專利名稱：用于改良宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的信號(hào)序列和共表達(dá)的分子伴侶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了改良蛋白質(zhì)生產(chǎn)的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，本文提供的 方法涉及與蛋白質(zhì)有效連接的信號(hào)序列的用途。在一些實(shí)施方案中，與蛋白質(zhì)有效連接的 信號(hào)序列在宿主細(xì)胞中與至少一種分子伴侶組合表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)在絲狀 真菌細(xì)胞中表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及蛋白質(zhì)與酶的催化結(jié)構(gòu)域的融合， 所述酶例如葡糖淀粉酶或CBHl。一些實(shí)施方案提供了信號(hào)序列、一個(gè)或多個(gè)分子伴侶、陪伴 蛋白和/或折疊酶的組合，和/或蛋白質(zhì)與催化蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的融合。
背景技術(shù)：
宿主細(xì)胞例如酵母、絲狀真菌和細(xì)菌已長(zhǎng)期用于表達(dá)盒分泌外源蛋白質(zhì)。通常，這 些外源或蛋白質(zhì)在酵母、絲狀真菌和細(xì)菌中的生產(chǎn)，涉及表達(dá)蛋白質(zhì)以及從宿主細(xì)胞或生 長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中部分或完全純化蛋白質(zhì)。盡管一些蛋白質(zhì)需要從宿主細(xì)胞的胞內(nèi)環(huán)境中 純化，如果蛋白質(zhì)從細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中，則可以極大的簡(jiǎn)化純化。胞外蛋白質(zhì)分泌是復(fù)雜的，也是多種細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)生產(chǎn)的重要方面。與 蛋白質(zhì)分泌相關(guān)的一個(gè)因素是正確的蛋白質(zhì)折疊。在體外稀釋濃度下，許多蛋白質(zhì)可以可 逆的解折疊和再折疊，因?yàn)橹付ňo密折疊結(jié)構(gòu)所需要的全部信息都存在于蛋白質(zhì)的氨基酸 序列中。然而，體內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊發(fā)生在濃縮的大量蛋白質(zhì)的環(huán)境下，其中分子內(nèi)的折疊過(guò) 程與分子間的聚集反應(yīng)相互競(jìng)爭(zhēng)。這些復(fù)雜因素在真核表達(dá)系統(tǒng)中比在原核系統(tǒng)中更顯著.真核分泌通路的第一步是新生多肽以伸展的形式跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜的易位。多肽 的正確折疊和裝配通過(guò)分泌通路發(fā)生在ER中。然而，在多種情況下，雖然蛋白質(zhì)大量過(guò)表 達(dá)，但卻分泌不佳。實(shí)際上，在多種情況下，應(yīng)該有利于此類表達(dá)的分泌信號(hào)沒(méi)有表現(xiàn)出實(shí) 現(xiàn)所述功能。與其他蛋白質(zhì)的相互作用使所需蛋白質(zhì)的表達(dá)更加復(fù)雜化。當(dāng)在一個(gè)物種、屬 或科中嘗試表達(dá)從另一物種、屬或科的生物中獲得的蛋白質(zhì)時(shí)，上述因素甚至更加重要。例 如，擔(dān)子菌(Basidiomycete)蛋白質(zhì)(例如，漆酶)通常在子囊菌(Ascomycete)宿主(例 如，木霉屬(Trichoderma))中表達(dá)低下。實(shí)際上，盡管在真菌表達(dá)系統(tǒng)領(lǐng)域開展了大量工 作，但仍然需要改良所需蛋白質(zhì)的胞外表達(dá)。發(fā)明概述發(fā)明提供了改良蛋白質(zhì)生產(chǎn)的方法和組合物。方法涉及使用與所需蛋白質(zhì)有效連 接的信號(hào)序列，所述蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中與至少一種分子伴侶組合表達(dá)。在一些實(shí)施方案 中，在絲狀真菌細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及所需蛋白質(zhì)與宿 主蛋白質(zhì)，例如葡糖淀粉酶或CBHl催化結(jié)構(gòu)域的融合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增加絲狀真菌宿主(例如，子囊菌)中的蛋白質(zhì) 生產(chǎn)的方法和組合物，通過(guò)組合分泌信號(hào)的應(yīng)用和分子伴侶蛋白的表達(dá)，所述分子伴侶蛋 白是從與蛋白質(zhì)相同的生物體中獲得的。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是非子囊菌蛋白質(zhì)，其 與來(lái)自子囊菌宿主蛋白質(zhì)的分泌信號(hào)融合。在其他一些實(shí)施方案中，至少一種分子伴侶蛋白可用于增加與子囊菌蛋白質(zhì)的催化結(jié)構(gòu)域融合的蛋白質(zhì)的表達(dá)。一些實(shí)施方案提供了用于在子囊菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)至少一種蛋白質(zhì)的方法，通過(guò) 向宿主細(xì)胞引入多核苷酸，所述多核苷酸包括與來(lái)自和宿主相同的門、屬和/或物種的信 號(hào)序列有效連接的所需蛋白質(zhì)；共表達(dá)來(lái)自與蛋白質(zhì)相同的門、屬和/或物種的分子伴侶； 在適合蛋白質(zhì)表達(dá)和生產(chǎn)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并生產(chǎn)蛋白質(zhì)。方法任選的包括回 收所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。一些實(shí)施方案包括將蛋白質(zhì)與來(lái)自子囊菌的酶的催化結(jié)構(gòu)域融合。其 它實(shí)施方案包括將蛋白質(zhì)與來(lái)自子囊菌的全長(zhǎng)的酶融合。在一些實(shí)施方案中，子囊菌宿主 細(xì)胞是木霉屬。在一些實(shí)施方案中，分子伴侶是下列中的至少一種BIP1、ER01、PDI1、TIG1、 PRPl、PPIl、PPI2、PRP3、PRP4、鈣聯(lián)接蛋白和 LHSl。蛋白質(zhì)的選擇不限于，并可以包括來(lái)自任何屬、物種和/或科的任何下列蛋白質(zhì) 漆酶、葡糖淀粉酶、α淀粉酶、顆粒淀粉水解酶、纖維素酶、脂肪酶、木聚糖酶、角質(zhì)酶、半纖 維素酶、蛋白酶、氧化酶、漆酶及其組合。一些實(shí)施方案包括來(lái)自NSP24或CBHl基因的信號(hào) 序列。在一些實(shí)施方案中，分子伴侶基因是bipl。方法的實(shí)施方案還可以包括子囊菌啟動(dòng) 子。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞和信號(hào)序列來(lái)自相同的子囊菌宿主。在一些實(shí)施方案中， 啟動(dòng)子是來(lái)自木霉屬的CBHl啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是擔(dān)子菌蛋白質(zhì)。在一些 實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是子囊菌宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是擔(dān)子菌宿主細(xì)胞 且蛋白質(zhì)是子囊菌蛋白質(zhì)。其它一些實(shí)施方案提供了用于在子囊菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)至少一種蛋白質(zhì)的方法， 通過(guò)向子囊菌宿主細(xì)胞引入多核苷酸，所述多核苷酸包括與來(lái)自子囊菌的酶的催化結(jié)構(gòu)域 融合的所需蛋白質(zhì)，其中所需蛋白質(zhì)是擔(dān)子菌蛋白質(zhì)；共表達(dá)子囊菌的分子伴侶；在適合 蛋白質(zhì)表達(dá)和生產(chǎn)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)子囊菌宿主細(xì)胞；并生產(chǎn)蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中， 回收所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)與子囊菌信號(hào)序列有效的連接。
附圖簡(jiǎn)介

圖1顯示了木霉屬表達(dá)質(zhì)粒pTrex4-漆酶D opt的示意圖。多核苷酸序列顯示為 SEQ ID NO 1。圖2顯示了木霉屬表達(dá)質(zhì)粒pTreX2g-Bipl的示意圖。多核苷酸序列顯示為SEQ ID NO :2。圖3顯示了木霉屬表達(dá)質(zhì)粒pTrex2g-Pdil的示意圖。多核苷酸序列顯示為SEQ ID NO :3。圖4顯示了在木霉屬表達(dá)質(zhì)粒pTreX2g-Erol中使用的Erol序列的示意圖。多核 苷酸序列顯示為SEQ ID NO :4ο圖5顯示了木霉屬表達(dá)質(zhì)粒pTrGA-漆酶D opt的示意圖。多核苷酸序列顯示為 SEQ ID NO :5。圖6顯示了木霉屬表達(dá)質(zhì)粒PKB408的示意圖。多核苷酸序列顯示為SEQ ID NO 6。圖7顯示了木霉屬表達(dá)質(zhì)粒PKB410的示意圖。多核苷酸序列顯示為SEQ ID NO 7。圖8-1至8-4顯示了里氏木霉NSP24可讀框(ORF)SEQ ID NO :8。信號(hào)肽是前20個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 9)。圖9-1至9-2顯示了里氏木霉CBHl ORF (SEQ ID N0:10)。信號(hào)肽開始于堿基對(duì) 210，結(jié)束于堿基對(duì)260 (SEQ ID NO :11)。催化核心開始于堿基對(duì)261至堿基對(duì)1698 (SEQ ID NO: 12)，包括內(nèi)含子1(從堿基對(duì)671至737)和內(nèi)含子2 (從堿基對(duì)1435至1497)。接 頭序列始于堿基對(duì)1699，止于堿基對(duì)1770 (SEQ ID N0:13)。CBHl蛋白質(zhì)序列顯示為SEQID NO :14。圖10示例了漆酶產(chǎn)量的改善，通過(guò)融合單色下皮黑孔菌(c. unicolor)漆酶的編 碼基因和全長(zhǎng)木霉屬葡糖淀粉酶。菌株#8-2是CBHl漆酶融合體。菌株1066-9、1066-13 和1066-15是TrGA漆酶融合體。圖11示例了在搖瓶中漆酶產(chǎn)量的改善，通過(guò)融合單色下皮黑孔菌(C. unicolor) 漆酶的編碼基因和CBHl或NSP24信號(hào)序列。Y軸以單位/ml顯示了漆酶活性。X軸顯示了 菌株(僅CBH融合體，或具有信號(hào)序列)。圖12示例了在發(fā)酵罐中漆酶產(chǎn)量的改善，通過(guò)融合單色下皮黑孔菌漆酶的編碼 基因和CBHl或NSP24信號(hào)序列。Y軸以單位/ml顯示了漆酶活性。X軸以小時(shí)顯示了發(fā)酵 時(shí)間。圖13示例了由CBHl信號(hào)序列加BIPl分子伴侶表達(dá)，所提供的漆酶產(chǎn)量的改善。 Y軸以單位/ml顯示了漆酶活性。X軸以小時(shí)顯示了發(fā)酵時(shí)間。圖14示例了通過(guò)在搖瓶中共表達(dá)分子伴侶和單色下皮黑孔菌，在3、4和5天對(duì)漆 酶產(chǎn)量的改善。Y軸以單位/ml顯示了漆酶活性。X軸顯示了菌株(KB410-13，或與bip共 表達(dá))。圖15示例了漆酶產(chǎn)量的改善，通過(guò)融合單色下皮黑孔菌漆酶的編碼基因和CBHl 信號(hào)序列、催化結(jié)構(gòu)域和接頭，以及與Bipl、pdil或erol分子伴侶共表達(dá)。Y軸以單位/ml 顯示了漆酶活性。X軸顯示了菌株。發(fā)明詳述除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)踐涉及在分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程、重組DNA技術(shù)、微 生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、免疫學(xué)和蛋白質(zhì)純化中普遍使用的常規(guī)技 術(shù)，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握的范圍。此類技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，在多種文本和參 考文獻(xiàn)中都有描述。本文上下文中提及的所有專利、專利申請(qǐng)、文章和出版物，都通過(guò)引用 清楚地整合到本文中。^X術(shù)語(yǔ)“子囊菌”指一類屬于子囊菌門(Ascomycota)的真菌。該門的成員的特征是 存在子囊(即，含有子囊孢子的特化的囊樣細(xì)胞)。術(shù)語(yǔ)“擔(dān)子菌”指一類屬于擔(dān)子菌門的真菌。該門的成員的特征是產(chǎn)生擔(dān)孢子 (即，位于特化的棒狀末端細(xì)胞外部區(qū)域的有性孢子，所述特化細(xì)胞稱為擔(dān)子)?！暗鞍酌浮币庵妇哂性诘鞍踪|(zhì)骨架的一個(gè)或多個(gè)不同位置，催化肽鍵切割的能力的 蛋白質(zhì)或多肽的蛋白質(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)域(例如，E.C.3.4)?？梢詮奈⑸?例如，真菌或細(xì) 菌)、植物和/或動(dòng)物中獲得蛋白酶。“酸性蛋白酶”指具有在酸性條件下水解蛋白質(zhì)的能力的蛋白酶。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“分子伴侶”或“分子伴侶蛋白”通過(guò)保護(hù)未折疊區(qū)域免受周圍蛋白質(zhì)(干擾)，而有利于蛋白質(zhì)折疊，但不增加蛋白質(zhì)折疊的速率。這可以包括幫助分 泌蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中折疊和糖基化的蛋白質(zhì)及其同源物。分子伴侶可以定位在ER中。 示例性分子伴侶包括Bip (GRP78)、GRP94和酵母Lhslp，以及通過(guò)與未折疊狀態(tài)下暴露的疏 水區(qū)域結(jié)合，防止不理想的相互作用，而幫助分泌蛋白折疊的蛋白質(zhì)。分子伴侶還包括涉及 蛋白質(zhì)跨ER膜易位的蛋白質(zhì)。如本文中使用的，“陪伴蛋白”是利用ATP，幫助蛋白質(zhì)折疊為天然狀態(tài)(活性狀 態(tài))的 蛋白質(zhì)。通常，蛋白質(zhì)亞基裝配在一起形成大環(huán)裝配體(assemby)。例如，陪伴蛋白 發(fā)揮作用是通過(guò)在中央腔中與非天然蛋白質(zhì)結(jié)合，然后基于結(jié)合ATP，釋放底物蛋白質(zhì)到目 前包封的腔，而有效折疊?！罢郫B酶蛋白質(zhì)”意指催化蛋白質(zhì)折疊中的步驟，而增加蛋白質(zhì)折疊速率的蛋白 質(zhì)。例如，它們可以幫助形成二硫鍵，以及幫助與脯氨酸殘基相鄰的肽鏈形成正確的構(gòu)象。 示例性的折疊酶包括蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(Pdi)及其同源物，和脯氨酰-肽基順?lè)串悩?gòu)酶 及其同源物。如本文中使用的，“NSP24家族蛋白酶，，意指在其天然的或野生型類型具有蛋白酶 活性的酶，并屬于NSP24蛋白酶的家族。NSP24蛋白酶是酸性蛋白酶，例如酸性真菌蛋白 酶。NSP24蛋白酶具有與SEQ ID NO 8的氨基酸序列及其生物學(xué)活性片段，至少85%、至少 90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%和至少99%的序列同一性。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“所需的蛋白質(zhì)”意指目標(biāo)蛋白質(zhì)。在本申請(qǐng)中，所需的蛋白 質(zhì)和目標(biāo)蛋白質(zhì)是可互換的使用的。在一些實(shí)施方案中，所需的蛋白質(zhì)是可商購(gòu)的重要工 業(yè)蛋白。術(shù)語(yǔ)意在涵蓋由天然存在的基因、突變基因和/或合成的基因編碼的蛋白質(zhì)。所 需的蛋白質(zhì)可以是宿主細(xì)胞天然的蛋白質(zhì)，或者對(duì)宿主細(xì)胞非天然的(異源的)蛋白質(zhì)。如本文中使用的，“衍生物”意指源自前體或親本蛋白質(zhì)(例如，天然蛋白質(zhì))的蛋 白質(zhì)，通過(guò)在C-和/或N-末端添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)不同位 點(diǎn)取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在蛋白質(zhì)的一端或兩端或者在氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺 失一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或者在氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。術(shù)語(yǔ)“重組”指不天然存在于宿主細(xì)胞中的多核苷酸或多肽。重組分子可以包括 以不天然存在的方式相互連接的兩條或多條天然存在的序列。 術(shù)語(yǔ)“肽”、“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可互換的使用的。如本文中使用的，“百分比(％ )序列同一性”在涉及氨基酸或核苷酸序列時(shí)，定義 為在比對(duì)序列并且如果需要，為了獲得最大百分比序列同一性而引入空位后，候選序列中 與目標(biāo)序列(例如，NSP24信號(hào)肽序列)中的氨基酸殘基或核苷酸相同的氨基酸殘基或核 苷酸的百分比，且不考慮任何保守性取代作為序列同一性的一部分。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“α淀粉酶(例如，E.C.3.2. 1. 1類)”指催化α_1，4_糖 苷鍵水解的酶。這類酶也被描述為影響含有1，4_α連接的D-葡萄糖單位的多糖中的1， 4_ α-D-糖苷鍵外切或內(nèi)切水解的酶。用于描述這類酶的另一個(gè)術(shù)語(yǔ)是“糖原酶”。示例性 的酶包括α -1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“葡糖淀粉酶”指淀粉葡糖苷酶類的酶(例如，EC. 3. 2. 1. 3、 葡糖淀粉酶、1,4-a -D-葡聚糖葡糖水解酶)。這些是外切作用的酶，從直鏈淀粉和支鏈淀 粉分子的非還原端釋放葡糖基殘基。酶還水解α-1，6_和α-1，3-鍵，盡管以遠(yuǎn)低于水解α-1，4-鍵的速率。

術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”意指涉及結(jié)合RNA聚合酶，起始基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列。如本文中使用的，“異源啟動(dòng)子”指這樣的啟動(dòng)子，其與基因或純化的核酸處于相 關(guān)聯(lián)，但與所述基因或純化的核酸不是天然相關(guān)的。如本文中使用的，多肽的“純化制品，，和“基本純的制品，，意指已經(jīng)與其天然存在 的細(xì)胞、其它蛋白質(zhì)、脂類或核酸分離的多肽。如本文中使用的，“同源”指兩個(gè)或多個(gè)多肽分子之間，或兩個(gè)或多個(gè)核酸分子之 間的序列相似性。當(dāng)比較的序列位置被相同的堿基或氨基酸單體亞基占據(jù)(例如，如果兩 條DNA分子中每一條的位置都被腺嘌呤占據(jù))，則分子在該位置是同源的。兩條序列之間的 百分比同源性是兩條序列共享的匹配或同源位置數(shù)除以位置數(shù)再乘以100的函數(shù)。例如， 如果兩條序列中的10個(gè)位置有6個(gè)是匹配或同源的，則兩條序列是60%同源。作為示例， DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50%同源性。通常，當(dāng)兩條序列被比對(duì)以給出最大同源性時(shí) 進(jìn)行比較。在本文中，術(shù)語(yǔ)“ ％同源性”與術(shù)語(yǔ)“ %同一性”可互換的使用的，指當(dāng)使用序列 比對(duì)程序進(jìn)行比對(duì)時(shí)，在核酸序列或氨基酸序列之間的核酸或氨基酸序列同一性的水平。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“載體”指設(shè)計(jì)用于將核酸引入一種或多種細(xì)胞類型中的多 核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體顆粒、盒等。如本文中使用的，“表達(dá)載體”意指包括與合適的控制序列有效連接的DNA序列的 DNA構(gòu)建體，所述控制序列能夠影響DNA在合適宿主中的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”意指基于基因的核酸序列生產(chǎn)多肽的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)“共表達(dá)”意指在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)至少2個(gè)不同的基因。其可以是外源基因 或內(nèi)源基因。其可以整合到相同或不同質(zhì)?；驈南嗤虿煌馁|(zhì)粒中表達(dá)，并且可以從相 同或不同的啟動(dòng)子表達(dá)。如本文中使用的，“有效的連接的”意指調(diào)控區(qū)(例如，啟動(dòng)子、終止子、分泌信號(hào)或 增強(qiáng)子區(qū))與結(jié)構(gòu)基因是關(guān)聯(lián)的或連接的，并控制所述基因的表達(dá)。如果信號(hào)序列通過(guò)宿 主細(xì)胞的分泌系統(tǒng)指導(dǎo)蛋白質(zhì)，則它與蛋白質(zhì)是有效連接的。如本文中使用的，“微生物”指細(xì)菌、真菌、病毒、原生動(dòng)物和其他微生物或微觀生 物體。術(shù)語(yǔ)“絲狀真菌”指本領(lǐng)域已知的真菌亞門(Eumycotina)的所有絲狀形態(tài)。這 類真菌的特征是營(yíng)養(yǎng)菌絲體，其具有細(xì)胞壁，所述細(xì)胞壁含有殼多糖、纖維素和其他復(fù)雜多 糖。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)上與酵母不同。絲狀真菌通過(guò)菌絲延長(zhǎng) 進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，碳代謝是專性好氧的。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“木霉屬(Trichoderma) ”和“木霉屬物種(Trichoderma sp.) ”指以前或現(xiàn)在分類為木霉屬的任何真菌屬。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”指在合適條件下，在液體、半固體或固體培養(yǎng)基中生 長(zhǎng)微生物細(xì)胞群體。在一些實(shí)施方案中，如本領(lǐng)域已知的，在容器或反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。在 一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)導(dǎo)致淀粉底物(例如，包含顆粒淀粉的底物)發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化為終產(chǎn) 物?！鞍l(fā)酵”指微生物對(duì)有機(jī)物質(zhì)的酶促和厭氧降解，產(chǎn)生更簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物。發(fā)酵 通常在厭氧條件下發(fā)生，但該術(shù)語(yǔ)并非意在唯一限制為嚴(yán)格的厭氧條件，因?yàn)樵谘鯕獯嬖诘臈l件下也可以發(fā)生發(fā)酵。在將核酸序列插入到細(xì)胞內(nèi)的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“引入”意指“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn) 導(dǎo)”，包括指核酸序列向真核或原核細(xì)胞內(nèi)的摻入，其中，核酸序列或者摻入到細(xì)胞基因組 內(nèi)(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制子，或者瞬時(shí)的表達(dá)(例如，轉(zhuǎn) 染的mRNA)。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)基因”用于指細(xì)胞時(shí)，意指 細(xì)胞具有非天然的核酸序列，所述序列被整合到其基因組中，或者作為附加型質(zhì)粒在多代 中維持。 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“異源的”用于指編碼所需蛋白質(zhì)的多肽或多核苷酸時(shí)，意 指多肽或多核苷酸不是天然存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的。術(shù)語(yǔ)“同源的”或“內(nèi)源的”在涉及編碼所需蛋白質(zhì)的多肽或多核苷酸時(shí)，指多肽 或多核苷酸是天然存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的，或由宿主細(xì)胞天然表達(dá)的。術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)”意指在宿主細(xì)胞中以大于野生型宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的水平表達(dá)多肽 的過(guò)程。在一些實(shí)施方案中，將至少一種多核苷酸引入宿主細(xì)胞。在其他一些實(shí)施方案中， 術(shù)語(yǔ)指同源多肽以這樣的濃度表達(dá)，所述濃度大于野生型細(xì)胞表達(dá)的相同的同源多肽的表 達(dá)。如本文中使用的，發(fā)明的一個(gè)方面的特征是“基本純的”核酸，所述核酸包括編碼 與蛋白質(zhì)有效連接的NSP24信號(hào)肽或CBHl信號(hào)肽的核苷酸序列，和/或此類核酸的等價(jià) 體。在這些實(shí)施方案中，核酸分離自其它核酸和/或細(xì)胞成分。術(shù)語(yǔ)“等價(jià)體”指編碼功能性等價(jià)的多肽的核苷酸序列。等價(jià)的核苷酸序列涵蓋 了由于一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加和/或缺失而不同的序列，例如等位變體。例如，在一 些實(shí)施方案中，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，等價(jià)的核苷酸序列包括這樣的序列，所述序列不同 于核苷酸序列SEQ ID NO :8，但導(dǎo)致產(chǎn)生與SEQ ID NO :8編碼的多肽序列功能性等價(jià)的多 肽。本發(fā)明提供了生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)的方法。方法包括步驟(a)將第一核酸序列引入 宿主細(xì)胞，所述第一核酸序列包括與所需的蛋白質(zhì)序列有效連接的信號(hào)序列；(b)表達(dá)第 一核酸序列；(c)共表達(dá)編碼分子伴侶或折疊酶的第二核酸序列，所述分子伴侶或折疊酶 選自 bipl、erol、pdil、tigl、prpl、ppil、ppi2、prp3、prp4、鈣聯(lián)接蛋白和 Ihsl ；和(d)收 集從宿主細(xì)胞分泌的所需蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一核酸序列還包括在信號(hào)序列和所需的蛋白質(zhì)序列之間的 酶序列。例如，酶序列獲得自葡糖淀粉酶或CBHl酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶序列是全長(zhǎng)的 酶序列，所述酶序列包括催化結(jié)構(gòu)域、接頭和結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酶序列包 括催化結(jié)構(gòu)域序列，其通過(guò)接頭與所需的蛋白質(zhì)序列相連。在一些實(shí)施方案中，酶是在其天 然宿主中高表達(dá)和/或分泌的宿主蛋白質(zhì)。第一核酸序列還包括在信號(hào)序列上游的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是宿 主細(xì)胞天然的，且與所需的蛋白質(zhì)序列不是天然相關(guān)的。第二核酸序列與啟動(dòng)子有效的連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是宿主細(xì)胞天然 的，且與第二核酸序列不是天然相關(guān)的。增加的蛋白質(zhì)表達(dá)
本發(fā)明提供了用于在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)的方法。通過(guò)包括分泌信號(hào)(例 如，NSP24信號(hào)肽或CBHl信號(hào)肽)，并結(jié)合分子伴侶、陪伴蛋白和/或折疊酶蛋白的共表達(dá)， 增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量。在一些實(shí)施方案中，分泌信號(hào)來(lái)自子囊菌宿主蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案 中，所需的蛋白質(zhì)與酶的催化結(jié)構(gòu)域融合。本發(fā)明提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)，特別是考慮到這樣的事實(shí)，即，在子囊菌宿主中難以生 產(chǎn)大量來(lái)自其它真菌家族的蛋白質(zhì)。實(shí)際上，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在真菌或細(xì)菌宿主中通 常難以生產(chǎn)任何異源的真菌蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了適合在合適的真菌或細(xì)菌宿主中，生產(chǎn) 任何合適蛋白質(zhì)的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，真菌宿主是子囊菌，蛋白質(zhì)是擔(dān)子菌 蛋白質(zhì)，而在其它實(shí)施方案中，真菌宿主是擔(dān)子菌，而蛋白質(zhì)是子囊菌蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于在宿主中增加蛋白質(zhì)表達(dá)和/或分泌的方 法，利用宿主信號(hào)肽與來(lái)自和蛋白質(zhì)來(lái)源的相同生物體的一種或多種伴侶分子或折疊酶的 共表達(dá)組合。因此，在一些實(shí)施方案中，利用擔(dān)子菌宿主信號(hào)肽和子囊菌分子伴侶，在擔(dān)子 菌宿主中表達(dá)異源的子囊菌蛋白質(zhì)。在一些備選的實(shí)施方案中，利用子囊菌信號(hào)肽和子囊 菌或擔(dān)子菌分子伴侶，在子囊菌宿主中表達(dá)異源的擔(dān)子菌蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，子囊 菌宿主是木霉屬的成員。在一些實(shí)施方案中，木霉是里氏木霉，包括里氏木霉的多個(gè)菌株。 在一些備選的實(shí)施方案中，擔(dān)子菌是下皮黑孔屬(Cerrena)的成員，包括但不限于單色下 皮黑孔菌。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)將蛋白質(zhì)與宿主酶融合，并與來(lái)自與所需蛋白 質(zhì)相同生物體的一種或多種分子伴侶外源共表達(dá)組合，來(lái)增加所需蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或分 泌。通過(guò)同一質(zhì)粒，或通過(guò)不同的質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)共表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，通過(guò)將蛋白質(zhì)與宿主酶的催化結(jié)構(gòu)域連接，并組合將蛋白質(zhì) 與宿主信號(hào)序列有效的連接，以及一種或多種分子伴侶、陪伴蛋白和/或折疊酶的外源共 表達(dá)，來(lái)增加所需蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或分泌，所述分子伴侶、陪伴蛋白和/或折疊酶優(yōu)選的 來(lái)自與蛋白質(zhì)相同的生物體?？梢哉J(rèn)為，本文提供的多個(gè)實(shí)施方案中論及的元件可以以任何合適的組合使用。 因此，并非意在將實(shí)施方案限于本文提供的特定描述，因?yàn)楦鲗?shí)施方案的方面可以彼此組 合使用。信號(hào)肽本發(fā)明中使用的特定信號(hào)肽不是關(guān)鍵的，只要信號(hào)肽在宿主中是有效的。當(dāng)與蛋 白質(zhì)有效連接的信號(hào)肽增加了宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分泌時(shí)，就提供了 “有效的信號(hào)肽”。在 一些實(shí)施方案中，信號(hào)肽是從強(qiáng)分泌的蛋白質(zhì)中獲得的，和/或是強(qiáng)信號(hào)肽?！皬?qiáng)信號(hào)肽”導(dǎo) 致天然蛋白質(zhì)被其天然宿主強(qiáng)分泌。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)肽獲得自與宿主細(xì)胞相同門 的生物體。實(shí)際上，在一些實(shí)施方案中，這是有利的。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)肽和宿主細(xì)胞 來(lái)自相同的屬，而在其它一些實(shí)施方案中，信號(hào)肽和宿主細(xì)胞來(lái)自(相同的)物種。例如，在 一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是子囊菌宿主細(xì)胞，信號(hào)肽獲得自子囊菌。在一些實(shí)施方案中， 宿主細(xì)胞是木霉屬，信號(hào)肽來(lái)自木霉屬。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是里氏木霉，信號(hào)肽 來(lái)自里氏木霉。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)肽是強(qiáng)信號(hào)肽。在一些可選的實(shí)施方案中，宿主細(xì) 胞是擔(dān)子菌宿主細(xì)胞，信號(hào)肽獲得自擔(dān)子菌?？捎糜诒景l(fā)明的信號(hào)肽的一些實(shí)例包括但不 限于CBHl和NSP24信號(hào)肽。信號(hào)肽可以在例如子囊菌門的門的其它成員中發(fā)揮作用，但在一些實(shí)施方案中，當(dāng)信號(hào)肽在獲得它的屬中使用時(shí)，具有最優(yōu)的用途(即，提供強(qiáng)分泌)。如本文中使用的，“強(qiáng)分泌蛋白”是形成從細(xì)胞中分泌顯著量的總蛋白的任何蛋白 質(zhì)。從細(xì)胞中分泌的總蛋白也稱為“胞外蛋白”。例如，強(qiáng)分泌的蛋白質(zhì)包括至少約2%的 胞外蛋白，至少約3 %，至少約4 %，至少約5 %，至少約6 %，至少約7 %，至少約8 %，至少約 9%，至少約10%，至少約15%，至少約20%，至少約30%，至少約40%，至少約50%，至少 約60 %，至少約70 %，至少約75 %，至少約80 %，至少約85 %，至少約90 %，至少約95 %，或 至少約99%。在一些實(shí)施方案中，強(qiáng)分泌蛋白包括在培養(yǎng)上清液中至少約5%的胞外蛋白 質(zhì)。CBHI信號(hào)肽、接頭和催化結(jié)構(gòu)域里氏木霉產(chǎn)生一些纖維素酶，包括纖維 二糖水解酶I (CBHI)，其折疊成由延伸的 接頭區(qū)分隔的兩個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域(即，催化和結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。外源多肽已經(jīng)作為具有CBHI 的催化結(jié)構(gòu)域和接頭區(qū)的融合體在里氏木霉中分泌(參見(jiàn)例如，Nyyss0nen等人，Bio/ Technol. 11 :591_595 [1993])。長(zhǎng)枝木霉(T. Iongibrachiatem)也生產(chǎn) CBHI，可用于融合體 以及分離信號(hào)肽和/或接頭。接頭可用于連接酶的催化結(jié)構(gòu)域和所需多肽。任何合適的接 頭都可用于本發(fā)明，只要它在獨(dú)立折疊的結(jié)構(gòu)域之間形成延伸的、半剛性的間隔區(qū)。在一些 蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了此類接頭區(qū)域，特別是在水解酶中(例如，細(xì)菌和真菌纖維素酶和半纖維 素酶；參見(jiàn)例如，Libby 等人，ProteinEngineering，Design and Selection (1994)第 7 卷， 1109-1114)。如圖9所示，對(duì)于CBHI (SEQ ID NO 10)，信號(hào)序列始于堿基對(duì)210，止于堿基對(duì) 260 (SEQ ID NO 11)。催化核心始于堿基對(duì)261至堿基對(duì)1698 (SEQ ID N0:12)，包括內(nèi)含子 1 (從堿基對(duì)671至737)和內(nèi)含子2 (從堿基對(duì)1435至1497)。接頭序列始于堿基對(duì)1699， 止于堿基對(duì)1770(SEQID N0:13)。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域始于堿基對(duì)1771至堿基對(duì)1878?？?以通過(guò)expasy組織網(wǎng)址發(fā)現(xiàn)關(guān)于CBHI的序列和結(jié)構(gòu)域信息，命名為imiprot/P62694。已 經(jīng)在多個(gè)其他木霉屬物種和其他絲狀真菌中鑒別了 CBHI同源物，合適時(shí)可用于本發(fā)明。NSP24信號(hào)肽和多核苷酸NSP24基因是從里氏木霉中分離并測(cè)序的(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)7，429，476，其 通過(guò)引用全文整合到本文中)。該基因測(cè)序鑒別了編碼407個(gè)氨基酸可讀框(SEQ ID NO 8)的序列，如圖8所示。鑒別SEQ ID NO 8的前20個(gè)氨基酸(MQTFGAFLVSFLAASGLAAA ；SEQ ID NO 9)是信號(hào)肽。已經(jīng)在多個(gè)其他木霉屬物種和其他絲狀真菌中鑒別了 NSP24同源物， 合適時(shí)可用于本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，NSP24信號(hào)序列用于子囊菌生物體。在一些實(shí) 施方案中，序列用于木霉屬物種，在一些甚至更特別的實(shí)施方案中，用于里氏木霉。因此，本發(fā)明提供了可用于分泌蛋白質(zhì)的NSP24家族蛋白酶信號(hào)肽。在一些實(shí)施 方案中，NSP24信號(hào)肽命名為“NSP24天冬氨酸蛋白酶信號(hào)肽”。發(fā)明的多核苷酸本發(fā)明提供了多種多核苷酸，包括但不限于編碼所需蛋白質(zhì)、信號(hào)肽、催化結(jié)構(gòu) 域、接頭、分子伴侶、陪伴蛋白和折疊酶的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包括至少 兩種上述分子。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包括至少三種上述分子。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包括至少一個(gè)氨基酸取代， 例如使用L-氨基酸的“保守氨基酸取代”，其中，一個(gè)氨基酸被另一種生物學(xué)相似的氨基酸取代了。保守氨基酸取代是保留了被取代的氨基酸的一般電荷、疏水性/親水性，和/或空 間體積(steric bulk)的取代。保守取代的實(shí)例是下列組之間的取代Gly/Ala、Val/Ile/ Leu、Lys/Arg、Asn/Gln、Glu/Asp、Ser/Cys/Thr，和 Phe/Trp/Tyr。在一些實(shí)施方案中，“衍生 蛋白質(zhì)”可用于本發(fā)明。在一些這類實(shí)施方案中，衍生蛋白質(zhì)與“親本”蛋白質(zhì)序列相比，低 至約1至約10個(gè)氨基酸殘基不同，例如約6至約10個(gè)，少至約5個(gè)，少至約4個(gè)，約3個(gè)， 約2個(gè)，或甚至1個(gè)氨基酸殘基不同。表1提供了本領(lǐng)域認(rèn)知的示例性保守氨基酸取代。在 其他實(shí)施方案中，取代涉及一個(gè)或多個(gè)非保守氨基酸取代、缺失或插入，其不消除信號(hào)肽活 性。 表1 保守氨基酸替換 在一些實(shí)施方案中，發(fā)明的多核苷酸是天然序列。在一些實(shí)施方案中，天然序列分 離自自然界，而在其它實(shí)施方案中，它們是通過(guò)重組或合成方式生產(chǎn)的。術(shù)語(yǔ)“天然序列”特 別涵蓋了天然存在的截短的或分泌的形態(tài)(例如，生物活性片段)，以及天然序列的天然存 在的變體形態(tài)。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，特定氨基酸可以使用一個(gè)以上的密碼子來(lái)編碼。因此，在 一些實(shí)施方案中，不同的DNA序列用于編碼任意多肽，例如信號(hào)肽、蛋白質(zhì)、催化結(jié)構(gòu)域和/或分子伴侶。實(shí)際上，本發(fā)明意在涵蓋編碼相同多肽的不同多核苷酸序列。當(dāng)在合適的溫度和溶液離子強(qiáng)度條件下，單鏈形態(tài)的核酸可以與其它核酸退火 時(shí)，則核酸與另一核酸序列是可雜交的。在低、中、高和非常高嚴(yán)格條件下用于雜交的雜交 和洗滌條件是本領(lǐng)域熟知的。通常，雜交涉及核苷酸探針和同源DNA序列，其通過(guò)互補(bǔ)多核 苷酸的廣泛的堿基配對(duì)，形成穩(wěn)定的雙鏈雜交體。在一些實(shí)施方案中，在2X氯化鈉/檸檬酸 鈉(SSC)，0· 5% SDS中，在約60°C (中等嚴(yán)格)、65°C (中等/高嚴(yán)格)、70°C (高嚴(yán)格)和 約75°C (非常高嚴(yán)格)下，洗滌具有探針和同源序列的濾膜(參見(jiàn)例如，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons，New York, 1989,6. 3. 1-6. 3. 6，通過(guò)引用整合到 本文中)。本發(fā)明涵蓋了等位變體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體，由這樣的DNA編碼的蛋白質(zhì)， 所述DNA在高或低嚴(yán)格條件下與編碼漆酶、NSP24信號(hào)序列、CBHI信號(hào)序列、催化結(jié)構(gòu)域、分 子伴侶、陪伴蛋白和折疊酶的核酸雜交。本發(fā)明的核酸和多肽包括由于公開序列的測(cè)序錯(cuò) 誤而與本文公開的序列不同的序列。"DNA序列的同源性”是通過(guò)兩條DNA序列之間相同的程度來(lái)確定的。通常使用計(jì) 算機(jī)程序來(lái)確定多肽序列和/或核苷酸序列的同源性或“百分比同一性”。實(shí)施序列比對(duì) 和確定序列同一性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，不需要過(guò)多實(shí)驗(yàn)就可以實(shí)施，并且可 以確定的獲得同一性值的計(jì)算。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得且已知多種算法，用于比對(duì)序列和 確定序列同一性。使用這些算法的計(jì)算機(jī)程序也是本領(lǐng)域可獲得且已知的，包括但不限于 ALIGN 或 Megalign (DNASTAR)軟件，或 WU-BLAST-2、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA, TFASTA 禾口 CLUSTAL。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知如何確定用于測(cè)量比對(duì)的合適參數(shù)，包括在比較的序列全長(zhǎng) 獲得最大比對(duì)所需的算法?？梢岳贸绦虼_定的缺省參數(shù)來(lái)確定序列同一性。在一些實(shí) 施方案中，通過(guò)MSPRCH程序(Oxford Molecular)執(zhí)行的Smith-Waterman同源性檢索算法 (Smith Waterman, Meth. Mol. Biol. ,70 173-187 [1997))來(lái)確定序列同一性，所述 MSPRCH 程序使用具有下列檢索參數(shù)的仿射空位檢索空位開發(fā)罰分為12，空位延伸罰分為1?？梢?使用 Genetics Computer Group, Inc. (Madison，WI)的 GCG 序列分析軟件包的 GAP 程序進(jìn) 行成對(duì)的氨基酸比較，運(yùn)用bloSum62氨基酸取代矩陣，具有空位權(quán)重12和長(zhǎng)度權(quán)重2。關(guān) 于兩條氨基酸序列的最優(yōu)比對(duì)，變體氨基酸序列的連續(xù)區(qū)段相對(duì)于參照氨基酸序列，可以 具有額外的氨基酸殘基或缺失的氨基酸殘基。用于與參照氨基酸序列比較的連續(xù)區(qū)段可以 包括至少約20個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，可以是約30個(gè)、約40個(gè)、約50個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘 基。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)設(shè)定空位罰分對(duì)與在衍生氨基酸序列中包括空位相關(guān)的增加 的序列同一性進(jìn)行校正。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋的蛋白質(zhì)、信號(hào)肽、酶催化結(jié)構(gòu)域、分子伴侶、 陪伴蛋白和/或折疊酶是源自細(xì)菌或真菌，例如絲狀真菌。示例性絲狀真菌包括曲霉 屬物種(Aspergillus spp.)和木霉屬物種(Trichodermaspp.)。一種示例性的木霉屬 物種是里氏木霉。然而，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的信號(hào)肽和/或編碼信號(hào)肽的 DNA是源自真菌的另一屬或物種，包括但不限于犁頭霉屬物種(Absidia spp)；支頂孢 屬物禾中(Acremoniumspp)；蘑燕屬物禾中(Agaricus spp) ； Anaeromyces spp;曲霉屬物禾中 (Aspergillus spp)，包括但不限于棘孢曲霉(A. aculeatus)、泡盛曲霉(A. awamori)、黃
(A. flavus)(A. foetidus) > A. fumaricus>(A. fumigatus)、豐勾H ffi (A. nidulans)、黑曲霄(A. niger)、米曲霄(A. oryzae)、土曲霄(A. terreus)禾口雜色曲霄 (A. versicolor) ；Aeurobasidium spp ；下皮黑孑L屬物禾中(Cerrena spp) ；Cephalosporum spp ；頭孢屬物種(Cephalosporium)；毛殼屬物種(Chaetomium spp)；鬼傘屬物種 (Coprinus spp) ；Dactyllum spp ；指孢霉屬物種(Dactylium spp)；鐮孢屬物種(Fusarium spp)，包括 F. conglomerans、多隔鍵刀菌(F. decemcellulare)、爪卩圭鍵抱(F. javanicum)、 亞麻鐮孢(F. Iini)、尖鐮孢(F. oxysporum)和腐皮鐮孢(F. solani)；粘帚霉屬物種 (Gliocladiumspp)；腐質(zhì)霉屬物種(Humicola spp)，包括特異腐質(zhì)霉(H. insolens)和 H. lanuginosa ；毛霉屬物種(Mucor spp)；脈孢菌屬物種(Neurosporaspp)，包括粗糙脈孢 菌(N. crassa)禾口好食脈抱霉(N. sitophila) ；Neocallimastix spp ；Orpinomyces spp ；青 β屬物禾中(Penicillium spp) ；Phanerochaete ；身寸脈菌屬物禾中(Phlebia spp) ；Piromyces spp ；根霉屬物種(Rhizopus spp)；裂褶菌屬物種(Schizophyllum spp)；葡萄穗霉屬物種 (Stachybotrys spp)；栓菌屬物種(Trametes spp)；木霉屬物種(Trichoderma spp),包 括里氏木霉(T.reesei)、(長(zhǎng)枝)里氏木霉(T. reesei (Iongibrachiatum))和綠色木霉 (T. viride)；禾口接霄屬物種(Zygorhynchus spp)。
催化結(jié)構(gòu)域融合體將所需蛋白質(zhì)與酶融合通常能增加所需蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或分泌。通常，在構(gòu)建 體中，酶序列位于所需蛋白質(zhì)序列的上游。例如，酶是從葡糖淀粉酶或從CBHl酶中獲得的。 在一個(gè)實(shí)施方案中，酶序列是全長(zhǎng)的酶序列，包括催化結(jié)構(gòu)域、接頭和結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，酶序列包括催化結(jié)構(gòu)域序列，其通過(guò)接頭或部分接頭與所需蛋白質(zhì)序列連 接。在一些實(shí)施方案中，酶是在其天然宿主中高表達(dá)和/或分泌的宿主蛋白質(zhì)。例如，當(dāng)宿 主細(xì)胞是木霉屬宿主細(xì)胞時(shí)，酶是來(lái)自木霉屬蛋白質(zhì)。然而，可以理解，多種絲狀真菌蛋白 可用于與蛋白質(zhì)融合，并可成功用于其它的絲狀真菌宿主。分子伴侶、陪伴蛋白和折疊酶可用于本發(fā)明包括的方法和多核苷酸中的特定分子伴侶、陪伴蛋白和折疊酶不是 關(guān)鍵的。此外，當(dāng)本文中描述分子伴侶、陪伴蛋白和折疊酶的用途時(shí)，它們?cè)诜椒ㄖ惺强苫?換使用的。例如，當(dāng)描述方法使用分子伴侶時(shí)，應(yīng)理解為折疊酶和/或陪伴蛋白也可以取代 所述分子伴侶或與其累加的使用。適合本發(fā)明的分子伴侶、陪伴蛋白和/或折疊酶是在宿 主細(xì)胞中有活性的，并且發(fā)揮了增加所需蛋白質(zhì)表達(dá)的作用的那些。在一些實(shí)施方案中，分子伴侶、陪伴蛋白和/或折疊酶來(lái)自與蛋白質(zhì)相同門的生 物體，也可以來(lái)自相同的屬，還可以來(lái)自相同的屬和物種。在一些實(shí)施方案中，分子伴侶、陪 伴蛋白和/或折疊酶來(lái)自擔(dān)子菌，蛋白質(zhì)是擔(dān)子菌蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，分子伴侶、 陪伴蛋白和/或折疊酶是組合使用的。在一些實(shí)施方案中，可以使用具有與全長(zhǎng)分子伴侶、 陪伴蛋白和/或折疊酶基本相同功能的分子伴侶、陪伴蛋白和/或折疊酶的片段。示例性的 分子伴侶、陪伴蛋白和/或折疊酶包括在美國(guó)專利申請(qǐng)60/919，332和W02008/115596中公 開的，其通過(guò)引用全文整合到本文中。示例性的分子伴侶、陪伴蛋白和/或折疊酶包括但不 限于BIP1、CLXl、EROl、LHSl、PRP3、PRP4、PRPl、TIGl、PDI1、PPI1、PPI2、SCJl、ERV2、EDEM 和 SILl。表2提供了多種可用于本發(fā)明的分子伴侶、陪伴蛋白和/或折疊酶的序列。表2:分泌增強(qiáng)蛋白質(zhì)的示例性核酸和多肽序列 分子生物學(xué)一啟動(dòng)子和表達(dá)載體本發(fā)明利用了重組遺傳性領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在一些實(shí) 施方案中，本發(fā)明提供了包括基因啟動(dòng)子序列(例如，來(lái)自絲狀真菌)的異源基因，其通常 在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(例如，里氏木霉細(xì)胞)用于復(fù)制和/或表達(dá)前，克隆到中間載體中。這類 中間載體通常是原核載體(例如，質(zhì)?；虼┧筝d體)。通常，以任何合適的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)所需蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)宿主非 天然的啟動(dòng)子與編碼所需蛋白質(zhì)的多核苷酸有效的連接，所述蛋白質(zhì)對(duì)宿主是天然或非天 然的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)宿主天然的啟動(dòng)子與編碼所需蛋白質(zhì)的多核苷酸有效的連 接，所述蛋白質(zhì)對(duì)宿主是天然或非天然的。在一些實(shí)施方案中，以異源啟動(dòng)子表達(dá)所需蛋白 質(zhì)，所述異源啟動(dòng)子與所需蛋白質(zhì)基因不是天然相關(guān)聯(lián)的。而在其他一些實(shí)施方案中，以組 成型或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子表達(dá)所需蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，在具有纖維素酶啟動(dòng)子(例如， cbhl啟動(dòng)子)的木霉屬表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所需蛋白質(zhì)。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指發(fā)揮指導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄的功能的核酸序列。啟 動(dòng)子可以包括靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的必需核酸序列，例如，在II型聚合酶啟動(dòng)子的情況下的TATA元件。啟動(dòng)子以及其它的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸序列，統(tǒng)稱為“調(diào)控序列”，控制基 因的表達(dá)。通常，調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序 列、翻譯起始和終止序列，以及增強(qiáng)子或激活子序列。調(diào)控序列通常適合宿主并被其識(shí)別， 所述宿主中表達(dá)下游基因。在一些實(shí)施方案中，使用的啟動(dòng)子來(lái)自與宿主細(xì)胞相同的門，在 其他實(shí)施方案中，啟動(dòng)子來(lái)自與宿主細(xì)胞相同的屬，在一些實(shí)施方案中，來(lái)自與宿主細(xì)胞相 同的屬和種?！敖M成型啟動(dòng)子”是在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子?！翱烧T導(dǎo)的”或 “可 抑制的啟動(dòng)子”是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下有活性的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，由于環(huán)境 因素的改變，啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的或可抑制的，如本領(lǐng)域已知的，所述因素包括但不限于碳、 氮或其他營(yíng)養(yǎng)的可利用性、溫度、PH、滲透性、重金屬的存在、抑制劑濃度、壓力，或前述的組 合。在其他一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是可以被代謝因素誘導(dǎo)或抑制的，如本領(lǐng)域已知的，例 如一些碳源的水平、一些能量源的水平、一些分解代謝產(chǎn)物的水平，或前述的組合。合適的啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括cbhl、cbh2、egll、egl2、egl3、egl4、egl5、xynl 和xyn2，產(chǎn)黃青霉(P. chrysogenum)的可抑制的酸性磷酸酶基因(phoA)啟動(dòng)子(參見(jiàn)， Graessle 等人，Appl. Environ. Microbiol. ,63 :753_756 [1997])，葡萄糖抑制性 PCKl 啟動(dòng) 子(參見(jiàn)，Leuker等人，Gene 192 :235_240 [1997])，麥芽糖誘導(dǎo)性、葡萄糖抑制性MRPl啟 動(dòng)子(參見(jiàn)，Munro 等人，Mol. Microbiol.，391414-1426 [2001])，甲硫氨酸抑制性 MET3 啟 動(dòng)子(參見(jiàn)，Liu 等人，Eukary. Cell 5 :638_649[2006])，pKi 啟動(dòng)子和 cpcl 啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，報(bào)告基因構(gòu)建體的啟動(dòng)子是溫度敏感型啟動(dòng)子。在 一些實(shí)施方案中，升高的溫度抑制溫度敏感型啟動(dòng)子的活性。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是 分解代謝產(chǎn)物抑制性啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，滲透性的改變抑制啟動(dòng)子。在一些實(shí)施 方案中，啟動(dòng)子可以被培養(yǎng)基中存在的多糖、二糖或單糖水平誘導(dǎo)或抑制。可用于本發(fā)明的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例是里氏木霉的cbhl啟動(dòng)子，其核苷酸序列 以登錄號(hào)D86235儲(chǔ)存在GenBank中。其它示例性啟動(dòng)子包括在編碼纖維素酶的基因調(diào)控 中涉及的啟動(dòng)子，包括但不限于cbh2、egll、egl2、egl3、egl5、xynl和xyn2。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，為了獲得克隆基因的高水平表達(dá)，異源基因有利的 位于與天然存在的基因中距啟動(dòng)子大概相同距離的位置。然而，如本領(lǐng)域已知的，在不喪失 啟動(dòng)子功能的條件下，該距離可以進(jìn)行適應(yīng)的一些改變。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)替換、取代、添加或消除一個(gè)或多個(gè)核苷酸所修飾的天然 啟動(dòng)子可用于本發(fā)明，只要所述修飾不改變啟動(dòng)子的功能。實(shí)際上，本發(fā)明意在涵蓋，但并 不限于啟動(dòng)子的此類改變。表達(dá)載體/構(gòu)建體通常含有轉(zhuǎn)錄單位或表達(dá)盒，所述轉(zhuǎn)錄單位或表達(dá)盒含有異源 序列表達(dá)所需的所有額外的元件。因此，典型的表達(dá)盒含有與異源核酸序列有效連接的啟 動(dòng)子，和轉(zhuǎn)錄物有效多聚腺苷酸化所需的信號(hào)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以及翻譯終止。盒內(nèi)的其 它元件可以包括增強(qiáng)子，以及如果使用基因組DNA作為結(jié)構(gòu)基因，可以包括具有功能性剪 接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子、分泌前導(dǎo)肽、前導(dǎo)序列、接頭和切割位點(diǎn)。本發(fā)明的實(shí)踐不受遺傳構(gòu)建體中啟動(dòng)子的選擇限制。如上文指出的，示例性的啟 動(dòng)子是里氏木霉的cbhl、cbh2、egll、egl2、egl3、egl5、xlnl和xln2啟動(dòng)子?？捎糜诒?發(fā)明的其它啟動(dòng)子包括來(lái)自泡盛曲霉和黑曲霉的葡糖淀粉酶基因(glaA)的那些(參見(jiàn)，Nunberg等人，Mo 1. Cell Biol.，4 =2306-2315[1984])和來(lái)自構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶的啟動(dòng)子。 用于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)載體的示例性啟動(dòng)子是AprE啟動(dòng)子；用于大腸桿 菌的示例性啟動(dòng)子是Lac啟動(dòng)子，在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中使用的示例 性啟動(dòng)子是PGK1，在黑曲霉中使用的示例性啟動(dòng)子是glaA，且用于里氏木霉的示例性啟動(dòng) 子是cbhl。然而，本發(fā)明并非意在限于這些特定的細(xì)胞或這些特定的啟動(dòng)子，其它細(xì)胞和啟 動(dòng)子也可以用多個(gè)實(shí)施方案中。在一些實(shí)施方案中，除啟動(dòng)子序列外，表達(dá)盒還含有位于結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終 止區(qū)，以提供有效的終止。在一些實(shí)施方案中，終止區(qū)是從和啟動(dòng)子序列相同的基因中獲得 的，而在其他實(shí)施方案中，其獲得自不同的基因。雖然任何合適的功能性真菌終止子都可用于本發(fā)明，一些示例性的終止子包 括但不限于來(lái)自以下基因的終止子構(gòu)巢曲霉trpC基因(參見(jiàn)，Yelton等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 1470-1474(1984) ;Mullaney 等人，(Molecular Genetics and Genomics [MGG] 199 :37-45 (1985))，泡盛曲霉或黑曲霉的葡糖淀粉酶基因(參見(jiàn)，Nunberg 等人，Mol. Cell Biol.，4 :2306-2315(1984) ；Boel 等人，EMBO J.，3 1581-1585 (1984))，米 曲霉的TAKA淀粉酶基因，米黑毛霉(Mucor miehei)的羧基蛋白酶基因(歐洲專利
發(fā)明者王華明, 鮑鍇 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司