一種兩階段補(bǔ)料策略促進(jìn)枯草芽孢桿菌持續(xù)表達(dá)伊枯草菌素的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于提高伊枯草菌素產(chǎn)量【技術(shù)領(lǐng)域】。一種兩階段補(bǔ)料策略促進(jìn)枯草芽孢桿菌持續(xù)表達(dá)伊枯草菌素的方法，其特征在于包括如下步驟：1)菌株活化：先將枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis3-10)轉(zhuǎn)斜面在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)基為LB瓊脂培養(yǎng)基，得到活化的枯草芽孢桿菌；2)搖瓶培養(yǎng)；3)發(fā)酵罐培養(yǎng)；4)當(dāng)發(fā)酵過程中還原糖濃度降至3～4g/L時(shí)開始進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加培養(yǎng)基為：葡萄糖500g，水1L；流加培養(yǎng)過程采用兩階段控制策略，前期葡萄糖的流加速率控制在0.56g/L/h，80h后將流加速度降至0.28g/L/h，直至發(fā)酵120h結(jié)束，取上清液。利用本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)伊枯草菌素的產(chǎn)量持續(xù)高效表達(dá)，整個(gè)發(fā)酵過程中無葡萄糖積累。
【專利說明】一種兩階段補(bǔ)料策略促進(jìn)枯草芽孢桿菌持續(xù)表達(dá)伊枯草菌 素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于提高伊枯草菌素產(chǎn)量【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種兩階段補(bǔ)料策略促進(jìn)枯 草芽孢桿菌持續(xù)表達(dá)伊枯草菌素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 伊枯草菌素 A是一種具有廣譜抗真菌活性的環(huán)脂肽抗生素，其分子結(jié)構(gòu)由七個(gè)氨 基酸殘基組成的肽鏈和一個(gè)β_氨基脂肪酸側(cè)鏈（鏈長C14-C17不等）構(gòu)成，可廣泛用于防 治各種作物的真菌病害，具有抑菌持久、穩(wěn)定性好、不易產(chǎn)生抗藥性和對(duì)環(huán)境安全等優(yōu)點(diǎn)， 是一種極具研究開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景的新型生物農(nóng)藥，近年來受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。然而， 迄今為止，國內(nèi)外均沒有建立起良好的伊枯草菌素 Α及其同系物的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，尤其是 伊枯草菌素 A及其同系物的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)仍沒有取得突破，其產(chǎn)量低、成本高，發(fā)酵工 藝控制難度大，制約著其工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用。為了進(jìn)一步提高伊枯草菌素的產(chǎn)量、降 低生產(chǎn)成本，目前國內(nèi)外大部分研究集中在菌種篩選、遺傳改良、廉價(jià)原料的使用及培養(yǎng)營 養(yǎng)和環(huán)境因子的優(yōu)化等方面。利用補(bǔ)料速度控制策略提高伊枯草菌素的產(chǎn)量，尚未見文獻(xiàn) 報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種兩階段補(bǔ)料策略促進(jìn)枯草芽孢桿菌持續(xù)表達(dá)伊枯草菌 素的方法，利用本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)伊枯草菌素的產(chǎn)量持續(xù)高效表達(dá)，整個(gè)發(fā)酵過程中無葡萄糖 積累。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種兩階段補(bǔ)料策略促進(jìn)枯草芽 孢桿菌持續(xù)表達(dá)伊枯草菌素的方法，其特征在于包括如下步驟：
[0005] 1)菌株活化：先將枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis3_10) (GeneBank登陸號(hào)： JF460845,由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳守文教授饋贈(zèng)）轉(zhuǎn)斜面在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)基 為LB瓊脂培養(yǎng)基，得到活化的枯草芽孢桿菌；
[0006] 2)搖瓶培養(yǎng)：挑取活化的枯草芽孢桿菌單菌落于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng) 14小時(shí)，溫度為28°C，轉(zhuǎn)速為220rpm ;
[0007] 3)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將搖瓶培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中（7L發(fā)酵罐中）進(jìn)行 發(fā)酵120小時(shí)，發(fā)酵條件為：接種量2% (v/v)(搖瓶培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌體積為發(fā)酵罐初 始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2% )，pH7. 0,發(fā)酵通風(fēng)比為2 :1 (vvm)(通風(fēng)比為一分鐘內(nèi)通過單位體 積發(fā)酵培養(yǎng)基的空氣體積比），攪拌轉(zhuǎn)速600rpm ;
[0008] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成：菜柏90g/L，葡萄糖20g/L，Κ2ΗΡ04 · 3H201g/L， MgS04 · 7Η200· 5g/L，MnS04 · Η200· 005g/L，水 1L ;
[0009] 4)當(dāng)發(fā)酵過程中還原糖濃度降至3?4g/L時(shí)（發(fā)酵約48h)開始進(jìn)行流加培養(yǎng)，流 加培養(yǎng)基為：葡萄糖500g，水1L ;流加培養(yǎng)過程采用兩階段控制策略，前期（發(fā)酵48-80h) 葡萄糖的流加速率控制在0. 56g/L/h，80h后將流加速度降至0. 28g/L/h，直至發(fā)酵120h結(jié) 束，取上清液，上清液經(jīng)甲醇抽提后采用超高效液相色譜檢查伊枯草菌素含量。
[0010] 本發(fā)明發(fā)酵過程中使用廉價(jià)菜柏作為氮源，在細(xì)胞處在穩(wěn)定生長期（發(fā)酵約 48h)、還原糖濃度降至3-4g/L時(shí)開始補(bǔ)料；補(bǔ)料過程采用兩階段控制策略，補(bǔ)料前期（發(fā)酵 48-80h)葡萄糖的流加速率控制在0. 56g/L/h，80h后將流加速度降至0. 28g/L/h，直至發(fā)酵 120h結(jié)束。本發(fā)明的有益效果：利用本發(fā)明能顯著提高伊枯草菌素（伊枯草菌素 A)的產(chǎn) 量，伊枯草菌素產(chǎn)量由〇. 57g/L提高到了 1. 12g/L。本發(fā)明的兩階段補(bǔ)料速度控制策略對(duì)脂 肽和其它次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)和借鑒意義。利用此策略生產(chǎn)的伊枯草菌素 可用于生物農(nóng)藥、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 實(shí)施例1 :
[0012] 一種兩階段補(bǔ)料策略促進(jìn)枯草芽孢桿菌持續(xù)表達(dá)伊枯草菌素的方法，包括如下步 驟：
[0013] 1)菌株活化：先將枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis3_10) (GeneBank登陸號(hào)： JF460845,由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳守文教授饋贈(zèng)）轉(zhuǎn)斜面在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)基 為LB瓊脂培養(yǎng)基，得到活化的枯草芽孢桿菌；
[0014] 2)搖瓶培養(yǎng)：挑取活化的枯草芽孢桿菌單菌落于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng) 14小時(shí)，溫度為28°C，轉(zhuǎn)速為220rpm ;
[0015] 3)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將搖瓶培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中（7L發(fā)酵罐中）進(jìn)行 發(fā)酵120小時(shí)，發(fā)酵條件為：接種量2% (v/v)(搖瓶培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌體積為發(fā)酵罐初 始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2% )，pH7. 0 (以4mol/L氫氧化鈉溶液、4mol/L稀硫酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵 培養(yǎng)基pH)，發(fā)酵通風(fēng)比為2 :1 (vvm)(通風(fēng)比為一分鐘內(nèi)通過單位體積發(fā)酵培養(yǎng)基的空氣 體積比），攪拌轉(zhuǎn)速600rpm ;
[0016] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成：菜柏90g/L，葡萄糖20g/L，Κ2ΗΡ04 · 3H201g/L， MgS04 · 7Η200· 5g/L，MnS04 · Η200· 005g/L，水 1L ;
[0017] 4)當(dāng)發(fā)酵過程中還原糖濃度降至3?4g/L時(shí)（發(fā)酵約48h)開始進(jìn)行流加培養(yǎng)，流 加培養(yǎng)基為：葡萄糖500g，水1L ;流加培養(yǎng)過程采用兩階段控制策略，前期（發(fā)酵48-80h) 葡萄糖的流加速率控制在〇. 56g/L/h，80h后將流加速度降至0. 28g/L/h，直至發(fā)酵120h結(jié) 束，取上清液，上清液經(jīng)甲醇抽提后采用超高效液相色譜檢查伊枯草菌素含量，伊枯草菌素 產(chǎn)量為L 12g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為0· 0093g/L/h。
[0018] 對(duì)照實(shí)施例：本發(fā)明所用的菌種為枯草芽孢桿菌（BaCillusSubtilis3-10) (GeneBank登陸號(hào)：JF460845,由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳守文教授饋贈(zèng)），先轉(zhuǎn)斜面在28°C培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)24小時(shí)（培養(yǎng)基為LB瓊脂培養(yǎng)基）；然后進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)14小時(shí)（LB液體培養(yǎng)），溫 度為28°C，轉(zhuǎn)速為220rpm ;最后在7L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵72小時(shí)（發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)），發(fā) 酵條件為：接種量2% (v/v)，pH7. 0,攪拌速度600rpm，通風(fēng)比為2vvm。發(fā)酵培養(yǎng)基為（g/ L):菜柏 90g，葡萄糖 20g，Κ2ΗΡ04 · 3H201g，MgS04 · 7Η200· 5g，MnS04 · Η200· 005g，水 1L。取 上清液，上清液經(jīng)甲醇抽提后采用超高效液相色譜檢查伊枯草菌素含量，伊枯草菌素產(chǎn)量 為 0· 60g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為 0· 0083g/L/h。
[0019] 通過對(duì)照實(shí)施例說明：采用本發(fā)明的兩階段補(bǔ)料策略，能顯著提高伊枯草菌素 (伊枯草菌素 A)的產(chǎn)量。本發(fā)明整個(gè)發(fā)酵過程中無葡萄糖積累。
【權(quán)利要求】
1. 一種兩階段補(bǔ)料策略促進(jìn)枯草芽孢桿菌持續(xù)表達(dá)伊枯草菌素的方法，其特征在于包 括如下步驟： 1) 菌株活化：先將枯草芽孢桿菌（BacilluSSubtilis3-10)轉(zhuǎn)斜面在28°C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)基為LB瓊脂培養(yǎng)基，得到活化的枯草芽孢桿菌； 2) 搖瓶培養(yǎng)：挑取活化的枯草芽孢桿菌單菌落于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)14小 時(shí)，溫度為28°C，轉(zhuǎn)速為220rpm ; 3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)：將搖瓶培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵120小時(shí)，發(fā)酵 條件為：接種量2% (v/v)，pH7. 0,發(fā)酵通風(fēng)比為2 :1 (vvm)，攪拌轉(zhuǎn)速600rpm ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成：菜柏 90g/L，葡萄糖 20g/L，Κ2ΗΡ04 · 3H201g/L，MgS04 · 7Η200· 5g/ L，MnS04 · Η200· 005g/L，水 1L ; 4) 當(dāng)發(fā)酵過程中還原糖濃度降至3?4g/L時(shí)開始進(jìn)行流加培養(yǎng)，流加培養(yǎng)基為：葡萄 糖500g，水1L ;流加培養(yǎng)過程采用兩階段控制策略，前期葡萄糖的流加速率控制在0. 56g/ L/h，80h后將流加速度降至0. 28g/L/h，直至發(fā)酵120h結(jié)束，取上清液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兩階段補(bǔ)料策略促進(jìn)枯草芽孢桿菌持續(xù)表達(dá)伊枯草菌 素的方法，其特征在于：前期為發(fā)酵48-80h內(nèi)。
【文檔編號(hào)】C12P21/04GK104140991SQ201410378285
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】黃鳳洪, 金虎, 鈕琰星, 李坤朋, 張欣然, 郭勉, 萬楚筠, 李文林, 胡傳炯 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所