Ala Val Ser Ser Pro Ala Ala Gly Ala
100 105 110
Ser Tyr Asn Glu Gly Ala Ser Met Ala Leu Ala Val Thr Leu Ser Gly
115 120 125
Pro Val Thr Ala Leu Ala Arg Val Glu Tyr Leu Val Asp Gly Thr Leu
130 135 140
Ala Ala Thr Ala Ser Ala Ser Pro Trp Ser Ala Ser Trp Ser Ala Ala
145 150 155 160
Gly Val Gly Ala His Thr Leu Lys Ala Arg Ala Leu Asp Lys Asp Gly
165 170 175
Lys Val Leu Ser Gly Ala Asp Ser Ser Phe Asn Val Ala Ala Val Val
180 185 190
Ala Pro Glu Ala Pro Lys Val Ser Ile Ser Ser Pro Ala Ser Gly Ala
195 200 205
Lys Val Thr Leu Gly Arg Ser Val Ala Val Ser Gly Asn Val Thr Asp
210 215 220
Ala Asn Asn Asp Val Ala Lys Val Glu Leu Tyr Val Asp Gly Lys Lys
225 230 235 240
Val Gly Glu Asp Thr Thr Ala Pro Trp Gln Val Asn Trp Thr Pro Asp
245 250 255
Ala Lys Gly Ser Ala Ala Leu Lys Leu Val Ala Thr Asp Lys Thr Asn
260 265 270
Leu Ser Asp Glu Ser Ala Ala Val Thr Val Asn Val Glu Glu Ala Ala
275 280 285
Leu Pro Pro Thr Gly Gly Asn Leu Ser Cys Asp Ile Arg Gln Val Tyr
290 295 300
Arg Pro Asp Gly Tyr Glu Cys Met Gly Asp Asp His Ala Arg Arg Val
305 310 315 320
Ile Gly Tyr Phe Thr Ser Trp Arg Thr Gly Lys Asn Gly Leu Pro Ala
325 330 335
Tyr Leu Val Ser Asp Ile Pro Trp Asn Lys Ile Thr His Ile Asn Tyr
340 345 350
Ala Phe Ala Ala Val Asp Glu Gln Ser His Thr Ile Lys Val Asp Asp
355 360 365
Ala Ala Thr Lys Met Thr Trp Asp Gly Val Pro Gly Ala Glu Met Asp
370 375 380
Pro Glu Phe Ala Tyr Lys Gly His Phe Asn Leu Leu Ser Lys Tyr Lys
385 390 395 400
Lys Gln Tyr Pro Asp Val Lys Thr Leu Ile Ser Val Gly Gly Trp Ala
405 410 415
Asp Thr Arg Gly Phe Tyr Thr Ala Thr Thr Lys Gly Asp Cys Ser Val
420 425 430
Asn Thr Ala Gly Ile Asn Thr Leu Ala Asp Ser Ala Val Ser Phe Ile
435 440 445
Arg Gln Tyr Gly Phe Asp Gly Val Asp Ile Asp Tyr Glu Tyr Pro Thr
450 455 460
Ser Met Lys Asp Ala Gly Asn Pro Asn Asp Phe Pro Leu Ser Asn Gln
465 470 475 480
Cys Arg Ala Lys Leu Phe Ala Asn Tyr Glu Val Leu Met Lys Thr Leu
485 490 495
Arg Ala Arg Leu Asp Asn Ala Gly Asn Glu Asp Gly Arg Lys Tyr Met
500 505 510
Leu Thr Ile Ala Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Leu Leu Arg Gly Met Glu
515 520 525
Asn Phe Gln Val Thr Gln Tyr Leu Asp Tyr Val Asn Leu Met Thr Tyr
530 535 540
Asp Phe His Gly Ala Trp Asn His Phe Val Gly His Asn Ala Ala Leu
545 550 555 560
Phe Asp Asn Asn Ala Asp Pro Glu Leu Ser His Trp Gly Val Tyr Thr
565 570 575
Gln Thr Gln Phe Gly Gly Ile Gly Tyr Leu Asn Ala Ala Trp Ser Ala
580 585 590
His Tyr Phe Arg Gly Ala Leu Ala Ala Gly Lys Ile Asn Val Gly Val
595 600 605
Pro Ile His Pro Arg Leu Ala Gly Cys Thr Cys Ser His Gly Leu Gly
610 615 620
Gly Lys Ala Ala Leu Pro Ser Gln Asn Glu Cys Gln Pro Gly Thr Gly
625 630 635 640
Gly Ser Thr Ile Pro Cys Gly Asn Gly Ala Val Gly Ile Asp Asn Ile
645 650 655
Trp His Asp Leu Asp Lys Asn Gly Lys Glu Ile Gly Gly Gly Ala Val
660 665 670
Pro Met Trp His Ala Lys Asn Leu Glu His Ala Ala Ser Leu Gly Ile
675 680 685
Thr Thr Leu Pro Ser Tyr Gly Thr Ala Trp Gly Leu Asp Pro Asn Asn
690 695 700
Pro Ala His Val Met Gln Gly Lys Tyr Val Arg Tyr Tyr Asp Asp Lys
705 710 715 720
Ala His Ala Pro Trp Leu Trp Asn Glu Glu Lys Lys Val Phe Leu Ser
725 730 735
Thr Glu Asp Glu Glu Ser Met Gly His Lys Leu Asp Tyr Ile Ile Lys
740 745 750
Arg Gly Leu Gly Gly Val Met Phe Trp Glu Met Ala Gly Asp Tyr Ala
755 760 765
Phe Asp Pro Ala Lys Asn Glu Tyr Gly Met Gly Ser Thr Leu Thr Thr
770 775 780
Leu Ala Tyr Glu Lys Phe Ala Lys Ala Thr Leu Tyr Asn Thr Lys Gln
785 790 795 800
Asn Asp Leu Ala Ala Pro Ser Ala Gln Leu Asp Ile Gln Leu Ser Leu
805 810 815
Ser Gly Phe Lys Glu Gly Asp Ser Asn Tyr Pro Ile Asn Pro Lys Leu
820 825 830
Lys Leu Val Asn Lys Ser Thr Gln Thr Ile Pro Gly Gly Ala Arg Ile
835 840 845
Glu Phe Leu Val Pro Thr Ser Thr Ser Asp Thr Ile Thr Asp Gln Ser
850 855 860
Gly Met Gly Leu Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Asn Asp Asn Ser Glu
865 870 875 880
Gly Ile Ala Asn Glu Lys Asp Phe His Lys Val Ala Met Ser Leu Pro
885 890 895
Gly Trp Gln Thr Leu Ala Pro Gly Ala Glu Ile Glu Val Ala Met Thr
900 905 910
Tyr Tyr Leu Pro Ala Ala Gly Val Pro Ser Gly Met Arg Ile Ile Ser
915 920 925
Gly Ser Gln Thr Ile Gly Leu Lys Ala Glu Phe Pro Thr Leu Pro Glu
930 935 940
Ala Val Leu Gly Ser Gly Gly Gly Glu Asn Pro Gly Thr Ile Cys Ser
945 950 955 960
Ser Gln Asn Val Asn Pro Ala Ala Tyr Lys Ala Tyr Pro Ser Trp Pro
965 970 975
Gln Gly Asp His Ala Asn Gly Gly Asp Arg Ile Thr His Asn Lys Val
980 985 990
Val Trp Gln Ala Asn Trp Trp Thr Ser Ser Glu Pro Lys Ala Thr Asp
995 10001005
Gly Ser Trp Lys Ser Ala Cys Ser Tyr
10101015
<210>3
<211>1503
<212>DNA
<213>氣單胞菌(Aeromonas sp.)
<400>3
agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60
ggcagcggga gagtagcttg ctacttttgc cggcgagcgg cggacgggtg agtaatgcct120
ggggatctgc ccagtcgagg gggataacta ctggagacgg tagctaatac cgcatacgcc180
ctacggggga aagcagggga ccttcgggcc ttgcgcgatt ggatgaaccc aggtgggatt240
agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg300
atcagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat360
attgcacaat gggggaaacc ctgatgcagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg420
ttgtaaagca ctttcagcga ggaggaaagg ttggtagcta ataactgcca gctgtgacgt480
tactcgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgtggtaata cggagggtgc540
aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggttggata agttagatgt600
gaaagccccg ggctcaacct gggaattgca tttaaaactg tccagctaga gtcttgtaga 660
ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga ataccggtgg 720
cgaaggcggc cccctggaca aagactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag 780
gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcga tttggaggct gtgtccttga 840
gacgtggctt ccggagctaa cgcgttaaat cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt 900
aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat 960
gcaacgcgaa gaaccttacc tggccttgac atgtctggaa tcctgcagag atgcgggagt1020
gccttcggga atcagaacac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt1080
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc tgtcctttgt tgccagcacg taatggtggg1140
aactcaaggg agactgccgg tgataaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca1200
tggcccttac ggccagggct acacacgtgc tacaatggcg cgtacagagg gctgcaagct1260
agcgatagtg agcgaatccc aaaaagcgcg tcgtagtccg gatcggagtc tgcaactcga1320
ctccgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgc aaatcagaat gttgcggtga atacgttccc1380
gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaccagaa gtagatagct1440
taaccttcgg gagggcgttt accacggtgt gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaag1500
gta 150權(quán)利要求
1、一種幾丁質(zhì)酶，是如下述1)或2)的蛋白質(zhì)
1)氨基酸序列是序列表中的SEQ ID №.2的蛋白質(zhì)；
2)將序列表中的SEQ ID №.2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有幾丁質(zhì)酶活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
2、權(quán)利要求1所述的幾丁質(zhì)酶的編碼基因。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述幾丁質(zhì)酶的編碼基因的核苷酸序列是下述1)、2)或3)
1)序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列；
2)在嚴格條件下可與1)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3)與序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列具有80％以上的同源性的且編碼蛋白具有與幾丁質(zhì)酶相同功能的核苷酸序列。
4、含有權(quán)利要求2或3所述的幾丁質(zhì)酶編碼基因的重組表達載體。
5、含有權(quán)利要求2或3所述的幾丁質(zhì)酶編碼基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。
6、含有權(quán)利要求2或3所述的幾丁質(zhì)酶編碼基因的轉(zhuǎn)基因重組菌。
7、權(quán)利要求1所述的幾丁質(zhì)酶在防治粘孢子蟲病中的應(yīng)用。
8、權(quán)利要求2或3所述的幾丁質(zhì)酶編碼基因在防治粘孢子蟲病中的應(yīng)用。
9、氣單胞菌(Aeromonas sp.)CD3 CGMCC NO.3169。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有粘孢子蟲孢子壁降解能力的幾丁質(zhì)酶及其編碼基因。該幾丁質(zhì)酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID №.2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有幾丁質(zhì)酶相關(guān)功能的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。實驗證明，本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶具有降解幾丁質(zhì)的活性，并且可以破壞粘孢子蟲孢子壁，因此，本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶及其編碼基因可以用于防治粘孢子蟲病，特別是魚類的粘孢子蟲病。
文檔編號C12N1/00GK101603039SQ200910088808
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月20日
發(fā)明者周志剛, 斌 姚, 劉玉春, 何夙旭, 曹雅男, 白東清, 石鵬君, 昆 孟 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所