專利名稱：：一種新的伊枯草菌素a及其同系物的制備方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術領域：
，具體涉及一種伊枯草菌素AdturinA)及其同系物的制備方法。
背景技術：
：伊枯草菌素A(IturinA)及其同系物，主要來源于芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株例如枯草芽孢桿菌(Bacillus,subtilis)的次生代謝產物，具有廣譜抗病性和不易產生抗藥性等優(yōu)點，被認為是一種天然的、具有高效抑制植物和動物病原菌的抗菌物質。尤其IturinA具有強烈的抗真菌特性，也抑制部分細菌的活性。通常芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)產生兩類次生代謝產物，一類是具有生物表面活性劑功能的生物表面活性素(Surfactin)，另一類是抗真菌活性的伊枯草菌素AdturinA)及其同系物。伊枯草菌素類物質是多種同系物組成的混合物，其中主要成分為IturinA，基本結構(圖2)是一個由7個α-氨基酸組成的環(huán)肽，在N-末端為氨基脂肪酸。其側鏈上的脂鏈基團的大小差別，構成了其同系物。IturinA的結構與活性密切相關，其側鏈上的脂鏈基團越大(η值越大)，活性越強；它的抗真菌活性還與目標細胞的細胞膜有關，它通過在細胞膜上形成離子通道，提高細胞膜的通透性從而作用于靶位點。醫(yī)學上也用天然的IturinA在一些人和動物的皮膚真菌感染方面做臨床實驗。由于它的廣譜抗真菌性以及低毒和低變態(tài)反應性，使其很有希望成為一種高價值的抗真菌藥物。然而，迄今為止，國內外均沒有良好的伊枯草菌素A及其同系物的生產方法。尤其是伊枯草菌素A及其同系物的發(fā)酵生產技術沒有突破，其產量低、成本高，發(fā)酵工藝控制難度較大，制約著其工業(yè)化生產和商業(yè)化應用。從近幾十年來國內外的報道看，伊枯草菌素A及其同系物的發(fā)酵工藝研究歷程主要分三個階段，第一階段(1995年以前)是傳統的液體深層發(fā)酵(submergedfermentation,SMF)，主要集中在探索發(fā)酵條件對生物量和產量的影響。Sandrin等人(1990)用枯草芽孢桿菌S499進行搖瓶培養(yǎng)生產伊枯草菌素A和surfactin，其最高產量分別為280mg/liter(培養(yǎng)72h時)和760mg/liter。Shoda等人(1991，1993)用枯草芽孢桿菌NB22進行小型罐液體發(fā)酵，通過改變發(fā)酵過程中溫度和通氣量來控制伊枯草菌素的產量，最高產量達到620mg/liter(培養(yǎng)72h時)。Hbid等人(1996)用枯草桿菌S499進行20L發(fā)酵罐發(fā)酵，通過改變發(fā)酵過程中氧傳遞的控制來控制伊枯草菌素的產量，最高產量達到1388mg/liter。在這一階段的研究工作中主要面臨的困難是泡沫溢出的問題，而化學消泡劑的使用又受到限制，因為化學消泡劑影響氧的傳遞速率并影響微生物的生理特性。第二階段(1992-2007)是固體發(fā)酵(solidstatedfermentation,SSF)，日本東京技術學院資源利用研究室是該階段的重要貢獻者。Akihiro等人(1993,1995)用小麥麩皮作為底物進行伊枯草菌素的生產，其產量較深層發(fā)酵提高了5-6倍，之后他們嘗試用豆腐下腳料作為發(fā)酵底物，其產量較深層發(fā)酵提高了6-8倍。Mizumoto等人(2006，2007)固體發(fā)酵生產iturin，其產量分別達到3300mg/kg濕固體培養(yǎng)基和5591μg/g濕固體培養(yǎng)基。固體發(fā)酵較深層發(fā)酵的優(yōu)勢是發(fā)酵過程簡單，菌體和產物濃度更大，而且提取時要用的溶劑更少。但因為固態(tài)發(fā)酵生產設備受到諸多因素的限制，易污染雜菌等問題，使該技術應用于大規(guī)模發(fā)酵生產受到嚴重制約。為了能夠提高液態(tài)發(fā)酵的產量，研究工作者更多的是從發(fā)酵的新方法上去尋找出路，所以伊枯草菌素發(fā)酵工藝第三階段(2004-)的研究主要是集中在發(fā)酵方法的創(chuàng)新上，該階段研究的最大貢獻者還是日本東京技術學院資源利用研究室的研究人員。2006年，該研究室Mohammad等人通過熱激活誘導分批發(fā)酵晚期的孢子重新萌發(fā)進行二次發(fā)酵生產伊枯草菌素，其產量較一次發(fā)酵提高了lOOOmg/liter，達到了4000mg/liter。二次發(fā)酵是發(fā)酵方法上的巨大的革新，具有很大的應用潛力。也就在一年之后，2007年，還是Mohammad等人用重組菌株B.sutbtilis168在生物膜上靜置培養(yǎng)生產伊枯草菌素A，其產量較傳統的深層發(fā)酵提高了2倍，達到SOOmg/liter。但在生物膜上，菌體的快速增長導致營養(yǎng)供應不足，結果導致產生較多的孢子，影響發(fā)酵效果。2004年日本昭和電工株式會社，Yoneda,Tadashi(米田正等)在申請的專利中(W02004/029273；2005年CN1685056A)介紹了IturinA及其同系物的制備方法。具體為使用菌株B.subtilisSD142及其突變株1、2，在含有2%或者更多濃度大豆粉的合成培養(yǎng)基中生產1.5g/L或更多產量的IturinA及其同系物的方法。其進行了5L罐發(fā)酵研究，結果，在野生株SD142的發(fā)酵液中，IturinA及其同系物的產量達到3.8g/L;用突變菌株1、2的發(fā)酵液中，IturinA及其同系物的產量達到了6.7g/L。該專利是迄今為止，IturinA及其同系物產量最高的制備方法。但該方法生產成本依然偏高，并且存在隨著氮源的增加，發(fā)酵產生泡沫嚴重，增加發(fā)酵工藝難度等弊病，難以實現工業(yè)化生產。本發(fā)明人長期從事枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的次生代謝產物研究工作。在對一株植物內生枯草芽孢桿菌(Bsubtilis)進行遺傳改良后發(fā)現，突變株BacillussubtilisZK-H6具有高產IturinA及其同系物，幾乎不產或微量產生Surfactin的特性。隨后，本發(fā)明人對利用枯草芽孢桿菌(Bsubtilis)發(fā)酵制備IturinA及其同系物的工藝參數和技術方法進行了研究，獲得了提高發(fā)酵體系中菌株細胞密度、有效控制發(fā)酵產生的泡沫、高產IturinA及其同系物的技術方法，因此完成了本發(fā)明。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的之一，是提供一種“吸附固定化細胞批次液體培養(yǎng)基流加補料發(fā)酵工藝”，發(fā)酵生產IturinA及其同系物；本發(fā)明的目的之二，是提供一種用于生產IturinA及其同系物的新菌株；本發(fā)明的目的之三，是提供用于生產IturinA及其同系物的培養(yǎng)基。更具體地說，本發(fā)明提供一種制備IturinA及其同系物的方法，包含以下步驟將能夠產生IturinA及其同系物的細菌在一級液體培養(yǎng)基(例如，下文所述的培養(yǎng)基A)中培養(yǎng)，作為種子液；所述的細菌主要選自芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、液化淀粉芽孢桿菌(Bacillus,amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)菌株及上述菌株的遺傳改良菌株。將在上述第一級液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的種子液接種到第二級液體培養(yǎng)基(例如，下文所述的培養(yǎng)基B)中培養(yǎng)；第二級液體培養(yǎng)基在接種第一級種子液前，加入一定比例的吸附固定化細胞材料(例如，下文所述的吸附固定化細胞材料)，以及一定比例的黏稠劑(例如，下文所述的黏稠劑)；第二級液體培養(yǎng)基接種第一級種子液后培養(yǎng)一段合適的時間，開始進行流加補料液(例如，下文所述的補料液C)的補料發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結束后，從上述發(fā)酵培養(yǎng)液中收集IturinA及其同系物。本發(fā)明的具體實施方案是，采用已知的產生IturinA及其同系物的芽孢桿菌屬菌種，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、液化淀粉芽孢桿菌(Bacillus,amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)菌株及上述菌株的遺傳改良菌；其中枯草芽孢桿菌如野生型枯草芽孢桿菌及其遺傳改良菌，枯草芽孢桿菌S499、NB22，遺傳改良菌B.sutbtilisZK-H6，ZK-3等，在液體培養(yǎng)基中進行二級發(fā)酵培養(yǎng)，在每級發(fā)酵階段選用不同的培養(yǎng)基。在接種第一級種子液前，向第二級液體培養(yǎng)基中加入一定比例的吸附固定化細胞材料，(例如下文所述的吸附固定化細胞材料)，以及一定比例的黏稠劑(例如下文所述的黏稠劑)，以達到細胞富集培養(yǎng)，減少發(fā)酵過程泡沫產生，增加IturinA及其同系物產量的目的。在第二級發(fā)酵中，以適合于第二級發(fā)酵的液體培養(yǎng)基，例如下文所述的培養(yǎng)基B，作為發(fā)酵培養(yǎng)基。接種第一級種子液后，在適合的溫度下培養(yǎng)一段時間，例如，在26°C-37°C發(fā)酵培養(yǎng)4-30小時后，選用合適的補料液，例如下文所述的補料液C，進行流加補料發(fā)酵培養(yǎng)。第二級液體培養(yǎng)流加補料(例如補料液C)的方式可以采用連續(xù)(勻速或非勻速)流加和/或間歇式流加方式，連續(xù)流加方式是優(yōu)選的。所述的連續(xù)(勻速或非勻速)流加方式，是以一定的流加速率(勻速或非勻速)將適合的補料液(例如補料液C)連續(xù)流加入第二級發(fā)酵罐中，直至停止發(fā)酵(下罐)前大約10小時。所述的間歇式流加方式，是以間隔一段時間加一次料的方式，間歇式將適合的補料液(例如補料液C)流加入第二級發(fā)酵罐中。間歇時間優(yōu)選為每隔3-24小時補料1-5次，更優(yōu)選為大約間隔6小時補料1次。本領域技術人員也可以根據需要，采用其他的適合時間間隔補料。發(fā)酵條件溫度26°C-37°C，PH:6_8發(fā)酵時間3_6天發(fā)酵結束后，發(fā)酵液除去菌體和其它固形物，用硫酸或鹽酸調發(fā)酵液的PH值至2-5，或者用飽和度在40%-70%的硫酸銨進行鹽析。收集沉淀，進行硅膠柱層析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作為洗脫溶劑，以硅膠薄層層析方法檢測(展層劑為正丁醇冰醋酸水=100520)。收集含伊枯草菌素A及其同系物的洗脫液，經濃縮后在靜置和攪拌情況下，逐漸冷卻，伊枯草菌素A及其同系物以固體形式析出，經收集，洗滌，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物產品。采用高效液相色譜法檢測IturinA及其同系物，所用條件色譜柱C1810.7ΦX250mm；流動相為45%乙腈水IOmM醋酸銨；流速lmL/min；檢測波長280nmo采用本發(fā)明工藝，在第二級發(fā)酵時，液體培養(yǎng)基只流加補料而不用出料，可以維持發(fā)酵工藝需求的較好的碳氮比；通過采用吸附固定化細胞材料，以及一定比例的黏稠劑，提高發(fā)酵體系中細菌細胞的濃度，實現較高密度的發(fā)酵，大大減少發(fā)酵過程產生的泡沫，有利于控制溶解氧濃度、溫度等技術參數，從而提高IturinA及其同系物的產量。在優(yōu)選的具體實施方案中，本發(fā)明還采用例如新菌株等技術方案來進一步提高IturinA及其同系物的產量。在優(yōu)選的本發(fā)明方法中，本發(fā)明特別提供一株用于生產IturinA及其同系物的枯草芽孢桿菌的遺傳改良菌株BacillussubtilisZK-H6；其已于2009年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.2897)。該菌株幾乎不產或微量產生Surfactin。本發(fā)明適用的吸附固定化細胞材料，可以是具備以下性能的任何材料有微孔、透氣性能好、細菌細胞易于附著、無毒無害的天然或人工合成的材料。本發(fā)明優(yōu)選的吸附固定化細胞材料，有天然纖維材料、聚乳酸微體、PVA等高分子材料微膠囊、玉米芯、糠殼、活性碳、木屑、硅藻土、煤碴等材料，作為能產生IturinA及其同系物的細菌的吸附固定化細胞材料。所采用的吸附固定化細胞材料顆粒粒徑在0.1-5.Omm,優(yōu)選顆粒粒徑為0.5-2.0mm。加入吸附固定化細胞材料的比例為1.0-200.Og/L發(fā)酵液，優(yōu)選比例為5.0-50.Og/L發(fā)酵液。本發(fā)明還在發(fā)酵液中加入了黏稠劑，以增加發(fā)酵液黏稠度，增強了細菌細胞的吸附效果，同時大大減少了發(fā)酵過程中泡沫的產生。本發(fā)明所添加的黏稠劑可以是以下物質中的1種或2種以上按任意比例混合的混合物明膠、瓊脂、可溶性淀粉、糊精、黃原膠，海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉(CMC)等，添加的濃度范圍為0.1-100.Og/L發(fā)酵液，優(yōu)選濃度為0.5-20.Og/L發(fā)酵液。本發(fā)明二級發(fā)酵所采用的培養(yǎng)基A、B，及補料液C，其具體組成如下培養(yǎng)基A(g/mL)葡萄糖0.5%-5.0%蛋白胨0.3%-5.0%牛肉膏0.1%-2.0%硫酸鎂0.05%-1.0%磷酸二氫鉀0.1%-1.0%培養(yǎng)基B(g/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>黃豆粉或黃豆粉水解液0.1%-10.0%~~0.5%-5.0%花生粉或花生粉水解液0.1%-10.0%~~0.5%-5.0%生物氮素0.1%-10.0%0.5%-5.0%本發(fā)明優(yōu)選實施方案的發(fā)酵工藝全過程為將活化后的芽孢桿菌屬菌種接種于培養(yǎng)基A中，固體培養(yǎng)或裝于三角瓶內260C_37°C搖瓶培養(yǎng)10-30小時后，以5%—30%的接種量接種于已加有滅菌培養(yǎng)基B、吸附固定化細胞材料和黏稠劑的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵生產。菌種接種于第二級發(fā)酵罐后于260C-370C，優(yōu)選28°C-33°C發(fā)酵培養(yǎng)4_30小時后，開始補料液C流加補料。補料液C流加補料方式有兩種，一種是連續(xù)(勻速或非勻速)流加，一種是間歇式流加，連續(xù)流加方式是優(yōu)選的。采用前一種方式時，以0.01-5.OL/h的速度連續(xù)(勻速或非勻速)流加補料液C，直至停止發(fā)酵(下罐)前約10小時。采用后一種方式時，即間歇式流加補料液C，間歇時間可為每隔3-24小時補料1-5次，優(yōu)選為大約間隔6小時補料1次，每次補料量為發(fā)酵液總體積的0.01%-1.0%，優(yōu)選0.1%-0.5%。發(fā)酵條件溫度26°C-37°C，PH:6_8發(fā)酵時間3_6天本發(fā)明的全工藝流程見附圖1。采用本發(fā)明工藝，菌株以較高的底物轉化率和產物合成速率生產IturinA及其同系物，IturinA及其同系物的產量可達7.Og/L以上。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液除去菌體和其它固形物，用硫酸或鹽酸調發(fā)酵液的PH值至2-5，或者用飽和度在40%-70%的硫酸銨進行鹽析。收集沉淀，進行硅膠柱層析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作為洗脫溶劑，以硅膠薄層層析方法檢測(展層劑為正丁醇冰醋酸水=100520)。收集含伊枯草菌素A及其同系物的洗脫液，經濃縮后在靜置和攪拌情況下，逐漸冷卻，伊枯草菌素A及其同系物以固體形式析出，經收集，洗滌，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物產品。采用高效液相色譜法檢測IturinA及其同系物，所用條件色譜柱C1810.7ΦX250mm；流動相為45%乙腈水IOmM醋酸銨；流速lmL/min；檢測波長280nmo本發(fā)明具有以下優(yōu)點一.采用液體培養(yǎng)基流加補料發(fā)酵，可以維持發(fā)酵工藝需求的較好的碳氮比，可以大幅提高IturinA及其同系物的產量。二.采用吸附固定化細胞技術，以及添加一定比例的黏稠劑，有利于提高發(fā)酵體系中細菌細胞的濃度，實現較高密度的發(fā)酵，大大減少發(fā)酵過程產生的泡沫，有利于控制溶解氧濃度、溫度等技術參數，從而提高IturinA及其同系物的產率。三.提取工藝流程簡單，回收率高，操作方便圖1為IturinA及其同系物發(fā)酵生產的流程圖，圖2是IturinA的結構圖。由圖中可以清楚的看出先用IturinA及其同系物生產菌種按照所需條件進行二級發(fā)酵培養(yǎng)，在第二級發(fā)酵培養(yǎng)過程中再進行流加補料，然后對發(fā)酵產物進行后處理獲得IturinA及其同系物的過程。具體實施例方式實施例1用IOOOmL三角瓶10個，每瓶裝300mL培養(yǎng)基A(葡萄糖2.0%，蛋白胨3.0%，牛肉膏0.5%，硫酸鎂0.35%，磷酸二氫鉀0.3%)，于120°C滅菌30分鐘，冷卻后接種活化后的枯草芽孢桿菌BacillussubtilisZK-H6菌液，置于30°C溫度下，搖瓶培養(yǎng)18小時。將培養(yǎng)好的菌種液按5%-10%的接種量接種于內裝50L滅菌培養(yǎng)基B、10g/L吸附固定化細胞材料(聚乳酸微體，或PVA等高分子材料微膠囊，或木屑)和2%黏稠劑(糊精，或黃原膠，或海藻酸鈉，或羧甲基纖維素鈉(CMC))的IOOL發(fā)酵罐中，(培養(yǎng)基B:淀粉2.0%乳糖1.0%蔗糖1.0%甘油0.5%葡萄糖1.0%蛋白胨1.0%花生粉5.0%黃豆粉水解液2.0%生物氮素3.0%磷酸二氫鉀0.1%氯化鈉0.5%硫酸鐵0.5%)。在28°C-30°C溫度下，通氣攪拌發(fā)酵8-15小時后，以0.1_1.OL/h的速度連續(xù)流加培養(yǎng)基C(培養(yǎng)基C:蔗糖2.0%甘油1.0%葡萄糖2.0%乳糖1.0%蛋白胨2.0%黃豆粉水解液3.0%花生粉水解液2.0%生物氮素2.0%)，直至停止發(fā)酵(下罐)前約12小時。發(fā)酵PH6-8，發(fā)酵周期4天。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液除去菌體和其它固形物，用硫酸或鹽酸調發(fā)酵液的pH值2-5，或者用飽和度在40%-70%的硫酸銨進行鹽析。收集沉淀，進行硅膠柱層析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作為洗脫溶劑，以硅膠薄層層析方法檢測(展層劑為正丁醇冰醋酸水=100520)。收集含伊枯草菌素A及其同系物的洗脫液，經濃縮后在靜置和攪拌情況下，逐漸冷卻，伊枯草菌素A及其同系物以固體形式析出，經收集，洗滌，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物產品。采用高效液相色譜法檢測IturinA及其同系物，所用條件色譜柱C1810.7ΦX250mm；流動相為45%乙腈水IOmM醋酸銨；流速lmL/min；檢測波長280nmo經檢測，經過4天發(fā)酵，IturinA及其同系物產量可達到9.5g/L發(fā)酵液，產品回收率達80%以上。實施例2用IOOOmL三角瓶12個，每瓶裝300mL培養(yǎng)基A(葡萄糖2.0%，蛋白胨3.0%，牛肉膏0.5%，硫酸鎂0.35%，磷酸二氫鉀0.3%)，于120°C滅菌30分鐘，冷卻后接種活化后的枯草芽孢桿菌BacillussubtilisZK-H6菌液，置于30°C溫度下，搖瓶培養(yǎng)18小時。將培養(yǎng)好的菌種液按5%-10%的接種量接種于內裝50L滅菌培養(yǎng)基B、15g/L吸附固定化細胞材料(天然纖維材料，或聚乳酸微體，或木屑)和5%黏稠劑(瓊脂，或可溶性淀粉，或海藻酸鈉，或羧甲基纖維素鈉(CMC))的100L發(fā)酵罐中，(培養(yǎng)基B:淀粉3.0%乳糖2.0%甘油0.6%廢糖蜜3.0%葡萄糖1.0%蛋白胨0.1%花生粉水解液5.0%黃豆粉水解液2.0%生物氮素2.0%磷酸二氫鉀0.1%氯化鈉0.5%硫酸鐵0.5%)，在28°C-30°C溫度下，通氣攪拌發(fā)酵10-15小時后，以0.5-2.OL/h的速度連續(xù)流加培養(yǎng)基C(培養(yǎng)基C:糖蜜3.0%甘油1.0%葡萄糖2.0%乳糖1.0%蛋白胨4.0%黃豆粉5.0%花生粉3.0%生物氮素3.0%)，直至停止發(fā)酵(下罐)前約12小時。發(fā)酵PH6-8，發(fā)酵周期5天。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液除去菌體和其它固形物，用硫酸或鹽酸調發(fā)酵液的pH值2-5，或者用飽和度在40%-70%的硫酸銨進行鹽析。收集沉淀，進行硅膠柱層析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作為洗脫溶劑，以硅膠薄層層析方法檢測(展層劑為正丁醇冰醋酸水=100520)。收集含伊枯草菌素A及其同系物的洗脫液，經濃縮后在靜置和攪拌情況下，逐漸冷卻，伊枯草菌素A及其同系物以固體形式析出，經收集，洗滌，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物產品。采用高效液相色譜法檢測IturinA及其同系物，所用條件色譜柱C1810.7ΦX250mm；流動相為45%乙腈水IOmM醋酸銨；流速lmL/min；檢測波長280nmo經檢測，經過5天發(fā)酵，IturinA及其同系物產量可達到10.Og/L發(fā)酵液，產品回收率達85%以上。實施例3用IOOOmL三角瓶15個，每瓶裝300mL培養(yǎng)基A(葡萄糖3.0%，蛋白胨3.0%，牛肉膏0.8%，硫酸鎂0.35%，磷酸二氫鉀0.3%)，于120°C滅菌30分鐘，冷卻后接種活化后的枯草芽孢桿菌BacillussubtilisZK-H6菌液，置于30°C溫度下，搖瓶培養(yǎng)18小時。將培養(yǎng)好的菌種液按5%-20%的接種量接種于內裝50L滅菌培養(yǎng)基B、30g/L吸附固定化細胞材料(聚乳酸微體，或PVA等高分子材料微膠囊，或玉米芯，或木屑)和8%黏稠劑(可溶性淀粉，或糊精，或海藻酸鈉)的100L發(fā)酵罐中，(培養(yǎng)基B:淀粉2.0%乳糖2.5%甘油1.5%廢糖蜜3.0%葡萄糖1.0%蛋白胨0.5%花生粉5.0%黃豆粉2.0%生物氮素4.0%磷酸二氫鉀0.1%氯化鈉0.5%硫酸鐵0.5%)，在28°C-30°C溫度下，通氣攪拌發(fā)酵10-15小時后，以間歇式流加培養(yǎng)基C(培養(yǎng)基C蔗糖/糖蜜2.0%甘油1.0%葡萄糖2.0%乳糖1.0%蛋白胨2.0%黃豆粉水解液5.0%花生粉2.0%生物氮素3.0%)，間歇時間為大約間隔6小時補料1次，每次補料量為發(fā)酵液總體積的0.1%-0.5%。發(fā)酵PH6-8，發(fā)酵周期5天。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液除去菌體和其它固形物，用硫酸或鹽酸調發(fā)酵液的pH值2-5，或者用飽和度在40%-70%的硫酸銨進行鹽析。收集沉淀，進行硅膠柱層析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作為洗脫溶劑，以硅膠薄層層析方法檢測(展層劑為正丁醇冰醋酸水=100520)。收集含伊枯草菌素A及其同系物的洗脫液，經濃縮后在靜置和攪拌情況下，逐漸冷卻，伊枯草菌素A及其同系物以固體形式析出，經收集，洗滌，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物產品。采用高效液相色譜法檢測IturinA及其同系物，所用條件色譜柱C1810.7ΦX250mm；流動相為45%乙腈水IOmM醋酸銨；流速lmL/min；檢測波長280nmo經檢測，經過5天發(fā)酵，IturinA及其同系物產量可達到8.Og/L發(fā)酵液，產品回收率達85%以上。實施例4用IOOOmL三角瓶12個，每瓶裝300mL培養(yǎng)基A(葡萄糖3.0%，蛋白胨3.0%，牛肉膏0.8%，硫酸鎂0.35%，磷酸二氫鉀0.3%)，120°C菌30分鐘，冷卻后接種活化后的堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)BF-I(本實驗室保存)菌液，置于30°C溫度下，搖瓶培養(yǎng)18小時。將培養(yǎng)好的菌種液按5%-20%的接種量接種于內裝50L滅菌培養(yǎng)基B、10g/L吸附固定化細胞材料(天然纖維材料，或聚乳酸微體，或PVA等高分子材料微膠囊，或玉米芯)和4%黏稠劑(明膠，或糊精，或海藻酸鈉，或羧甲基纖維素鈉(CMC))的100L發(fā)酵罐中，(培養(yǎng)基B:淀粉2.0%乳糖2.5%甘油1.5%廢糖蜜3.0%葡萄糖1.0%蛋白胨0.5%花生粉5.0%黃豆粉2.0%生物氮素4.0%磷酸二氫鉀0.1%氯化鈉0.5%硫酸鐵0.5%)，在28°C_30°C溫度下，通氣攪拌發(fā)酵10-15小時后，以0.5-2.OL/h的速度連續(xù)流加培養(yǎng)基C(培養(yǎng)基C:蔗糖3.0%甘油1.0%葡萄糖2.0%乳糖1.0%蛋白胨4.0%黃豆粉5.0%花生粉3.0%生物氮素3.0%)，直至停止發(fā)酵(下罐)前約12小時。發(fā)酵PH6-8，發(fā)酵周期5天。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液除去菌體和其它固形物，用硫酸或鹽酸調發(fā)酵液的pH值2-5，或者用飽和度在40%-70%的硫酸銨進行鹽析。收集沉淀，進行硅膠柱層析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作為洗脫溶劑，以硅膠薄層層析方法檢測(展層劑為正丁醇冰醋酸水=100520)。收集含伊枯草菌素A及其同系物的洗脫液，經濃縮后在靜置和攪拌情況下，逐漸冷卻，伊枯草菌素A及其同系物以固體形式析出，經收集，洗滌，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物產品。采用高效液相色譜法檢測IturinA及其同系物，所用條件色譜柱C1810.7ΦX250mm；流動相為45%乙腈水IOmM醋酸銨；流速lmL/min；檢測波長280nmo經檢測，經過5天發(fā)酵，IturinA及其同系物產量可達到7.Og/L發(fā)酵液，產品回收率達85%以上。實施例5用IOOOmL三角瓶16個，每瓶裝300mL培養(yǎng)基A(葡萄糖2.0%，蛋白胨3.0%，牛肉膏0.5%，硫酸鎂0.35%，磷酸二氫鉀0.3%)，于120°C滅菌30分鐘，冷卻后接種活化后的枯草芽孢桿菌BacillussubtilisZK-H6菌液，置于30°C溫度下，搖瓶培養(yǎng)18小時。將培養(yǎng)好的菌種液按5%-10%的接種量接種于內裝50L滅菌培養(yǎng)基B的100L發(fā)酵罐中，(培養(yǎng)基B:淀粉2.0%乳糖2.5%甘油0.6%蔗糖3.0%葡萄糖2.0%蛋白胨0.5%花生粉水解液5.0%黃豆粉水解液2.0%生物氮素3.0%磷酸二氫鉀0.1%氯化鈉0.5%硫酸鐵0.5%)，在28°C_30°C溫度下，通氣攪拌發(fā)酵10-20小時后，以0.3-1.5L/h的速度連續(xù)流加培養(yǎng)基C(培養(yǎng)基C:蔗糖2.0%甘油1.0%葡萄糖2.0%乳糖1.0%蛋白胨2.0%黃豆粉水解液4.0%花生粉水解液2.0%生物氮素5.0%)，直至停止發(fā)酵(下罐)前約12小時。發(fā)酵PH6-8，發(fā)酵周期5天。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液除去菌體和其它固形物，用硫酸或鹽酸調發(fā)酵液的pH值2-5，或者用飽和度在40%-70%的硫酸銨進行鹽析。收集沉淀，進行硅膠柱層析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作為洗脫溶劑，以硅膠薄層層析方法檢測(展層劑為正丁醇冰醋酸水=100520)。收集含伊枯草菌素A及其同系物的洗脫液，經濃縮后在靜置和攪拌情況下，逐漸冷卻，伊枯草菌素A及其同系物以固體形式析出，經收集，洗滌，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物產品。采用高效液相色譜法檢測IturinA及其同系物，所用條件色譜柱C1810.7ΦX250mm；流動相為45%乙腈水IOmM醋酸銨；流速lmL/min；檢測波長280nmo經檢測，經過5天發(fā)酵，IturinA及其同系物產量可達到9.Og/L發(fā)酵液，產品回收率達85%以上。實施例6用IOOOmL三角瓶15個，每瓶裝300mL培養(yǎng)基A(葡萄糖3.0%，蛋白胨3.0%，牛肉膏0.8%，硫酸鎂0.35%，磷酸二氫鉀0.3%)，于120°C滅菌30分鐘，冷卻后接種活化后的枯草芽孢桿菌BacillussubtilisZK-3(2003年4月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，專利保藏號為CGMCCNo.0924，分類命名枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，地址北京市海淀區(qū)中關村北一條13號中國科學院微生物研究所)菌液，置于30°C溫度下，搖瓶培養(yǎng)18小時。將培養(yǎng)好的菌種液按5%-20%的接種量接種于內裝50L滅菌培養(yǎng)基B、30g/L吸附固定化細胞材料(聚乳酸微體，或PVA等高分子材料微膠囊，或玉米芯，或木屑)和8%黏稠劑(可溶性淀粉，或黃原膠，或羧甲基纖維素鈉(CMC))的100L發(fā)酵罐中，(培養(yǎng)基B:淀粉2.0%乳糖2.5%甘油1.5%廢糖蜜3.0%葡萄糖1.0%蛋白胨0.5%花生粉5.0%黃豆粉2.0%生物氮素4.0%磷酸二氫鉀0.1%氯化鈉0.5%硫酸鐵0.5%)，在28°C-30°C溫度下，通氣攪拌發(fā)酵10-15小時后，以間歇式流加培養(yǎng)基c(培養(yǎng)基C:蔗糖/糖蜜2.0%甘油1.0%葡萄糖2.0%乳糖1.0%蛋白胨2.0%黃豆粉水解液5.0%花生粉2.0%生物氮素3.0%)，間歇時間為大約間隔6小時補料1次，每次補料量為發(fā)酵液總體積的0.1%-0.5%。發(fā)酵PH6-8，發(fā)酵周期5天。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液除去菌體和其它固形物，用硫酸或鹽酸調發(fā)酵液的pH值2-5，或者用飽和度在40%-70%的硫酸銨進行鹽析。收集沉淀，進行硅膠柱層析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作為洗脫溶劑，以硅膠薄層層析方法檢測(展層劑為正丁醇冰醋酸水=100520)。收集含伊枯草菌素A及其同系物的洗脫液，經濃縮后在靜置和攪拌情況下，逐漸冷卻，伊枯草菌素A及其同系物以固體形式析出，經收集，洗滌，干燥，即得伊枯草菌素A及其同系物產品。采用高效液相色譜法檢測IturinA及其同系物，所用條件色譜柱C1810.7ΦX250mm；流動相為45%乙腈水IOmM醋酸銨；流速lmL/min；檢測波長280nmo經檢測，經過5天發(fā)酵，IturinA及其同系物產量可達到6.5g/L發(fā)酵液，產品回收率達85%以上。應用實例1伊枯草菌素A及其同系物防治蔬菜真菌病害用的伊枯草菌素A及其同系物水劑稀釋100倍-400倍，作田間噴施，防治植物真菌病害，發(fā)病率分別降低70%，68%，72%，61%。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>應用實例2伊枯草菌素A及其同系物防治禾谷真菌病害用1%的伊枯草菌素A及其同系物水劑稀釋100倍-400倍，作田間噴施，防治植物真菌病害。若將伊枯草菌素A及其同系物與一定濃度的脫落酸(ABA)—起噴施，可以提高防治效果與防治的持效性。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權利要求一種伊枯草菌素A及其同系物的制備方法，包括菌種、制備工藝，其特征是所用菌種為能夠產生伊枯草菌素A及其同系物的芽孢桿菌屬菌株，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、液化淀粉芽孢桿菌(Bacillus.amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)菌株及上述菌株的遺傳改良菌，制備工藝分為兩級，第一級為種子液培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基A，第二級為發(fā)酵培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基B；第二級培養(yǎng)在接種種子液前，加入吸附固定化細胞材料和黏稠劑，接種種子液后，進行發(fā)酵培養(yǎng)和流加補料液C的補料發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結束后，從上述發(fā)酵培養(yǎng)液中收集伊枯草菌素A及其同系物。2.權利要求1所述的伊枯草菌素A及其同系物的制備方法，其特征是所述菌種為枯草芽孢桿菌的遺傳改良菌株BacillussubtilisZK-H6CGMCCNo.2897或BacillussubtilisZK-3CGMCCNo.0924。3.根據權利要求1所述伊枯草菌素A及其同系物的制備方法，其特征是按g/mL計，培養(yǎng)基及補料液的具體組成如下培養(yǎng)基A:葡萄糖0.5%-5.0%，蛋白胨0.3%-5.0%，牛肉膏0.-2.0%，硫酸鎂0.05%-1.0%，磷酸二氫鉀0.1%-1.0%；培養(yǎng)基B:成分—i般范圍優(yōu)選范圍淀粉0.1%-■5.0%0.3%-3.0%乳糖0.1%-■3.0%0.3%-3.0%蔗糖/糖蜜0.1%-4.0%0.3%-3.0%甘油0.1%--2.0%0.5%-2.0%葡萄糖0.1%--10.0%0.5%-6。0%蛋白胨0.3%--10.0%0.5%-8.0%黃豆粉或黃豆粉水解液0.1%--10.0%0.5%-5.0%花生粉或花生粉水解液0.1%--10.0%0.5%-5.0%生物氮素0.1%--10.0%0.5%-5.0%磷酸二氫鉀0.01%-5.0%0.05%-1.0%硫酸鎂0.01%-5.0%0.05%-1.0%氯化鈉0.01%-5.0%0.05%-1.0%硫酸鐵0.01%-5.0%0.05%-1.0%；補料液c成分—-般范圍優(yōu)選范圍蔗糖/糖蜜0.1%-40%0.3%-3.0%甘油0..1%-2.0%0.5%-2.0%葡萄糖0..1%-100%0.5%-6.0%乳糖0..1%-3.0%0.3%-3.0%蛋白胨0..3%-100%0.5%-8.0%黃豆粉或黃豆粉水解液0..1%-100%0.5%-5.0%花生粉或花生粉水解液0..1%-100%0.5%-5.0%生物氮素0.1%-10.0%0.5%-5.0%。4.根據權利要求1所述的伊枯草菌素A及其同系物的制備方法，其特征是吸附固定化細胞材料為有微孔、透氣性能好、細菌細胞易于附著、無毒無害的天然或人工合成的材料，如天然纖維材料、聚乳酸微體、PVA高分子材料微膠囊、玉米芯、糠殼、活性碳、木屑、硅藻土、煤碴；顆粒粒徑為0.1-5.0mm，優(yōu)選顆粒粒徑為0.5-2.0mm；加入量為1.0-200.Og/L發(fā)酵液，優(yōu)選比例為5.0-50.Og/L發(fā)酵液。5.根據權利要求1所述伊枯草菌素A及其同系物的制備方法，其特征是黏稠劑為明膠或/和瓊脂或/和可溶性淀粉或/和糊精或/和黃原膠或/和海藻酸鈉或/和羧甲基纖維素鈉CMC；添加黏稠劑的濃度范圍為0.1-100.Og/L發(fā)酵液，優(yōu)選濃度為0.5-20.Og/L發(fā)酵液。6.根據權利要求1所述伊枯草菌素A及其同系物的制備方法，其特征是流加補料液C的方式為連續(xù)流加方式或間歇式流加方式。7.根據權利要求6所述伊枯草菌素A及其同系物的制備方法，其特征是連續(xù)流加方式為勻速或非勻速連續(xù)流加方式，以0.01-5.OL/h的速度連續(xù)流加補料液C，直至停止發(fā)酵前約10小時。8.根據權利要求6所述伊枯草菌素A及其同系物的制備方法，其特征是間歇式流加的間歇時間為每隔3-24小時補料1-5次，優(yōu)選為間隔6小時補料1次，每次補料量為發(fā)酵液總體積的0.01%_1.0%，優(yōu)選0.-0.5%。全文摘要本發(fā)明屬于微生物
技術領域：
，具體涉及一種伊枯草菌素A(IturinA)及其同系物的制備方法。本發(fā)明將能夠產生伊枯草菌素A及其同系物的芽孢桿菌屬菌株及其遺傳改良菌，在第一級液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后作為種子液接種到第二級液體培養(yǎng)基中；第二級液體培養(yǎng)基在接種種子液前，加入一定比例的吸附固定化細胞材料和黏稠劑；第二級液體培養(yǎng)基接種種子液后進行發(fā)酵培養(yǎng)和流加補料培養(yǎng)。發(fā)酵結束后，從發(fā)酵培養(yǎng)液中收集伊枯草菌素A及其同系物。本發(fā)明具有工藝簡單、操作簡便、產量高、易于工業(yè)化等特點。文檔編號C12R1/125GK101831481SQ200910058559公開日2010年9月15日申請日期2009年3月10日優(yōu)先權日2009年3月10日發(fā)明者付雯,周金燕,張曉勇,李志東,楊杰,肖亮,譚紅,鐘娟申請人:中國科學院成都生物研究所