專利名稱：減少了宿主糖含量的乙型肝炎病毒表面蛋白的制作方法
乙型肝炎病毒(HBV)是引起多種人類肝臟疾患的感染性因子。許多感染了HBV的患者都經(jīng)歷疾病的急性期，繼而進入恢復期。但是，部分患者沒能消除所受到的感染，因而成為HBV感染的慢性攜帶者。HBV感染在世界許多地區(qū)呈現(xiàn)出流行性，感染的高發(fā)生率見于產(chǎn)期，由受慢性感染的母親傳染給其新生兒，而新生兒常常又維持其慢性感染。據(jù)估計，世界范圍內(nèi)受HBV感染的人數(shù)已逾3億。在這些攜帶者中，每年有成千上萬的患者死于長期患慢性乙型肝炎所致的并發(fā)癥(肝硬化和/或肝癌)。
與HBV共同感染的乙型肝炎delta病毒能引起通常是致死性的急性暴發(fā)性疾病。delta病毒不能由其自身的遺傳物質編碼作為病毒體包膜的蛋白質;而是被由共同感染的HBV編碼的包膜蛋白所包裹，因此，該病毒與下文述及的HBV蛋白共有一種密切的結構和免疫關系。目前還不清楚其它的感染性因子是否與HBV也具有類似的關系。然而，已經(jīng)清楚，借助于一類與HBV有微弱或部分抗原交叉反應活性的因子，被擴展了血清學反應性范圍或被增強了免疫原效力的蛋白質可用于疾病(或感染)的診斷或預防(或治療)系統(tǒng)中。
乙型肝炎病毒體由二類結構蛋白組成核心蛋白和包膜或表面蛋白。除了作為主要的表面蛋白或病毒體，即Dane顆粒外，包膜蛋白也是澳大利亞抗原，或22nm顆粒的主要成分。這些包膜蛋白是編碼至少389個氨基酸(aa)的大的病毒開放閱讀框架(ORF)的翻譯產(chǎn)物。該ORF分成三個區(qū)，每區(qū)以可在體內(nèi)作為翻譯起點的ATG密碼子起始。這些區(qū)域在基因中以5′-3′方向分別稱作前S1(108aa)、前S2(55aa)和S(226aa)。因此，這些區(qū)域定義了被稱為S或HBsAg(226aa)、前S2+S(281aa)和前S1+前S2+S(389aa)的三種多肽，這三種多肽也分別稱為p24/gp27、p30/gp33/gp36和p39/gp42(以及主要、中等和大蛋白)。
HBV的包膜蛋白是含有碳水化合物側鏈(聚糖)的糖蛋白，該側鏈以N-配糖鍵與被定義的肽識別位點相連接[Heermann et al.，J.Virol.52，396(1984);Stibbe et al.，J.Virol.46，626(1983)]。因此，在自然感染過程中產(chǎn)生的HBV多肽所包含的種類有p24/gp27(S多肽及其糖基化衍生物)、p30/gp33/gp36(僅在前S2區(qū)糖基化的前S2+S多肽和在S及前S2區(qū)糖基化的前S2+S多肽)和p39/gp42(前S1+前S2+S肽及其在前S1區(qū)糖基化的衍生物)?，F(xiàn)行可用的從血漿中獲得的疫苗由只含有S區(qū)(包括p24單體和其糖基化衍生物)的蛋白質組成，而目前成功地制備出的酵母源性疫苗由S多肽(僅含非糖基化p24類多肽)獨自構成。
22nm HBsAg顆粒已從慢性攜帶者血漿中純化出來。由于他們的血漿呈病毒顆粒陽性，這些慢性攜帶者被稱為HB+S。如果感染者已產(chǎn)生了足夠的免疫反應，他們能清除感染，變成HB-S。如果產(chǎn)生了抗HBS的抗體，這些感染者被稱為抗-HBs+。由此說來，抗-HBs+與疾病的恢復和對疾病再感染的免疫力，及對HBV再感染的免疫力相關。因此，可望證實通過HB疫苗刺激或形成的抗-HBS對HBV感染具有保護作用。
上述假設已進行了實驗性檢驗。在人類之外，黑猩猩是少數(shù)幾種對HBV感染完全易感的物種之一，這種感染以可定量的標志物如HB+S和血清中肝酶水平的升高來反映。用三種劑量的純化HBsAg顆粒接種黑猩猩，然后用感染性HBV靜脈內(nèi)注射加強。盡管接種動物模型表現(xiàn)出急性HBV感染征象，但HBsAg接種的動物則在這種感染中完全得到保護。因而，在這一實驗系統(tǒng)中，由p24(或p24和p27)組成的HBsAg顆粒已足以誘導保護性免疫。受到這些觀察結果的鼓舞，數(shù)家制造商已生產(chǎn)出由HBsAg顆粒組成的HB疫苗。
為了擴大可用的HB疫苗的來源，制造商已轉向用重組DNA技術介導病毒包膜蛋白的表達。在微生物系統(tǒng)中，大腸桿菌和啤酒酵母最常用于表達多種由重組得到的蛋白。許多試圖在大腸桿菌中表達有免疫活性的HBsAg顆粒的嘗試都未獲成功。然而，啤酒酵母在表達有免疫活性HBsAg顆粒方面顯示出了很大的多樣性。這些顆粒(僅含有p24)在配制成疫苗時被證明能夠完全防止黑猩猩遭受多種血清型的活HBV的侵襲。而且，在人類臨床試驗中，酵母源性S顆粒與血漿源性HBsAg同樣具有免疫活性和有效地防止疾病或感染[Stevensetal.，JAMA，257∶2612-2616(1987)]。因此，可確立用啤酒酵母作為控制重組HBsAg合成的宿主種屬。此外，在酵母中表達用于人類的治療因子和疫苗對于增加產(chǎn)量非常有益，因為酵母不含內(nèi)毒素，對人無致病原性，能進行工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵，并且沒有因應用連續(xù)性哺乳動物細胞系(許多由病毒轉化的細胞系對小鼠具致腫瘤原性，并且所有細胞系都含有原癌基因)所產(chǎn)生的多種安全性考慮。
啤酒酵母(面包酵母)是能合成糖蛋白的真核細胞。酵母中的糖基化作用已成為許多近期綜述文獻中的話題[主要文獻有Kukuruzinskaetal.，Ann.Rev.Biochem.(1987)56，915-44;Tannenetal.，BBA，(1987)906，81-99]。所說糖基化作用或聚糖向多肽上合適受體氨基酸(aa)的加成作用發(fā)生于特異的絲氨酸(ser)或蘇氨酸(Thr)殘基(O-連接)，或者發(fā)生于特定的天冬酰胺殘基(N-連接)。于Ser或Thr殘基部位進行O-連接加成作用的特異性還未清楚地認識，對特異性的確定是基于不同情況憑經(jīng)驗進行。
進行N-連接糖基化作用的信號序列已清楚地定義為氨基酸序列Asn-X-Thr或Asn-X-Ser(其中的X代表任何氨基酸)。除了合成多種自體天然的糖基化蛋白[這些蛋白被稱為甘露蛋白(mannoproteins)或甘露肽(mannopeptides)]，酵母還能夠糖基化經(jīng)重組技術表達的異種或外源蛋白質(如果異種蛋白含有進行N連接或O連接糖基化作用的合適糖基化信號序列)。
在自然感染過程中產(chǎn)生的前S2+S多肽含有的“核心”(估計大小為3KD)N連接聚糖不超過2個，一個在S區(qū)，另一個在前S2區(qū)氨基酸殘基4的Asn上。在Recombivax HB
或在酵母中合成的重組前S2+S的S區(qū)中的識別位點未被糖基化，但前S2區(qū)中的氨基酸殘基4位點可被酵母識別和糖基化。
前S1區(qū)在氨基酸殘基4上具有一個N連接糖基化作用位點，在氨基酸殘基26上有一個用于血清型adw的潛在的位點。本領域的專業(yè)技術人員很容易意識到前面對于前體S2糖基化作用的討論也適用于前S2區(qū)以及前S1和S區(qū)中的各種不同序列。
酵母合成的重組前S2+S中增加了一個“核心”聚糖，它與病毒感染過程中天然多肽所增加的“核心”聚糖相似。然而，如果用以進行糖基化作用的酵母宿主細胞是“野生型”(即含有天然糖基化作用所需要酶的全部互補成份，實際上對于所有常用的酵母菌株都是這種情況)，即可以與酵母制造其自身結構甘露蛋白一致的方式，用大量額外甘露糖殘基來延伸大量的這種聚糖，當這種聚糖的延伸加成作用發(fā)生于外來基因產(chǎn)物，如前S2+S多肽時，它被稱為超糖基化作用(hyperglycosylation)。本領域技術人員很容易認識到有關酵母的討論也將擴展到可能具有不同糖基化作用方式的其它宿主細胞(例如昆蟲、真菌等)。
進一步還表明，在野生型酵母宿主細胞中表達的HBV表面蛋白22nm顆粒的重組形式在22nm顆粒中獲取了一定量的酵母細胞糖類(至少部分衍生于酵母宿主細胞的結構甘露蛋白和甘露肽)。這種獲取的糖類會引起潛在性問題，包括它可能刺激抗糖基化蛋白上酵母糖類基團的抗體產(chǎn)生，含有所獲酵母糖類的疫苗免疫原將與存在于大多數(shù)哺乳動物中的抗酵母抗體反應，因而減弱了其作為免疫原和疫苗的效力。
借助下述任何方法，可以消除超糖基化作用以及對完整甘露蛋白和甘露肽的獲取，并且使糖基化作用局限于HBV前體S和S多肽以及它們的相應顆粒中。
首先，可在重組體宿主的生長過程中，于生長培養(yǎng)基中加入一種外源因子(例如，衣霉素)以防止或限制N-連接過糖基化作用發(fā)生。第二，可通過化學方法(如無水三氟甲烷-磺酸或無水氟化氫)、或酶學方法(如用N-聚糖酶，Endo-F或Endo-H)或物理方法(例如超聲處理)使重組或天然產(chǎn)生的多肽去糖基化。第三，通過DNA水平的誘變作用使糖基化作用的識別位點發(fā)生改變或缺失，以阻止核心糖基化作用以及過糖基化作用。經(jīng)過如此修飾而改變了糖基化作用識別序列(由在酵母中有活性的合適啟動子控制)的前S+SORF已轉化到酵母宿主細胞中。所得的前S+S多肽不具有糖基化作用。第四，可以鑒別出缺乏糖基化作用所需關鍵性酶類的宿主細胞，這是說明本發(fā)明，但本發(fā)明不僅限于此。已鑒定出了一個這類酵母菌株(mnn9突變株)[Ballou，L.et.al.，(1980)，J.Biol.Chem.255，p5986-5991]，它缺乏延伸(過糖基化作用)N-連接聚糖所需糖基化作用通路中的一種關鍵酶，化學研究表明，該突變株使得甘露蛋白無外層甘露糖殘基鏈而僅含“核心”糖類。[Ballou，C.E.etal.，(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，pp3081-3085;Tsai，P.etal.，(1984)，J.Biol.Chem.，259.pp3805-3811]。編碼S或前S+S多肽的ORF(由在酵母中具備活性的適宜啟動子控制轉錄)已用于轉化酵母mnn9突變株。所得前S+S多肽只具有“核心”糖基化作用而缺乏過糖基化作用。
盡管S多肽在酵母中表達時既不被糖基化也不被過糖基化，但由它們組成的顆粒含有高水平衍生于酵母甘露蛋白的獲取糖類。因此，S多肽及含多肽的前S在不能進行過糖基化作用的酵母細胞中表達將導致所表達22nm顆粒中糖含量的降低。
啤酒酵母在表達有免疫活性的22nm顆粒方面顯示出了很大的多樣性。已證實，當這些顆粒配制到疫苗中時具有完全保護黑猩猩免遭活的HBV侵襲的能力。而且，在人類臨床試驗中酵母源性HBsAg與血漿源性HBsAg一樣已產(chǎn)生免疫效果。因此，可確定用啤酒酵母作為一種宿主以控制合成重組HBsAg。
在多種重組微生物表達系統(tǒng)中，許多不同多肽的合成對宿主細胞表現(xiàn)出有害性。因此，在選擇這些多肽的表達方面有一定的麻煩，使得那些在重組培養(yǎng)物中以遞增方式積累的唯一細胞不能夠表達外源多肽，或表達如此少的外源多肽以致于該培養(yǎng)物成為上述多肽的一種不經(jīng)濟來源。在某些情況下，其毒性作用太強以致當由強的基本啟動子來啟動表達時，新的轉化細胞在選擇性平板上不能增殖和形成克隆。通過應用一種可誘導啟動子指導這類多肽的合成以避免其毒性作用。在啤酒酵母中存在大量可誘導基因。已明確特征化的4種可誘導遺傳系統(tǒng)是半乳糖(GAL)應用基因、醇脫氫酶2(ADH2)基因、α-配對因子基因和pho5基因。
啤酒酵母中有5種編碼負責利用半乳糖作為生長碳源的酶類的基因。GAL1、GAL2、GAL5、GAL7和GLA10分別編碼半乳糖激酶、半乳糖透酶、磷酸葡糖變位酶的主要同工酶、α-D-半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶和尿苷二磷酸-半乳糖-4-表異構酶。在缺乏半乳糖的情況下，很難檢測到這些酶的表達。如果細胞于葡萄糖中生長，然后向培養(yǎng)物中加入半乳糖，這三種酶在RNA轉錄水平被協(xié)同誘生至少1，000倍(GAL5除外，它只誘生了約5倍)。GAL1、GAL2、GAL5、GAL7和GAL10基因已經(jīng)被進行分子克隆和測序。位于各自編碼區(qū)5′端的調節(jié)和啟動子序列已置于Lac2基因編碼區(qū)附近。這些實驗已定義出對于半乳糖誘生必需和足夠的那些啟動子和調節(jié)序列。
啤酒酵母也有3個各自編碼一種醇脫氫酶(ADH)同工酶的基因。三種酶中之一的ADHⅡ使得啤酒酵母在氧化生長過程中能利用乙醇作為碳源。編碼ADHⅡ同工酶的ADH2基因的表達可被葡萄糖進行降解物阻遏，以致于在發(fā)酵生長過程中存在0.1%(w/v)葡萄糖時，根本上不發(fā)生ADH2基因轉錄。在葡萄糖耗盡和存在非抑制性碳源時，ADH2基因的轉錄被誘導100～1000倍。已對該基因進行分子克隆和測序并且對那些轉錄消阻遏所必需和足夠的調節(jié)序列和啟動子序列進行了定義。
α配對因子是啤酒酵母中的一種性信息素，它為MATα和MATa細胞間配對所必需。該十三肽作為早期前信息素(prepopheromone)然后被導入粗面內(nèi)質網(wǎng)，經(jīng)糖基化和蛋白分解處理，最終從細胞中以成熟形式分泌出來。這一生化途徑被認為是外源多肽的表達方式。該α配對因子基因已被進行分子克隆，其帶有早期前引導序列的啟動子已用于表達和分泌不同的多肽。同樣，pho5基因也顯示出可被低濃度磷酸所誘導，這一性質同樣被用于在酵母中對外源蛋白進行生理性調節(jié)表達。
由于外源蛋白穿過了粗面內(nèi)質網(wǎng)和高爾基體，這些外源蛋白可以進行N-鍵和O-鍵糖基化，α配對因子啟動子僅在表型是α的細胞中具有活性。在啤酒酵母中有4個稱為SIR的遺傳位點，它們合成對于抑制其它正常靜止(silent)復制a和α信息所需的蛋白。至少有一個這些遺傳位點的基因產(chǎn)物中具有干擾這種抑制過程的溫敏性(ts)損害。在該突變體中，于35℃生長可以取消這種抑制作用，產(chǎn)生a/α表型細胞，在這種細胞中α配對因子啟動子是無活性的。當生長溫度下降為23℃時，細胞表型恢復為α，使得其啟動子變成有活性的。已經(jīng)證明了帶有tsSIR損害的菌株在調節(jié)多種外源多肽表達中的應用。
本發(fā)明的目的是提供形成含基本上減低了所獲取糖含量顆粒的HBV表面蛋白。本發(fā)明的另外一個目的是提供一種在酵母宿主中生產(chǎn)形成顆粒且含有基本減低了所獲取糖含量的HBV表面蛋白的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種抗HBV的疫苗，它包括含基本減低了所獲取糖含量的HBV表面蛋白顆粒，可對由HBV或其它血清學與HBV相關的因子引起的疾病和/或感染進行主動和被動性預防治療。本發(fā)明的目的還在于提供了一種大規(guī)模生長重組體宿主細胞和純化重組HBV表面蛋白的條件。本發(fā)明的上述目的和其它目的將從下文所述中認識到。
HBV表面蛋白已在使蛋白質糖基化能力方面存在遺傳性缺陷的重組體酵母宿主中高產(chǎn)表達，HBV表面蛋白在酵母細胞中表達導致了特征性顆粒的形成。這些顆粒在酵母細胞中形成時于顆粒內(nèi)獲取了酵母細胞的物質成分。應用“野生型”酵母宿主細胞，HBsAg顆粒內(nèi)可獲取大量的酵母細胞糖分。為了防止由含大量糖分的顆粒組成的HBV疫苗產(chǎn)生，從在糖基化蛋白能力有遺傳缺陷的重組體酵母宿主中生產(chǎn)并純化HBV表面蛋白。通過上述宿主生產(chǎn)的HBV表面蛋白形成的顆粒所含的糖分比野生型酵母細胞中生產(chǎn)的顆粒所含的糖分有實質性的減少。這些HBV表面蛋白作為疫苗可用于HBV相關性感染的治療和/或預防，也可作為抗原用于免疫學診斷，而且減少了與自然產(chǎn)生的抗酵母抗體的反應。


圖1為質粒pC1/1pGAL10HBsAg-tADH-1的示意圖，該質粒含有控制HBsAgORF進行轉錄的pGAL10啟動子，隨后含有tADH1終止子以及可選擇性標記物LEU2+。
本發(fā)明涉及一種制備HBV表面蛋白顆粒的方法，所說的顆粒所含有的獲取糖分含量被大幅降低，并可用作抗HBV的疫苗。
Dane顆粒(血清型adw)被作為用于分離病毒ORFS的HBV核酸來源。本領域的技術人員很容易認識到，本發(fā)明將延伸到對來自HBV毒株或帶有源于病毒遺傳多樣性的其它血清學反應性的相關病毒的核酸的應用。為了從天然存在于HB病毒體中的帶缺口和縫隙的核酸形式中生成HBV基因組的共價閉環(huán)雙鏈DNA，而應用了內(nèi)源性多聚酶反應。分離DNA，再用EcoRⅠ完全消化，然后克隆到pBR322的EcoRⅠ位點，因此獲得pHBV/ADW-1。篩選含有于前S區(qū)EcoRI位點呈環(huán)型置換形式的HBV基因組的重組質粒。通過純化經(jīng)EcoRI和AccI消化pHBV/ADW-1所得的0.8kbp片段，首先構建編碼前S2區(qū)的55個氨基酸和S區(qū)的226個氨基酸的完整ORF;該片段編碼的前S2+S多肽僅缺乏起始密碼子、氨基端的3個氨基酸、羧基端的3個氨基酸和轉錄終止密碼子。
合成寡核苷酸，并連接到上述片段上，使之變?yōu)楹幸粋€10bp來自酵母的未翻譯的5′側翼序列的HindⅢ片段，并挑選完整的前S2+S ORF，以致于其終止密碼子被直接連接到ADH1轉錄終止子的天然HindⅢ位點上，這樣便產(chǎn)生了無任何額外插入堿基的純天然性酵母源性連接。本領域的技術人員很容易認識到為了表達HBV表面蛋白和相關蛋白，可以用任何適宜的酵母活性轉錄終止子取代ADH1。
選擇用于構建，ACAAAACAAA(SEQIDNO∶1)的5′側翼序列，以與用于酵母基因GAP63(GAP)[Holland，J.Biol.Chem.，225，2596(1980)未翻譯引導鏈(NTL)的序列相對應，它也是一種與GAP基因族相一致的序列。構建方式是在無任何額外堿基插入的情況下將NTL直接連接到前S2+S ORF的起始密碼子上。因此，本領域專業(yè)人員很容易認識到，為了表達HBV表面蛋白，對NTL序列的選擇將延伸到能產(chǎn)生合適表達水平的其它序列。
DNA序列分析揭示了2個堿基的取代，使得與由pHBpre SGAP347/19T的DNA編碼的前S2+S序列的氨基酸有所不同[Valenzuela et al.，Biotechnology，3(4)，317-320(1985)]。為了評價兩種構件中的相同多肽，通過位點誘變[Zoller et al.，Nucleic Acids Research 10∶6487-6500(1982)]來改變下列核苷酸替換HBV前S2+S的846bp ORF的堿基64位T代替C(編碼苯丙氨酸而不是亮氨酸)和堿基352位C代替A(編碼組氨酸而不是谷氨酰胺)。然后檢驗所編碼的適用于最佳構件的氨基酸序列。本領域技術人員很容易認識到本發(fā)明并不僅限于上述序列，而是將延伸到編碼具有HBV相關抗原性多肽的任何DNA序列。
用EcoRⅠ和StyⅠ消化后，將含有pUCI9和HBsAg編碼區(qū)的3.3k bp DNA大片段從前S2編碼DNA片段中分離開來，并用制備性瓊脂糖凝膠電泳進行純化。然后將一合成的DNA寡核苷酸與pUC19-HBsAg片段相連。該合成的DNA寡核苷酸含有5′ EcoRⅠ和3′StyⅠ粘末端以及緊隨5′EcoRI位點的HindⅢ位點。此外，合成的DNA寡核苷酸含有HBsAg ATG密碼子加上其9個上游核苷酸和包括StyⅠ位點的21個下游核苷酸。
該寡核苷酸重建了完整的HBsAg編碼區(qū)，并且，通過HindⅢ消化它可從pUC19載體中完整地取出。
上述連結有合成DNA寡核苷酸的pUC19-HBsAgDNA片段被用來轉化大腸桿菌。篩選那些具有完全重建的HBsAg編碼區(qū)的重組質粒。從重組質粒中分離完整的HBsAg開放閱讀架(ORF)，經(jīng)過用HindⅢ消化，繼而用制備性瓊脂糖凝膠電泳來分離和純化0.7kbp的HBsAgDNA，以備用來克隆到一個GAL10啟動子表達載體中。
表達盒(pGAL10-tADH1)啟動被插入到半乳糖誘導性GAL10啟動子下游唯一的HindⅢ位點上的外源基因的表達。上述(帶有HindⅢ末端)的HBsAgORF被連接到載體的HindⅢ位點上。將所說表達盒插入到大腸桿菌穿梭載體pC1/1(Beggs，同前述)的SphⅠ位點之間，再將該載體導入啤酒酵母CF52或CF54菌株中，并篩選被轉化的克隆。
在誘變之后，用上述編碼S或前S+S的片段構建一個如前文所述[Kniskern et al.，Gene，46∶135-141，(1986)]的表達盒，它的組成是(a)大小約為1.1kbp的GAP491啟動子，(b)10bp酵母源性側翼序列;(c)編碼前S1+前S2+S的1230bp病毒ORF或編碼前S2+S的846bp病毒性ORF或編碼S的681bp病毒性ORF和(d)大小約0.4kbp的酵母ADH1終止子。
用三種不同的表達載體構建HBsAg表達盒。前述的GAP491啟動子表達盒[Kniskenetal.，1986，Gene46，pp135-141]由約1.1kbp的甘油醛-3磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子和位于pBR322骨架上約350bp的酵母醇脫氫酶(ADH1)終止子組成，在啟動子和終止子之間有一個唯一的HindⅢ位點。實施例2中的HBsAgORF被連接到該唯一的HindⅢ位點上，通過限制性內(nèi)切酶分析和Southern印跡反應來證實它的存在和方向。
另外，在上述構成中，可用(0.5kbp)GAL10啟動子(Schultzetal.，1987，Gene，54，pp113-123)代替1.1kbp的GAP啟動子，或者是用(1.25kbp)ADH2啟動子(Knis-kernetal.，1988，Hepatology8.82-87)代替GAP啟動子(參見圖1)在每一種構成中，將含有特定啟動子、HBsAg ORF和ADH1終止子的表達盒克隆到穿梭載體pC1/1(Beggs，同前文;Rosenberg，et al.，同前文)中，以產(chǎn)生酵母表達載體。然后如下文所述用該表達載體轉化啤酒酵母。這些轉化子構建后冷凍貯存。用于測定和以后的實驗。親本株CF52是這樣獲得的在YEHD完全培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中混合α配對型菌株CZ5/LB347-1C(mnn9-，SUCZ-)和典型菌株2150-2-3(leu2-，adel-)使之配對。為了篩選二倍體，配對的菌株置于含2%蔗糖作為唯一碳源的leu-最低限度培養(yǎng)基中復制，在分離單個克隆以后，二倍體形成孢子，通過標準技術解析子囊。KHY-107菌株作為單個孢子被分離出來，其特征為Cir+，adel+，leu2-和mnn9-(通過Schiff染色技術)。
如Broach所述[Methods in Enzymology，101，Part C，pp307-325，(1983)]，從菌株KHY107(Cir+)獲得KHY107(Cir0)。通過整合一個被破壞的ura 3基因使被修復的菌株成ura3-。使所得的菌株KHY-107ura3△生長于富足的培養(yǎng)基中，以累積自發(fā)突變，并篩選刀豆氨酸抗性突變體。通過互補試驗，突變株CF55顯示出canl-。GAL10pGAL4表達盒被融合到CF55的HIS3基因中(Methods in Enzymology，1990，185.pp297-309)產(chǎn)生終宿主菌株CF52(Mata leu 2-2，112ura 3△ canl his3△∶∶GAL10pGAL4-URA3，cir°)。這些轉化子構建后凍存以備評估和以后的實驗用。
將凍存的重組酵母生長于YEHD培養(yǎng)基中[Cartyetal.，J.IndustrialMicro.，2，117-121，(1987)]。等生長至穩(wěn)定期，收集酵母細胞，制備細胞溶解物，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分辨，用抗體結合HBsAg進行免疫吸印。分析發(fā)現(xiàn)有一多肽的分子量約24KD，它與預計的SORF的翻譯產(chǎn)物的分子量一致。而且重組酵母(而不是親本)的溶解物經(jīng)放免檢測(AusriaR)為S陽性。對部分純化的酵母溶解物進行電鏡檢查顯示出高密度的HBsAg顆粒。
酵母源性啟動子啟始HBsAg和相關基因的轉錄。因此，本領域技術人員容易認識到，任何酵母活性啟動子序列(例如包括但不限于GAL1，GAL10，ADH2，Pho5等)都可以替代GAP491啟動子。本領域技術人員同樣容易認識到應當使用一種合適的檢測系統(tǒng)，例如免疫吸印或RIA或酶聯(lián)免疫測定(EIA)以便檢測HBsAg和相關多肽在該系統(tǒng)中的表達，從而得到獲取最大產(chǎn)量的最佳培養(yǎng)物收集時間。
GAP491啟動子已經(jīng)用于在酵母中表達包括HBsAg在內(nèi)的幾種外源蛋白[Bitteretal.，Gene，32∶263-274，(1984);Wampleretal.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，826830-6834，(1985)]。基于我們以前表達HBcAg所達到的可溶性酵母蛋白的約40%的結果，我們用這一啟動子在合適的酵母宿主細胞中驅動HBsAg和相關蛋白的表達。
本領域的技術人員容易認識到，為表達HBV表面蛋白對適宜酵母株的篩選包含了很廣泛的選擇范圍。適宜的酵母株包括但不限于那些具有諸如蛋白酶缺陷及改變了糖基化作用能力這樣一類遺傳和表型特征的菌株。
為了控制和定義由重組酵母表面的HBV蛋白的糖基化作用，如前所述構建了啤酒酵母株CF52(Mataleu2-2，112ura3△canlhis3△∶∶GAL10pGAL4-ura3，cir°)。
用表達載體pC1/1pGAL10HBSAG-tADH-1轉化CF52(Mataleu2-2，112 ura3△ canl his3△∶∶GAL10pGAL4-ura3，cir°)。在含1M山梨醇的最低限度培養(yǎng)基(leu-)中篩選重組克隆。這些克隆的轉化子于17%的甘油中凍存。以備以后的評估和進一步的實驗。
為了進行糖基化作用野生型對照，也用表達質粒轉化菌株CF54，它是通過已建立的技術從CF52菌株中分離出來的，并且是MNN9+的一種回復變異體(因此它是進行糖基化作用的野生型
，但又與菌株CF52有相同的基因型)。已轉化的克隆分離物于17%甘油中凍存用于以后的評估和進一步的實驗。
將含有表達質粒的轉化酵母的克隆置于leu-選擇性瓊脂培養(yǎng)皿上(含用于mnn9-轉化子的1M山梨醇)，于30℃培養(yǎng)2-3天。將這些酵母轉種到含有復合YEHD(Carty et al.，同前文)培養(yǎng)基(含0.1-1M山梨醇)和用于基于GAL10的質粒的2%乳糖的5-7ml培養(yǎng)物中，所得培養(yǎng)物于30℃通風培養(yǎng)12-18小時。再取上述培養(yǎng)物(至初始A600＝0.1)接種于含1M山梨醇和50ml復合YEHD培養(yǎng)基(下文稱為YEHDS)的燒瓶中，子30℃搖育(350rpm)48-72小時，直到終A600為10-16。10A600單位樣本分散到試管中，于2000xg離心10分鐘收集酵母細胞，所得樣本或直接用于檢測或于-70℃凍存。檢測時，將收集到的細胞團丸重新懸浮于含2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的4ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，再移至1.5ml Eppendorf管中。通過下列步驟破碎酵母細胞1)加入200～300mg洗過的玻璃珠(0.45mm)，于漩渦混合器上攪動15分鐘，2)加入TRITONX-100，使其濃度為0.5%，3)，在漩渦混合器上攪動2分鐘，4)于4℃培養(yǎng)10分鐘。去掉細胞碎片和玻璃珠，用Lowry法檢測上清液中的蛋白質(Lowry et al.，J.Biol Chem.193，265，(1951)]，并使用RIA特異性檢測前S2+S[Hansson et al.，Infect.Immunol.26;125-130，(1979);Machida et al.，Gastroenterology 86∶910-918，(1984)]或S(AUSRIAR)。
將含表達質粒的轉化酵母mnn9-的克隆置于含1M山梨醇的(leu-)選擇性瓊脂培養(yǎng)皿上于30℃培養(yǎng)2-3天。這些酵母被接種到5-7ml復合YEHDS培養(yǎng)基(加入了用于GAL10啟動子質粒的2%半乳糖)中，孵育來自上述培養(yǎng)(初始A600＝0.1)的培養(yǎng)物，于30℃搖育(350rpm)48-72小時，直到最終A600達10-16。10A600單位的三份樣本分散于試管中，于200xg離心10分鐘收集酵母細胞。所得樣本或如上所述直接用于檢測或于-70℃凍存。
對來源于mnn9-表型宿主細胞的上述所有重組子克隆的多肽進行免疫吸印分析，結果都顯示出了有一條分子量約24KD的條帶。
對于重組蛋白而言，定性和定量的糖基化作用方式是宿主細胞的一種功能，并很大程度地依賴于宿主細胞的種類，且在同種細胞中又與細胞系有關。因此，本領域技術人員容易認識到，除了能在糖基化作用途徑中可鑒定出酶突變的啤酒酵母之外，對宿主菌株的選擇將延伸到種和細胞系。本領域技術人員容易認識到對啤酒酵母宿主菌株的選擇將延伸到所有能在糖基化作用途徑中可鑒定出酶突變的菌株。
然后篩選有HBsAgDNA存在和p24HBsAg表達的轉化克隆。細胞在YEHDS培養(yǎng)基(還含有用于GAL10啟動子質粒的半乳糖以在葡萄糖缺失后誘導表達)中生長。制備細胞溶解物，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離，并通過Western印跡反應轉印至硝酸纖維素膜上。根據(jù)p24產(chǎn)物僅存在于被誘導的轉化子中，以及它與p24抗血清的反應性發(fā)現(xiàn)，p24產(chǎn)物對S蛋白具特異性。篩選出這些克隆中的一個作進一步分析。而且，轉化子而不是親本啤酒酵母的溶解物經(jīng)放免測定為HBsAg陽性。
這便使得表達載體在啤酒酵母中使用GAL10啟動子指導HBsAg及相關表面蛋白的表達的應用顯得引人注目。本領域的技術人員容易認識到，可調節(jié)的GAL10啟動子，或者是功能上難以區(qū)分的GAL1、GAL2、GAL7或MEL1啟動子能使重組啤酒酵母培養(yǎng)物的生長在重組蛋白的合成啟動之前就遞增到一種生產(chǎn)規(guī)模量，從而對宿主細胞的負作用減小到最低程度。而且，本領域技術人員容易認識到，一種含有另外其他調節(jié)啟動子的表達載體可用于指導含S和含前S肽的表達，其中的調節(jié)啟動子包括但不限于ADH2和α配對因子，它們可通過其它方式被生理性誘導或抑制。而且，本領域專業(yè)人員容易認識到，強度低于GAPDH的基本啟動子包括但不限于CYC1，能控制含S和前S多肽的表達使得細胞蛋白的百分含量較低，這樣便消除了過度表達的生理學付作用。本領域技術人員容易認識到，應當應用一種合適的測定系統(tǒng)，例如Western印跡反應或放免測定，以便檢測含S和前S多肽在該系統(tǒng)中的表達，從而為獲得最大產(chǎn)量而選擇最佳培養(yǎng)物收集時間。
用一種結合了能識別HBsAg特定的山羊抗體的免疫親和柱從轉化的啤酒酵母中純化S及S相關蛋白。經(jīng)放免測定，洗脫物為HBsAg陽性，在電鏡中洗脫物也具有特定形態(tài)。這種含有HBsAg和前S抗原或僅含HBsAg的特定形態(tài)物質作HBV疫苗和診斷制劑是有效的。
培養(yǎng)和收集被編碼HBV表面蛋白或其變異體的表達載體轉化的酵母細胞。如果需要的話，可以用緩沖溶液，如PBS洗滌細胞，形成通常用于-70℃凍存的細胞糊，再把細胞貯存起來。
HBsAg及相關蛋白的純化通常是這樣開始的將一批新鮮或冷凍細胞糊懸浮于緩沖液，最好是TRIS中，它具有約8.5-約11.0的高pH值范圍，最好是約10.5(緩沖液也可含合適的蛋白酶抑制劑)。然后破碎細胞，最好用機械方法。已發(fā)現(xiàn)溫和的玻璃球破碎法不適于用來進行遞增。因為高壓勻質器的操作快速且有效，所以優(yōu)選它(約10，000-20，000psi，用Gaulin或Stansted勻質器)破碎細胞。
破碎酵母細胞產(chǎn)生粗提取物。然后調節(jié)粗提物的pH值。pH值調至8.0-11.0的范圍，最好是10.5。
此時最好向粗提物中加入一種洗滌劑。洗滌劑的加入將使酵母細胞膜易于與不需要的細胞碎片分開。已表明，前S2+S蛋白以及其它形式的表面蛋白可與酵母細胞膜相結合?？蛇x用許多中性或非離子型洗滌劑，包括但不限于Triton-N系列、Triton-X系列、BRIJ系列、TWEEN系列或EMASOL系列、脫氧膽酸鹽、辛糖吡喃糖苷或NONIDET-Np-40。兩性離子型洗滌劑如CHAPS或CHAPSO也是有用和適宜的制劑。
如果應用洗滌劑的話，優(yōu)選的洗滌劑為濃度約0.5%的TritonX-100。必須強調的是，本發(fā)明的方法并不要求在這一步驟使用洗滌劑，選用洗滌劑是選擇性的。
如果在裂解過程中不存在蛋白酶抑制劑，提取物可經(jīng)加熱處理。熱處理在超過一定溫度范圍和達到一定處理時限時是有效的。所用的有代表性的溫度范圍是45～60℃，優(yōu)選50℃。熱處理時間的典型范圍是20-40分鐘，優(yōu)選30分鐘。在適宜的容器中對提取物進行熱處理，將容器浸入熱水浴中或使用熱交換器。然后將物質冷卻到約10℃，最好將它置入冰水浴中或使用熱交器進行冷卻。本領域技術人員容易認識到，根據(jù)本發(fā)明的方法，進行熱處理和去除碎片的步驟的順序可以顛倒而不會對本過程的結果產(chǎn)生明顯的影響。另外，所有的酵母細胞也可在中性pH的緩沖液中加熱、破碎，并且可如上所述加入洗滌劑。
必須從熱處理粗提物中去除細胞碎片以防在其后的純化步驟中發(fā)生物理阻塞。通過離心、微量過濾或濾過可去除碎片，產(chǎn)生潔凈的提取物。離心和微量過濾是最優(yōu)選的方法。可以在不同離心力在不同時間范圍內(nèi)進行離心。在約3000xg的條件下于4℃離心15分鐘已經(jīng)足夠。在離心前稀釋提取物也將有益于降低粗酵母細胞提取物的粘性。稀釋將不會改變此過程中的任何后續(xù)步驟。
微量過濾所具有的優(yōu)點在于濾過和透析同時進行。幾種類型的微量過濾單位適用于該步驟，例如KROSFLO(MicrogonInc.)或任何種類的中空纖維柱(Amicon或A/GTechnology)。優(yōu)選的微量過濾方法是將提取物通過ProstakDurapore(Millipore)膜，板、和框架微量過濾單位，孔徑約0.1-0.2微米，內(nèi)向壓力約2-7psi，所用緩沖液由大約0.1MTris，pH約10.4，和約0.1%TritonX-100組成。
得自離心的上清液或微量過濾的濾液在進行本過程的下一步驟之前要進行濃縮?？梢酝ㄟ^幾種方法來達到濃縮目的，所說方法包括但不限于透析、過濾、冷凍干燥、超濾和分離過濾。本發(fā)明的優(yōu)選濃縮方法是將凈化的提取物通過一個能截住分子量為105的物質的中空纖維超過濾系統(tǒng)。凈化提取物的體積對于進行微量過濾產(chǎn)物來說減少了約6.5倍，而對于稀釋的離心產(chǎn)品來說減少了約2倍，因而產(chǎn)生了濃縮的滯留物。在濃縮之后，對滯留物進行分離過濾(diafiltration)以進一步去掉較低分子量的污染物。使用一個截住105分子量的中空纖維系統(tǒng)進行分離過濾。(diafiltration)如果加入了TritonX-100，可用幾種常規(guī)方法去除它，這些方法包括但不限于透析、加入某種特定有機溶劑、冷凍、層析分離、與可特異性結合洗滌劑的凝膠或樹脂接觸，例如Extractogel(Pierce)和XAD樹脂(Romicon)。本發(fā)明優(yōu)選的去掉TritonX-100的方法是將含有TritonX-100的熱處理的提取物通過XAD-2或XAD-4樹脂柱(聚苯乙烯二乙烯苯)。熱處理的提取物通過XAD柱于4℃循環(huán)10小時，然后收集于一合適的容器中，例如可密閉的玻璃瓶。
如果細胞是在高pH緩沖液中破碎，熱處理的提取物，或含有蛋白酶抑制劑的提取物的pH值要調節(jié)到約7.0-7.9，優(yōu)選的pH值是7.7。根據(jù)本發(fā)明的方法，在高pH值下對提取物熱處理后，將其pH值調至約7.7將使包膜蛋白極易于吸附到在后續(xù)步驟中用到的大孔硅膠上。在去除TritonX-100步驟之前對熱處理提取物進行pH值調整不會影響本過程的產(chǎn)量。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法本領域技術人員將容易認識到進行pH值調整和TritonX-100去除步驟順序可以顛倒而不會對本過程的結果產(chǎn)生明顯影響。
這樣，HBsAg易于從污染物中分離出來，產(chǎn)生基本純化的HBsAg。去除污染物的最好方法是將HBsAg吸附到大孔硅膠上。本發(fā)明最優(yōu)選的方法是將HBsAg吸附到孔徑大小約1000～1500埃和硅膠顆粒為30～130微米(Amicon)的大孔硅膠上。表面蛋白易于進入硅膠孔內(nèi)而滯留，酵母細胞蛋白污染物則容易被沖洗掉。
大孔硅膠對表面蛋白的吸附可以層析法或以非層析、不連續(xù)方式進行。將調整了pH值的提取物通過柱層析裝置中的大孔硅膠柱床進行層析吸附。典型情況下，將約1升熱處理的提取物以約200ml/小時的流速，用于一個含300ml(干重大約100g)大孔硅膠顆粒的5cm套層柱裝置中。
向大孔硅膠上進行非層析吸附的典型做法是將熱處理的提取物與硅膠于一合適容器，例如一個可密閉的玻璃瓶中混合。優(yōu)選的方法是向玻璃瓶中約1升的熱處理提取物加入300ml大孔硅膠，并經(jīng)連續(xù)混合接觸。盡管不同的時間和溫度都適宜吸附，但優(yōu)選的吸附條件是在約4-8℃持續(xù)1.5小時。
可用非層析法把未被吸附的物質從吸附了表面蛋白的硅膠中沖洗掉，或者如前文所述將硅膠倒入柱裝置中進行層析吸附。分批沖洗是使熱處理的提取物從大孔硅膠中排出，并加入幾體積不會導致被吸附的HBsAg釋放到硅膠表面的緩沖液。優(yōu)選的緩沖液是PBS。排沖硅膠，沖洗步驟重復3-5次。
將PBS以約200ml/小時的流速通過硅膠對吸附有表面蛋白的硅膠進行層析性沖洗直到在280nm處出現(xiàn)恒定性的沖洗干凈顯示(extinction)。
用pH值為約8.5-9.0的緩沖液從沖洗過的大孔硅膠中洗脫HBsAg。用含約0.05M硼酸鹽的緩沖液(pH值約8.7)能對表面蛋白進行很好地吸收。在一個較寬的范圍內(nèi)升高溫度有助于HBsAg的吸收，吸收優(yōu)選的溫度是55℃。
進行非層析解吸是通過將1200ml0.05M硼酸鹽緩沖液(pH8.7)與約700ml沖洗過的吸附了HBsAg的大孔硅膠相混合。吸收持續(xù)約25分鐘。然后收集洗脫液。解吸步驟重復2次，冷卻洗脫液。
將含沖洗過的硅膠的套層柱加熱至55℃進行層析解吸。0.05M硼酸鹽緩沖液(pH8.7)加熱至55℃，然后以500ml/小時的流速應用到柱上。收集并冷卻洗脫液。洗脫液的體積通常與應用到大孔硅膠中的熱處理的提取物的體積大致相等。
通常需要對洗脫的HBsAg進行濃縮。優(yōu)選的濃縮方法是應用一種0.05M硼酸鹽緩沖液(pH8.7)將洗脫液通過截住105分子量的中空纖維雙向過濾系統(tǒng)。被洗脫的表面蛋白的體積與應用于該系統(tǒng)的體積相比減少了16倍。如果需要的話，可對雙向過濾的滯留物用微量過濾法除菌。
用Dubois等人的方法(Dubois，M.etal.，Anal.Chem.，28，p350，1956)確定HBsAg中的糖含量。該方法總的原理是單糖、寡糖、多糖及其衍生物，包括不含或可能不含還原基團的甲基醚，在經(jīng)酚和濃硫酸處理后生成桔黃色。在恒定的酚濃度下產(chǎn)生的顏色深淺與存在的糖量正比例。
為了確定1份HBV表面蛋白樣本中的糖含量，將含10-70μg蛋白的1ml溶液加到檢測管中。制備一系列標準糖樣和空白樣本。向每一試管中加入1ml 0.5%的苯酚溶液，混勻，再分別加入5ml 96%的硫酸溶液，混勻。試管于室溫下靜置10分鐘，混勻，再于25-30℃放置20分鐘。用分光光度計分析樣本(A490為己糖及甲基化己糖，A480為戊糖、戊糖酸及其甲基化衍生物)，與標準糖管進行比色確定HBsAg樣本中的糖含量。
用上述方法分析在“野生型”重組酵母細胞(CF54)中產(chǎn)生的HBsAg和在CF52重組酵母細胞中產(chǎn)生的HBsAg兩者中的糖含量。基于這些結果，用樣本中的糖的微克數(shù)除以蛋白的微克數(shù)計算出每份樣本中糖和蛋白含量的比值。所計算出的比值表明產(chǎn)生于mnn9-重組酵母細胞的HBsAg中的糖含量始終是產(chǎn)生于重組“野生型”酵母細胞的HBsAg糖含量的1/10。這些結果說明，與由“野生型”酵母細胞產(chǎn)生的HBsAg相比，由mnn9-突變酵母細胞產(chǎn)生的HBsAg所含的糖量有了很大的降低。
下面的實施例是說明本發(fā)明的而不是限制本發(fā)明。在下面實施例中所公開的每一篇文獻都引入本文作為參考文獻。
實施例1HBVDNA克隆到pBR322從人血漿中(攜帶者)分離和純化HBYDane顆粒(adw血清型)，根據(jù)Landers等人的方法(J.Virology23，368-376，(1977)]和Hruska等人的方法[J.Virology，21，(1977)]由Dane顆粒中的內(nèi)源性多聚酶合成雙鏈DNA。在用溶于SDS中的蛋白酶K消化后，繼而用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀分離DNA。用EcoRⅠ消化HBV基因組DNA，產(chǎn)生一個單一的3.2kbp片段，它被克隆到pBR322的EcoRⅠ位點形成pHBV/ADW-1。通過EcoRⅠ消化，向硝酸纖維素膜上Southern印跡轉移以及與[32p]-標記的特異性寡核苷酸探針雜交來證實HBV DNA的存在。
實施例2前S2+S基因克隆到pGAP-tADH-2表達載體用EcoRI和AccI消化(實施例1中的)質粒pHBV/ADW-1，經(jīng)制備性瓊脂糖凝膠電泳純化所得的0.8kbp片段。同樣，用EcoRⅠ和BamHⅠ消化pUC質粒，再經(jīng)制備性瓊脂糖凝膠電泳純化得到線性載體。
為了重建前S2+S ORF的5′部分合成了一對寡核苷酸，它構建的ORF從EcoRⅠ位點上游的ATG通過10bp NTL序列和一個HindⅢ位點直到一個EcoRⅠ位點末端。這些寡核苷酸的序列如下AATTCAAGCTTACAAAACAAAATGCAGTGG(SEQIDN0:4)1102030GTTCGAATGTTTTGTTTTACGTCACCTTAA(SEQIDN0:3)1102030為了重建前S2+S ORF的3′部分合成了第二對寡核苷酸，它構成的ORF從AccⅠ位點通過一個翻譯終止子和一個HindⅢ位點直到BamHⅠ位點末端。這些寡核苷酸的序列如下ATACATTTAAGCTTG(SEQIDN0:4)11015
TGTAAATTTCGAACCTAG(SEQIDN0:5)101018將寡核苷酸對退火，然后連接到經(jīng)EcoRⅠ-BamHⅠ消化的pUC載體上。用制備性瓊脂糖凝膠電泳純化所得的載體(2.8kbp)。將前文所得的0.8kbp EcoRⅠ-AccI片段連接到該載體上。用限制性內(nèi)切酶分析和Southern印跡分析來證實前S2+S ORF的存在及其方向。DNA序列分析[Sanger et al.，1977]表明發(fā)生了2個堿基的替換，使得氨基酸不同于由質粒HBpreSGAP347/19T的DNA編碼的序列。為了評估這兩種組成的相同多肽，用位點誘變改變下列取代，所說的這些取代是堿基64的T替換C(編碼苯丙氨酸而不是亮氨酸)，堿基352的C替換A(編碼組氨酸而不是谷氨酰胺)[zoller and Smith 1982，Nucleic Acid Research，10，p6487-6500]。
構建含HBsAg編碼區(qū)而不含前S2編碼區(qū)的質粒過程如下用EcoRⅠ和StyⅠ限制性內(nèi)切酶消化(前文已述及的)質粒pUC HBpreS2+S。從前S2編碼DNA中分離出含pUC和HBsAg編碼區(qū)的大DNA片段(3.3kbp)，并用制備性瓊脂糖凝膠電泳進行純化。將一合成的DNA寡核苷酸對連接到pUC HBsAg片段上，其中合成的寡核苷酸對的序列如下AATTCAAGCTTACAAAACAAAATGGAGAACATCACATCAG110203040GATTC(SEQIDN0:6)45
GTTCGAATGTTTTGTTTTACCTCTTGTAGTGTAGTCCTAA110203040GGATC(SEQIDN0:7)45這一合成的寡核苷酸對含有5′EcoRⅠ和3′StyⅠ粘末端，并提供了一個緊隨5′EcoRⅠ位點之后的HindⅢ位點。此外，合成的寡核苷酸對含有HBsAgATG密碼子、其上游10bp的非翻譯的引導序列以及包括StyⅠ位點在內(nèi)的21個下游核苷酸。
該寡核苷酸對重建了HBsAg的完整編碼區(qū)，它可通過HindⅢ的消化從以pUC為基礎的載體中完整地提取出來。
用上述連接了DNA寡核苷酸對的pUC-HBsAgDNA載體轉化大腸桿菌。篩選具有完整的重建HBsAg編碼區(qū)的重組質粒。用HindⅢ消化重組質粒從中得到完整的HBsAg開放閱讀架(ORF)，再經(jīng)制備性瓊脂凝膠電泳分離和純化(0.7kbp)HBsAgDNA以用于克隆到一種表達載體中的HBsAgORF。
實施例3HBsAgORF克隆到不同表達載體中三種不同的表達載體用于構建HBsAg表達盒。前述的GAP491啟動子表達盒由約1.1kbp的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子和在pBR322骨架上的約350bp的酵母醇脫氫酶Ⅰ(ADH1)終止子組成，在啟動子和終止子之間有唯一的HindⅢ位點。得自實施例2的HBsAgORF連接到該唯一HindⅢ位點。用限制性內(nèi)切酶分析和Southern印跡分析來證實HBsAgORF的存在及其方向。
另外，在上述構成中，(0.5kbp的)GAL10啟動子(Schultzet，al.，1987，Gene，54，p113-123)可代替1.1kbp的GAP啟動子，或者是用(1.25kbp的)ADH2啟動子(Kniskernetal.，1988，Hepatology，8，82-87)代替GAP啟動子(參見圖1)。
在每一種構成中，將含有特定啟動子、HBsAgORF和ADH1終止子的表達盒克隆到穿梭載體pC1/1(Beggs，同前文;Rosenberg，etal.，同前文)中，產(chǎn)生酵母表達載體，然后如下文所述用該表達載體轉化啤酒酵母。
實施例4酵母啤酒酵母CF52(mnn9-)突變酵母株的構建構建酵母啤酒酵母株KHY107(Cir+，adel+，leu2-和mnn9-)的過程如下在YEHD完全培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中混合α配對型菌株CZ5/LB347-1C(mnn9-，SUCZ-)和典型菌株2150-2-3(leu2-，adel-)使之配對。為了篩選二倍體，配對的菌株置于含2%蔗糖作為唯一碳源的leu-最低限度培養(yǎng)基中復制。在分離單個克隆以后，二倍體形成孢子，通過標準技術解析子囊。KHY-107株以單個孢子被分離出來，確定其特征為Cir+，adel+，leu2-和mnn9-(用Schiff染色技術)。
如Broach所述[Methods in Enzymology，101，Part C，p307-325，(1983)]，KHY107(cir0)是從菌株KHY107(Cir+)衍生而來。通過整合一個被破壞的ura3基因，使被處理的菌株成為ura3-。所得的KHY-107ura3△菌株生長于富足的培養(yǎng)基中以積累自發(fā)突變，篩選刀豆氨酸抗性的突變體。通過互補性試驗證實突變株CF55是Canl-。GAL10pGAL4表達盒被整合到CF55的HIS3基因中(MethodsinEnzymology，1990，185，p297-309)產(chǎn)生終宿主菌CF52(Mataleu2-2，112ura3△canlhis3△∶∶GAL10pGAL4-URA3，Cir°)。
實施例5HBsAg向CF52 mnn9--突變酵母株中的轉化以及種子構建用實施例3所述的質粒pC1/1 pGAL10HBsAg-tADH-1轉化啤酒酵母株CF52。在最低限度的培養(yǎng)基中(leu-，含1M山梨醇)篩選克隆子，所構建的克隆株于17%的甘油中凍存，并根據(jù)下文所述進行評估。
實施例6酵母CF52(mnn9-)中位于GAL10啟動子之后的HBsAg基因的表達和生長將含有實施例5所述表達質粒的酵母克隆置于含1M山梨醇的leu-選擇性瓊脂培養(yǎng)皿中，于30℃培養(yǎng)2-3天。用5-7ml復合YEHDS(YEHD+1M山梨醇)接種這些酵母，所得培養(yǎng)物于30℃通風培養(yǎng)12-18小時。用含50ml YEHDS+2%半乳糖培養(yǎng)基的燒瓶接種上述培養(yǎng)物(起始A600＝0.1)，于30℃搖育(350rpm)72小時直到終A600為10-16。10A600單位的樣本分散于試管中，于2，000xg離心10分鐘收集酵母細胞。所得細胞團丸或直接用于檢測，或貯存于-70℃以后備用。在檢測時，細胞團丸被重新懸浮于含2mM PMSF的0.4ml磷酸鹽緩沖液中。經(jīng)下述步驟破碎酵母細胞1)加入200-300mg被洗過的玻璃珠(0.45mm)，2)于漩渦混合器上攪動15分鐘，3)加入Triton X-100，使其濃度為0.5%(v/v)，4)于漩渦混合器上攪動2分鐘，5)于4℃放置10-15分鐘。于13.000xg離心10分鐘去除細胞碎片和玻璃珠。移出凈化的上清液，用Lowry法[Lowry et al.，J.Biol.Chem.193.265(1951)]進行蛋白分析。用(AUSRIAR)測定法(Abbott)分析HBsAg。有代表性的檢測結果如下所示表1P24水平樣本AUSRIA,ug/mg蛋白細胞破碎(免疫吸附)搖育燒瓶mnn9-突變株(0.55,0.61,0.53)玻璃珠+++野生型(MNN9+)(1.8)玻璃珠+實施例7在發(fā)酵罐中大規(guī)模培養(yǎng)可產(chǎn)生HBsAg的啤酒酵母(mnn9-)將凍存的重組酵母培養(yǎng)物接種到含1M山梨醇的leu-培養(yǎng)皿中。把培養(yǎng)皿倒置于28℃孵育2-3天。將培養(yǎng)皿中的生長物重新懸浮于YEHDS中，然后轉移至含500ml YEHD S和2%半乳糖的2升Erlenmeyer燒瓶中。該燒瓶在一個可控環(huán)境的搖床孵育箱中以350rpm于28℃孵育18-22小時。然后將這些種子培養(yǎng)物接種到生產(chǎn)階段的容器中。
將來自1個或多個燒瓶中的種菌(1-5% V/V)轉移到分別含有10升或200升YEHDS的16升或250升發(fā)酵罐。16升發(fā)酵罐在500rpm、5升/分通氣和28℃條件下運行，250升發(fā)酵罐以160rpm、60升/分通氣和28℃的條件下運行。在用種子培養(yǎng)物接種40-46小時后收集發(fā)酵罐。獲取15.0A660單位的光密度值。收集過程包括用中空纖維過濾裝置濃縮然后用緩沖鹽溶液洗滌細胞。細胞懸浮液用于如下所述的檢測或凍存于-70℃以備進一步的處理和分析。
用玻璃珠(0.45-0.52mm)在150ml Eppendorf管中破碎20%洗滌過的細胞懸浮液(0.6ml)小樣本。加入PMSF(6.5μl的200mM貯存液)作為蛋白酶抑制劑。破碎后從小管中取出等份試樣凍存于-70℃用于免疫吸印分析。加入Triton X-100重小管中的剩余樣本濃度為0.5%，快速混合樣本，再于4℃培育20-40分鐘。通過離心去除細胞碎片，并檢測凈化的細胞提取物中的抗原(AusriaR)和蛋白質(Lowry)。
實施例8用免疫親和層析純化具一定形態(tài)的S蛋白如實施例5所述構建的重組啤酒酵母生長于燒瓶或發(fā)酵罐中。經(jīng)過微量過濾以Amicon DC-10單位收集酵母細胞，將細胞懸浮于30ml緩沖液A中
，在Stansted壓力孔中通過7個通道于7.5-85磅/呎2的壓力破碎細胞。用120ml緩沖液A稀釋破碎細胞的懸液(細胞濕重31mg)，再加入終濃度0.5%(w/v)的Triton X-100，在4℃、10，000xg離心20分鐘以凈化上述懸液。傾析出凈化的液體培養(yǎng)基，與結合了抗HBsAg抗體的Sepharose 4B[McAleer et al.，Nature 307∶178(1984)]一起于4℃溫育19小時，使抗原吸附到樹脂的表面。在溫育之后，將懸浮液升至室溫用以所有的后續(xù)步驟，并在真空中脫氣15分鐘。將脫氣的懸浮液倒入2.5×40cm的柱中。在柱被完全填充之后，用緩沖液A沖洗掉未結合的蛋白質。用溶于緩沖液A中的3M KSCN洗脫抗原。對含抗原的餾份用0.007M Na2HPO4，pH7.2，0.15M NaCl于4℃進行透析，收集透析的餾份形成在20ml餾分中含1.08mg蛋白的透析親和池(Dialyzed Affinity Pool)。用5.6ml 0.006M Na2HPO4，pH7.2，0.15M NaCl稀釋取自透析親和池中的16ml樣本至40mcg/ml。該產(chǎn)物通過Millex-GV0.22μ膜過濾進行除菌。用AusriaR反應性檢測HBsAg來證明透析親和池中產(chǎn)物的特性。
表Ⅱ樣本AUSRIA,ug/Mg/蛋白破碎細胞發(fā)酵罐mnn9-(1.13,1.10,1.06)玻璃珠mnn9-(3.1,4.4)Manton-Gaulin野生型(3.3)Manton-Gaulin實施例9大規(guī)模純化重組HBsAg約250g產(chǎn)生重組S蛋白的凍存細胞糊懸浮于約1500ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中得到濕重量/體積為17%。通過水浴將細胞加熱至45℃。細胞在45℃維持15分鐘，然后置于冰上冷卻至10℃。然后經(jīng)Gaulin勻質器的兩個通道破碎細胞。
在均化作用之后，加入10%TritonX-100至終濃度0.3%，并進行混合約15分鐘。然后于3，600xg在4℃離心細胞提取物20分鐘，收集上清液。
將上清通過一個含約200gXAD-2樹脂的柱子以去除TritonX-100。流出液直接流過一個含約150g大孔硅膠的柱子，其中硅膠孔徑大小為約1500 ，顆粒大小約50μm。所用的柱直徑為5cm(Pharmacia)，其流速為約200ml/小時。
用PBS沖洗硅膠柱，直到A280回復至基線。
首先用冷的硼酸鹽緩沖液(50mM，pH8.7，4℃)以500ml/小時的流速從硅膠柱中洗脫S蛋白，直到觀察到A280的上升。一旦A280開始上升，即將硅膠柱加熱到55℃，并把55℃的硼酸鹽緩沖液以500ml/小時的流速過柱。在冰上收集含S蛋白的洗脫物(約1升)。使用一個能截住105分子量的中空纖維分離濾過單位，以50mM硼酸鹽緩沖液(pH8.7)進行分離過濾將該洗脫物濃縮至200ml。用0.2μm濾器過濾S蛋白，并貯存S蛋白。經(jīng)Western blot分析觀察發(fā)現(xiàn)，該產(chǎn)物是穩(wěn)定的，沒發(fā)生明顯的降解。
實施例10測定重組HBV表面蛋白的糖含量使用Dubois的方法[Dubois，M.etal.，Anal.Chem.，28，p350，1956]確定重組HBV表面蛋白中的糖含量。該方法的一般原理是，單糖、寡糖、多糖及其衍生物，包括不含或可能不含還原基團的甲基醚在與苯酚和濃硫酸反應之后產(chǎn)生桔黃色。在恒定的酚濃度下所產(chǎn)生的顏色深淺與所存在的糖含量成正比例。
為了確定產(chǎn)生于野生型酵母株和mnn9-酵母中的HBsAg中的糖含量，將含10-70μg蛋白的溶液1ml置于試管中。制備含不同糖量的一系列糖標準物和空白樣本。向每只試管中加入1ml 5%的酚溶液，混勻試管，然后加入5ml 96%的濃硫酸，再混勻。試管于室溫下溫育10分鐘，混勻后，再于25-30℃溫育20分鐘。用分光光度計檢讀樣本(A490為己糖和甲基化己糖，A480為戊糖、戊糖酸及其甲基化衍生物)，通過與糖標準物相比較確定HBV表面蛋白樣本中的糖含量。
基于這些結果，用樣本中糖的毫克數(shù)除以蛋白的毫克數(shù)計算出每個樣本中糖含量與蛋白含量的比值，其結果如下所示HBsAg中的糖與蛋白的比值酵母菌株糖/蛋白mnn9-0.05進行糖基化作用的野生型0.56(MNN9+)所計算出的比值表明，產(chǎn)生于mnn9-重組酵母細胞中的HBsAg中的糖含量始終是產(chǎn)生于重組“野生型”酵母細胞的HBsAg糖含量的1/10。這些結果說明，與“野生型”酵母細胞生產(chǎn)的HBsAg相比，mnn9-突變酵母細胞產(chǎn)生的HBsAg所含的糖量大大減少。
序列單(1)概述(ⅰ)申請人Kniskern，P.J.
Hagopian，A.
(ⅱ)發(fā)明名稱減少了宿主糖含量的乙型肝炎病毒表面蛋白(ⅲ)序列數(shù)9(ⅳ)通訊地址(A)地址Merck&Co.，Inc(B)街道P.O.Box2000(C)城市Rahway(D)州NewJersey
(E)國家US(F)郵政編碼07065-0900(ⅴ)計算機可讀形式(A)儲存類型Floppy盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentinRelease＃1.0，Version＃1.25(ⅵ)目前的申請資料(A)申請?zhí)枱o(B)申請日無(C)分類無(ⅷ)代理人情況(A)姓名Pfeiffer，HesnaJ.
(B)登記號22，640(C)查詢號18346(ⅸ)通訊情況(A)電話(908)594-4251(B)電傳(908)594-4720(2)有關SEQIDNO∶1∶的資料(ⅰ)序列特征(A)長度10bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單(D)拓撲線性
(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶1∶ACAAAACAAA10(2)有關SEQIDNO∶2∶的資料(ⅰ)序列特征(A)長度30bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶2∶AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGCAGTGG30(2)有關SEQIDNO∶3∶的資料(ⅰ)序列特征(A)長度30bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶3∶GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA30(2)有關SEQIDNO∶4∶的資料(ⅰ)序列特征(A)長度15bp
(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶4∶ATACATTTAA GCTTG15(2)有關SEQIDNO∶5∶的資料(ⅰ)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶5∶TGTAAATTTC GAACCTAG18(2)有關SEQIDNO∶6∶的資料(ⅰ)序列特征(A)長度45bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶6∶AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGGAGAAC
ATCACATCAG GATTC45(2)有關SEQIDNO∶7∶的資料(ⅰ)序列特征(A)長度45bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶7∶GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGTGTAGTCCTAA GGATC45(2)有關SEQIDNO∶8∶的資料(ⅰ)序列特征(A)長度29bp(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶8∶AATTGTCGAC AGCTAGCTGA ATTCCCGGG29(2)有關SEQIDNO∶9∶的情況(ⅰ)序列特征(A)長度29bp(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅹⅰ)序列表示SEQIDNO∶9∶AGCTCCCGGG AATTCAGCTA GCTGTCGAC29
權利要求
1.一種用于生產(chǎn)重組多肽和蛋白質的真核表達系統(tǒng)，其生產(chǎn)的重組多肽和蛋白質所含的宿主細胞糖或糖蛋白含量大大降低。
2.權利要求1的表達系統(tǒng)中的真核宿主是酵母。
3.權利要求2的表達系統(tǒng)，其中的酵母宿主是啤酒酵母。
4.權利要求1的表達系統(tǒng)，其中的重組多肽或蛋白質是一種乙型肝炎病毒多肽或蛋白質。
5.權利要求4的表達系統(tǒng)，其中的乙型肝炎病毒多肽或蛋白質是一種包膜多肽或蛋白質。
6.權利要求5的表達系統(tǒng)，其中的乙型肝炎病毒多肽或蛋白質是HBsAg。
7.一種乙型肝炎病毒表面蛋白，它形成含有大幅度降低了獲取性糖或糖蛋白含量的顆粒。
8.根據(jù)權利要求7的乙型肝炎病毒表面蛋白，它是由存在蛋白質糖基化遺傳性缺陷的重組酵母細胞產(chǎn)生的。
9.根據(jù)權利要求8的乙型肝炎病毒表面蛋白，其中酵母細胞的遺傳性缺陷存在于mnn9基因。
10.權利要求7的乙型肝炎病毒表面蛋白，其中純化的表面蛋白中糖與蛋白的比值低于0.5。
11.一種用于人類的抗乙型肝炎病毒的疫苗，它包括一種可形成獲取糖或糖蛋白含量已大幅度減少了的顆粒的乙型肝炎病毒表面蛋白。
12.根據(jù)權利要求5的疫苗，它由存在蛋白質糖基化遺傳性缺陷的重組酵母細胞產(chǎn)生。
13.根據(jù)權利要求12的疫苗，其中的遺傳性缺陷存在于mnn9基因。
14.根據(jù)權利要求11的疫苗，其中的表面蛋白中糖與蛋白的比值低于0.5。
15.一種免疫診斷制劑，含有乙型肝炎病毒蛋白，該乙型肝炎病毒蛋白形成的顆粒含有的宿主細胞糖或糖蛋白含量已大大減少，并且與天然產(chǎn)生的抗酵母抗體的反應性也被減少。
16.根據(jù)權利要求15的免疫診斷制劑，其中的純化表面蛋白中糖與蛋白的比值低于0.5。
全文摘要
為了生產(chǎn)含有大大降低了獲取糖含量的顆粒形式的乙型肝炎病毒(HBV)表面蛋白，在缺乏蛋白質糖基化能力的重組酵母宿主中表達編碼HBV表面蛋白的DNA。這些HBV表面蛋白顯示出由HBV病毒體包膜蛋白開放閱讀架的S區(qū)進行遺傳編碼的抗原性位點，并且與由野生型酵母細胞產(chǎn)生的HB
文檔編號A61P31/12GK1067680SQ92104290
公開日1993年1月6日 申請日期1992年4月28日 優(yōu)先權日1991年4月29日
發(fā)明者P·J·尼斯肯, A·哈戈皮安 申請人:麥克公司