專利名稱：預(yù)測鱗狀細(xì)胞肺癌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在一個實施例中，本發(fā)明涉及一種方法，該方法通過觀測選擇的微RNA(miRNA)序 列產(chǎn)生的調(diào)控改變來提供對鱗狀細(xì)胞肺癌的預(yù)后。通過觀測特定序列的上調(diào)或下調(diào)，可確 定癌細(xì)胞的存在以及癌的預(yù)后這兩種情況。
背景技術(shù)：
肺癌是世界范圍內(nèi)癌相關(guān)死亡的最通常原因，而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)為支氣管 肺癌的最常見類型。NSCLC是80 %的美國全部肺癌死亡的原因并且主要由腺癌和鱗狀上皮 細(xì)胞癌(SSC)以及大細(xì)胞癌組成，大細(xì)胞癌較少。盡管可進(jìn)行有可能治愈的外科手術(shù)，但大 約40%的患者會在5年內(nèi)復(fù)發(fā)。最近，NSCLC的基因組分布分析使得能對患有該疾病的患 者進(jìn)行預(yù)后。這種基因組分類器(genomic classifier)可包含最多數(shù)百種用于鑒別患有 早期NSCLC的患者的基因，這些患者可能會受益于外科手術(shù)切除加上化學(xué)療法。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的一種形式中，本發(fā)明包括用于檢測細(xì)胞樣品中鱗狀細(xì)胞肺癌的存在的 方法。申請者已發(fā)現(xiàn)了某些miRNA，其在鱗狀細(xì)胞肺癌中相對于野生型細(xì)胞受到差異調(diào)控。 通過測定這類miRNA的調(diào)控改變程度，可確定組織樣品是否包括鱗狀細(xì)胞肺癌細(xì)胞。在另一種形式中，本發(fā)明為預(yù)測鱗狀細(xì)胞肺癌的預(yù)后的方法。申請者已發(fā)現(xiàn)了 某些其他miRNA，其使得能對患有鱗狀細(xì)胞肺癌的患者對預(yù)后進(jìn)行預(yù)測。通過監(jiān)測這些 miRNA,可提供更準(zhǔn)確的預(yù)后。


本發(fā)明參照附圖進(jìn)行公開，其中圖1A是將所關(guān)注的miRNA序列的數(shù)目與預(yù)測預(yù)后相關(guān)的坐標(biāo)圖。圖1B是針對miR_146b表達(dá)的兩種差異水平的存活百分比與時間相關(guān)的坐標(biāo)圖。對應(yīng)參考符號表明貫穿若干視圖的對應(yīng)部分。本文列出的例子示出了本發(fā)明的幾 個實施例，但是不應(yīng)該理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式定義
短語“調(diào)控改變”指細(xì)胞組分(例如miRNA)相對于野生型細(xì)胞中相同細(xì)胞組分豐 度的豐度改變。短語“下調(diào)”指所考慮的細(xì)胞組分豐度的下降，而短語“上調(diào)”指組分豐度 增加。根據(jù)差異miRNA調(diào)控鑒別鱗狀細(xì)胞肺癌將鱗狀細(xì)胞肺癌組織與野生型組織比較并鑒定了十五種差異表達(dá)的miRNA(表 1)。組織樣品包括細(xì)胞系和臨床樣品兩者。根據(jù)常規(guī)技術(shù)從細(xì)胞樣品提取總RNA。例如，可 將mirVana分離試劑盒(Ambion)用于速凍樣品而將RecoverAll 總核酸分離試劑盒用于 福爾馬林固定石蠟包埋的(FFPE)樣品(Ambion)。也可以使用其他常規(guī)的RNA提取方法。 一旦提取總RNA后，可通過凝膠電泳分離小的(少于四十個核苷酸的)RNA。對樣品進(jìn)行分 析以確定特定miRNA序列的種類和豐度?？蓪⑷魏魏线m的技術(shù)用來確定種類和豐度，例如 但不限于市售的miRNA試劑盒，例如mirVana Bioarray (Ambion)。在鱗狀細(xì)胞肺癌細(xì)胞中 鑒定了十五種表達(dá)相對于野生型樣品顯著改變的miRNA。表1中示出了這些序列。表1.在正常肺和肺鱗狀細(xì)胞癌之間差異表達(dá)的miRNA。 LN =肺正常信號強度(log2) ；LC =肺癌信號強度(log2)改變倍數(shù)=2ae_lN)在本發(fā)明的一個實施例中，對樣品進(jìn)行分析以確定表1的特定miRNA序列的豐度。 樣品可以是組織樣品，例如在外科手術(shù)操作期間獲得的樣品?；蛘?，樣品可從例如血樣或從 類似來源以非侵入性方式獲得。確定樣品中特定miRNA的豐度并觀測相對于一般樣品的調(diào) 控改變。由于已知miRNA保持在細(xì)胞外，所以游離的miRNA可提供鱗狀細(xì)胞肺癌的篩選方 法。該篩選方法可用非侵入性采樣技術(shù)來進(jìn)行，例如簡單的血試驗。以這種方式，可對高風(fēng) 險群體中的患者進(jìn)行常規(guī)的檢測以幫助鑒別早期的癌發(fā)展。在另一個實施例中，對miRNA豐度進(jìn)行觀測以將鱗狀細(xì)胞肺癌與腺癌區(qū)分。通過 觀測miRNA表達(dá)的調(diào)控改變，即使是在組織形態(tài)未清晰時也可進(jìn)行這種區(qū)別。肺鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了另外的miRNA序列，這些序列使得人們可對肺鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測。因而二十種miRNA序列被鑒定為與鱗狀細(xì)胞肺癌預(yù)后緊密相關(guān)。臨床樣品在1991年 十月至2002年7月之間收集。還收集了每位患者的病歷并在表現(xiàn)出調(diào)控改變的那些miRNA 與患者預(yù)后之間進(jìn)行相關(guān)分析。該相關(guān)分析方法的細(xì)節(jié)在本說明書其它地方進(jìn)行論述。以 這種方式，鑒定出強烈影響患者預(yù)后的那些miRNA序列。表2列出了所鑒別的序列。表2.與鱗狀細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)的miRNA。 平均0和平均1分別為野生型組織和癌性組織。使用五倍交叉驗證，發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單獨使用miR_146b(SEQ ID NO. 15)時預(yù)測三年內(nèi)的 總體存活率的最高平均值為78%。當(dāng)以線性方式向Mir-146b增加三種或更多種另外的 miRNA時，預(yù)測準(zhǔn)確性降低至大約68%，但此后穩(wěn)定。參見圖1A。與低miRNA_146b組(95 個月)相比，高miRNAmiR-146上調(diào)的患者具有顯著更差的總體存活率(26個月)。參見圖 1B。在圖1B中，“高”miRNA-146組(兩條線中較低者)定義為miRNA_146水平高于中值的 那些?！暗汀眒iRNA-146組(兩條線中較高者)定義為miRNA-146水平低于中值的那些。通過測量特定miRNA序列的豐度可給患者提供預(yù)測性預(yù)后。例如，可收集特定序 列的miRNA豐度與隨時間變化的患者存活率相關(guān)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。例如，對于某種miRNA序列 有大的調(diào)控改變的患者，該數(shù)據(jù)可表明在接下來的三年內(nèi)緩解的可能性為78%。可給患者 提供這種預(yù)測性預(yù)后。圖1B提供了 miR-146b的樣品數(shù)據(jù)，但這種數(shù)據(jù)不應(yīng)理解為是限制 性的?？蓪㈩~外的數(shù)據(jù)(例如患者的人口統(tǒng)計信息)考慮在內(nèi)，使得可收集更廣泛的統(tǒng)計 fn息omiRNA可用常規(guī)的技術(shù)從組織樣品提取。這種樣品可在外科手術(shù)操作期間獲得?；蛘?，可從非組織樣品分離miRNA。例如，可從血液、糞便、尿或其他生物樣品分離miRNA。將 樣品中存在的特定miRNA的豐度與正常樣品進(jìn)行比較。上調(diào)的或下調(diào)的miRNA豐度可指示癌。特定miRNA序列的豐度可根據(jù)任意已知的技術(shù)測定?？墒褂美绲幌抻赒PCR。隨附的序列表中的miRNA序列代表了通常分離的miRNA序列。所列出的序列末端 的改變是本領(lǐng)域已知的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)，前提條件是殘基有至少95%的同源性。盡管已參考具體的實施例描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，可進(jìn)行多 種改變并且可用等價物取代其要素以適應(yīng)于具體的情況而不背離本發(fā)明的范圍。因而，旨 在不使本發(fā)明受限于所公開的具體實施例或考慮用于執(zhí)行本發(fā)明的具體方式，而是本發(fā)明 將包括落入所附權(quán)利要求書的范圍和精神的所有實施例。Tffe臨床樣品總共，對六十一份速凍肺SCC樣品和10份匹配的正常的相鄰肺組織樣品的 miRNA表達(dá)進(jìn)行評價。這些樣品收集自1991年十月和2002年七月之間的密西根大學(xué) 醫(yī)院(University of Michigan Hospital)的患者，征得了患者的同意和倫理委員會 (Institutional Review Board)的批準(zhǔn)。選擇用于分析的樣品含有高于70%的腫瘤細(xì)胞。 在這六十一份腫瘤樣品中，五十七份樣品具有足夠充分的隨訪臨床信息并將其用于預(yù)后分 析。這五十七份中有五十四份此前用Affymetrix U133A GeneChip (GSE4573)進(jìn)行了表達(dá) 譜分析。Ambion miRNA 表達(dá)譜分析采用含有328種人miRNA探針的mirVana Bioarray (Ambion，第2版)來鑒定肺 SCC miRNA 特征(signature)。用 Trizol 分離總 RNA。用 mirVana 分離試劑盒(Ambion)從 4ug總RNA分離MiRNA。然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(Flash-Page Ambion)分成級分并 通過采用線性丙烯酰胺的乙醇沉淀來回收小RNA( < 40nt)。在進(jìn)行miRNA陣列分析前，將 miR-16的定量RT-PCR(qPCR)用于確認(rèn)miRNA富集。如果miR-16的Ct值大于25，則認(rèn)為 miRNA分離失敗。讓小RNA樣品接受聚㈧聚合酶反應(yīng)，其中摻入了胺改性的尿苷(Ambion)。然后 用胺反應(yīng)性Cy3(InVitr0gen)對加尾的樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記。上述標(biāo)記技術(shù)僅是一種可能的 方法。在受益于閱讀本說明書后，其他合適的標(biāo)記技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易 見的。這些替代方法可考慮用于本說明書。用玻璃纖維過濾器對熒光標(biāo)記的RNA進(jìn)行純化 并洗脫(Ambion)。然后在42°C (Ambion)下將每種樣品與Bioarray芯片雜交14小時。洗 滌陣列并用Agilent 2505B共聚焦微陣列掃描儀(Agilent)掃描，用Expression Analysis 軟件(C0delink，4.2版)獲得數(shù)據(jù)。miRNA 定量 PCR用ABI miRNA Taqman試劑進(jìn)行定量PCR (QPCR)以驗證miRNA表達(dá)譜。根據(jù)生產(chǎn) 商的說明書(Ambion)用大容量DNA庫試劑盒(High CapacityDNA Archive kit)和3 yl 的5x RT引物將10ng的總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。將15 yl反應(yīng)物在熱循環(huán)儀中溫育，16°C下 30分鐘、42°C下30分鐘、85°C下5分鐘并保持在4°C下。所有的逆 錄酶反應(yīng)均包括無模 板對照。QPCR用標(biāo)準(zhǔn)的Taqman PCR試劑盒規(guī)程在Applied Biosystems 7900HT序列檢測系統(tǒng)上進(jìn)行。10ml PCR反應(yīng)物包括0. 66 ill RT產(chǎn)物、1 u 1 TaqmanmiRNA測定引物和探 針混合物、5 P 1 Taqman 2x通用PCR主混合物(NoAmperase UNG)和3. 34 yl水。將該反 應(yīng)物在95°C下于384孔板中溫育10分鐘，然后進(jìn)行40個如下循環(huán)95°C下15秒，60°C下2 分鐘。全部QPCR反應(yīng)物均包括無cDNA對照并且全部反應(yīng)一式三份來進(jìn)行。MiRNA統(tǒng)計分析首先將Expression Analysis軟件標(biāo)記的探針除去并從點平均值減去背景中 值。如果標(biāo)記的探針的數(shù)目少于每個芯片標(biāo)記探針的平均值減去標(biāo)準(zhǔn)偏差，則確定異常 樣品并除去。將低于零的點強度值設(shè)為0.5，然后將數(shù)據(jù)進(jìn)行分?jǐn)?shù)位標(biāo)準(zhǔn)化(quantile normalized)。通過將所有樣品的重復(fù)探針的相關(guān)性對中值強度的中值作圖確定背景截斷 值為6 (log2標(biāo)準(zhǔn)化)。因此，如果標(biāo)準(zhǔn)化的信號強度在任一比較組中小于6，則在進(jìn)一步的 分析中將miRNA除去。由于低于該值時重復(fù)探針的相關(guān)性急劇下降，所以選擇該截斷值。用微陣列顯著性分析(SAM)算法(TusherVG, Tibshirani R，Chu G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizingradiation response. Proc Natl Acad Sci USA 2001 ；98 (9) :5116_21)進(jìn)行存活率分析。如果配對t_檢驗p-值小于0. 05 并且使用3-年截斷值的接受器工作特征分析的曲線下面積(AUC)大于0. 65，則將MiRNA選 擇為與總體存活率顯著相關(guān)。采用了最多3年的隨訪，因為該群體中將會復(fù)發(fā)的患者大多 數(shù)在3年內(nèi)會復(fù)發(fā)。另外由于3年后非癌癥相關(guān)疾病有可能增加，這些患者中有許多變老 并死亡。為了確定用于構(gòu)建預(yù)后分類器的miRNA的最小數(shù)目，通過根據(jù)等級次序一次添加 一種基于來對基因表達(dá)標(biāo)記物的組合進(jìn)行檢驗。對于基因數(shù)目增加的每種特征，進(jìn)行了用 3年內(nèi)死亡作為限定點的接收器工作特征(R0C)分析(在100次5倍交叉驗證中)，以計算 平均的曲線下面積(AUC)。
權(quán)利要求
一種在人中預(yù)測鱗狀細(xì)胞肺癌的預(yù)后的方法，包括如下步驟觀測提取的RNA中微RNA相對于野生型肺組織樣品中相同微RNA的調(diào)控改變，其中所述微RNA選自SEQ ID NO.15、SEQID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34以及它們的組合；根據(jù)所述觀測預(yù)測鱗狀細(xì)胞肺癌的預(yù)后。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括在所述觀測調(diào)控改變的步驟之前除去多于四十 個核苷酸的RNA的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微RNA選自SEQID NO. 15,SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25,SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 30,SEQ ID NO. 31以及它們的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中對上調(diào)進(jìn)行觀測。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微RNA選自SEQID NO. 17,SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29,SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34 以及它們的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中對下調(diào)進(jìn)行觀測。
7.—種在人中預(yù)測鱗狀細(xì)胞肺癌的預(yù)后的方法，包括如下步驟觀測提取的RNA中SEQ ID NO. 15相對于野生型肺組織樣品中相同微RNA的調(diào)控變化；根據(jù)所述觀測預(yù)測鱗狀細(xì)胞肺癌的預(yù)后。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，還包括從肺組織樣品提取總RNA的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述觀測步驟包括進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的步馬聚ο
10.一種在人中預(yù)測鱗狀細(xì)胞肺癌的預(yù)后的方法，包括如下步驟觀測樣品中SEQ ID NO. 15的豐度；根據(jù)所述觀測預(yù)測鱗狀細(xì)胞肺癌的預(yù)后。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述觀測豐度的步驟包括將所述樣品的SEQID NO. 15豐度與野生型樣品中的SEQ ID NO. 15豐度進(jìn)行比較的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中當(dāng)進(jìn)行所述比較時，發(fā)現(xiàn)SEQIDNO. 15上調(diào)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中當(dāng)發(fā)現(xiàn)上調(diào)時，發(fā)現(xiàn)至少1.5倍的改變。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中SEQID NO. 15為唯一觀測的微RNA。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述觀測步驟包括進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的 步驟。
全文摘要
本說明書公開的是通過觀測選擇的微RNA序列的調(diào)控改變來預(yù)測鱗狀細(xì)胞肺癌的預(yù)后的方法。這些序列可包括hsa-mir-146b、hsa-mir-191、hsa-mir-206、hsa-mir-299-3p、hsa-mir-155、hsa-mir-15a、hsa-mir-122a、hsa-mir-513、hsa-mir-184、hsa-mir-511、hsa-mir-100、hsa-mir-10a、hsa-mir-453、hsa-mir-379、hsa-mir-202、hsa-mir-21、hsa-mir-126、hsa-mir-494、hsa-mir-432、hsa-mir-370以及這些序列的組合。
文檔編號C12Q1/68GK101878313SQ200880114163
公開日2010年11月3日 申請日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者L·E·多西, M·拉波尼 申請人:維里德克斯有限責(zé)任公司