專利名稱：使用內(nèi)含子的核糖核酸生成人類類胚胎干細(xì)胞的制作方法
使用內(nèi)含子的核糖核酸生成人類類胚胎干細(xì)胞要求的優(yōu)先權(quán)本發(fā)明要求以下申請的優(yōu)先權(quán)2007年10月29日提交的申請?zhí)枮?1/000，797的 美國臨時(shí)申請、2007年12月17日提交的申請?zhí)枮?1/007，867的美國臨時(shí)申請、2007年12 月28日提交的申請?zhí)枮?1/006，179的美國臨時(shí)申請和2007年12月28日提交的申請?zhí)?為12/003，662的美國臨時(shí)申請。需要指出的是申請?zhí)枮?2/003，662的美國申請要求2003 年5月15日提交的申請?zhí)枮?0/439,262的美國申請和2006年3月31日提交的申請?zhí)枮?11/278，143的美國申請的優(yōu)先權(quán)
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于一種通過內(nèi)含子的微核糖核酸因子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)來開發(fā)、生成與篩選 人類類胚胎干細(xì)胞的手段和方法。具體而言，本發(fā)明是關(guān)于一種用來生成非天然產(chǎn)生的內(nèi) 含子的方法與組合物。此內(nèi)含子的組成能在人類細(xì)胞中被加工成小發(fā)夾樣前體微核糖核酸 (microRNA(miRNA))分子，因此誘導(dǎo)細(xì)胞中的某些與分化相關(guān)的基因以及決定命運(yùn)的基因 的沉默效應(yīng)，進(jìn)而使該等細(xì)胞轉(zhuǎn)重新編程為多潛能類胚胎干細(xì)胞狀態(tài)。優(yōu)選地，發(fā)夾樣前體 微核糖核酸(pre-miRNA)包括 mir_302a、mir_302b、mir_302c、mir_302d 和與上述核糖核 酸手工重新設(shè)計(jì)的前體同源物，以及它們的組合
背景技術(shù)：
近來關(guān)于人類干細(xì)胞的研究已顯示其可用來移植治療的巨大潛力。然而，可用 來復(fù)制人類干細(xì)胞(hES)的來源卻受到限制，并且很難控制其純度與品質(zhì)。于1998年， James Thomson 等人(如 US5, 843，780、US6, 200，806、US7, 029，913 及 US7, 220，584 等專 利)從人類胚胎的胚胞中分離出第一株人類胚胎干細(xì)胞(Thomson et al.，(1998) Science 282 1145-1147)。而Hl與H9兩株典型的細(xì)胞株則由上述分離的人類干細(xì)胞中衍生出來。 兩年后，Gearhart 等人(如 US6, 090，622、US6, 245，566 及 US6, 331，406 等專利)也發(fā)展 出從人類胚胎的后胚胞(post-blastocyst)中分離出人類類胚胎干細(xì)胞的原始生殖細(xì)胞 (primordial germ cells)的手段和方法。因?yàn)檫@些胚胎干細(xì)胞的分離方法必須將原來的 胚胎破壞，因此許多道德上、人文宗教上的疑慮逐漸提升，以至于爭論這些胚胎干細(xì)胞用于 臨床治療的正當(dāng)性。近年來，人們逐漸重視使用這些分離的人胚胎干細(xì)胞系的安全性問題。舉例來說， 由于用于使人類胚胎干細(xì)胞系長期保持多潛能干細(xì)胞狀態(tài)的培養(yǎng)條件需要一些由周圍的 的飼養(yǎng)層成纖維細(xì)胞所釋放的未知因子，因此這些人類胚胎干細(xì)胞通常培養(yǎng)于小鼠或人類 的成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層層中。ReubinofT等人的先前技術(shù)包括US6，875，607嘗試完成此方 法，然而成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層具有全然不同的抗原特性，而可能污染人類胚胎干細(xì)胞并造 成病人免疫上的排斥。此外，雖然已經(jīng)有開發(fā)出一些無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)環(huán)境條件，但沒有一種 條件能維持穩(wěn)定、未分化的人類胚胎干細(xì)胞持續(xù)一段時(shí)間。這是因?yàn)?，被分離出來的人類胚 胎干細(xì)胞的純度通常不高?，F(xiàn)今并無任何一株胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)環(huán)境中能達(dá)到百分的百的高純度。即使是在最佳飼養(yǎng)層培養(yǎng)環(huán)境條件下，有比例不確定(約有3 5%或更多)的人 類胚胎干細(xì)胞傾向于分化成其它細(xì)胞型態(tài)并喪失其干細(xì)胞的特性。經(jīng)常觀察到的胚胎干細(xì) 胞分化的細(xì)胞類型是畸胎瘤(teratoma)。畸胎瘤是一種衍生自人類生殖細(xì)胞系的腫瘤，其 常包含多種癌化的細(xì)胞型態(tài)，這些型態(tài)相似于內(nèi)胚層、中胚層及外胚層。因此，如何避免飼 養(yǎng)層污染及增加干細(xì)胞純度是現(xiàn)今干細(xì)胞研究主要的兩項(xiàng)課題。誘導(dǎo)型多潛能干細(xì)胞(iPS)是由Takahashi及Yamanaka最近于2006年提出的 (Cell 126:663-676)。將四種轉(zhuǎn)錄因子基因(0ct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4)通過使用轉(zhuǎn)基因 傳遞進(jìn)入小鼠成纖維細(xì)胞中，于體外將體成纖維細(xì)胞成功地重編程和轉(zhuǎn)化成類胚胎干細(xì)胞 的多潛能細(xì)胞。在2007年，Okita及Wernig等人確認(rèn)iPS細(xì)胞的行為特性與小鼠胚胎干 細(xì)胞(mES)的相似(Okita et al.，(2007)Nature 448 :313_317 ；Wernig et al.，(2007) Nature 448 :318_324)。此外，Yu等人藉由相似的方法使用四個(gè)其它的轉(zhuǎn)基因(0ct4、Sox2、 Nanog及LIN28)從人類成纖維細(xì)胞開發(fā)更新穎的iPS細(xì)胞(Yu et al. , (2007) Science 318 :1917-1920)。iPS的應(yīng)用不近能解決以前的hES細(xì)胞中存在的道德與純度的問題，而 且如果與體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技(SCNT)術(shù)配合還可提供一種對患者友好的治療方式(Meissner et al.，(2006) Nature 439 =212-215)。上述基于iPS細(xì)胞技術(shù)的體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移治療技術(shù)已 經(jīng)在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中證實(shí)能成功治療鐮刀型貧血癥(Harma et al, (2007) Science 318 1920-1923)。然而，iPS的應(yīng)用仍有缺陷。在iPS細(xì)胞生成過程中出現(xiàn)兩個(gè)問題；第一個(gè)問 題是使用反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因；另一個(gè)問題是使用癌基因(e.g. c-Myc)。而反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染 方式是唯一一種可有效同時(shí)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因傳遞四種全長轉(zhuǎn)錄基因進(jìn)入靶體細(xì)胞的方法，然而 反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨機(jī)插入轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的基因組可能會影響非靶基因并造成不可預(yù)期的結(jié) 果，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)傳遞的基因是癌基因時(shí)這尤其危險(xiǎn)。要精確地同時(shí)將四個(gè)全長轉(zhuǎn)基因傳遞至同一個(gè)細(xì)胞是相當(dāng)困難的。然而，iPS細(xì)胞 技術(shù)事實(shí)上需要使用多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子以彌補(bǔ)和調(diào)整它們之間的信號傳導(dǎo)以及某些其它的發(fā) 育因子。雖然詳細(xì)的機(jī)制仍不清楚，但0ct4-Sox2-c-Myc-Klf4或0ct4-Sox2_Nanog-LIN28 的基因結(jié)合效應(yīng)似乎導(dǎo)致了細(xì)胞早期分化所需的發(fā)育信號的取消。盡管胚胎干細(xì)胞標(biāo)計(jì) 0ct4，在iPS細(xì)胞生成中所使用的所有其它基因與某些發(fā)育系相關(guān)。這些基因通常表達(dá)于 不同胚胎細(xì)胞時(shí)期和/或位置而導(dǎo)引細(xì)胞走向特定分化路徑。藉由錯(cuò)置這些基因，這些發(fā) 育信號的干擾以某種方式終止了細(xì)胞分化的分化，進(jìn)而使這些宿主細(xì)胞返回至類似胚胎干 細(xì)胞的狀態(tài)，直至另一個(gè)發(fā)育信號的出現(xiàn)。這一套方法能達(dá)到目的但并不自然。在自然的受 精卵中，母系物質(zhì)主要對干細(xì)胞的維持與復(fù)制的調(diào)控負(fù)責(zé)。這就是胚胎干細(xì)胞在128-細(xì)胞 時(shí)期之前全都相同的并都具有全能的原因。母系物質(zhì)產(chǎn)生于卵子發(fā)生時(shí)期，并存于成熟的 卵子中以供早期胚胎發(fā)育。在小鼠的卵子中，核糖核酸占了母系物質(zhì)很大的比例，約占整體 基因組轉(zhuǎn)錄組的 45% (Stitzel et al.，(2007) Science 316:407-408)。在母型-合子型 過渡中，母系RNAs很快速地降解，合子的轉(zhuǎn)錄過程則早在兩細(xì)胞時(shí)期開始以產(chǎn)生供胚胎進(jìn) 一步發(fā)育的信號(0’ Farrell et al.，(2004) Curr. Biol. 14 :R35_45)。據(jù)信許多母系 RNAs 是合子基因產(chǎn)物的抑制物，以在最早期胚胎時(shí)期可抑制發(fā)育信號并維持全能/多潛能細(xì)胞 分化。因此，干細(xì)胞維持及復(fù)制的秘密應(yīng)該存在于母系物質(zhì)中，而不存在于遠(yuǎn)遠(yuǎn)晚于多潛能 干細(xì)胞時(shí)期顯現(xiàn)的發(fā)育信號中。簡言之，為了生成并維持類人類胚胎干細(xì)胞(hES)-like cells)樣細(xì)胞模仿母系
8物質(zhì)的天然途徑，需要一種新穎的方式來轉(zhuǎn)基因傳遞分離的母系物質(zhì)到人體干細(xì)胞或體細(xì) 胞中，以維持干細(xì)胞特性或重編程體細(xì)胞成hES樣細(xì)胞。因此，仍然需要一種使用母系物質(zhì) 特別是母系核糖核酸的有效、簡單、安全的轉(zhuǎn)基因方法和試劑組合物以產(chǎn)生hES樣細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是一種使用發(fā)夾樣微核糖核酸(microRNA)因子的內(nèi)含子表達(dá)來培育、 生成與篩選類胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因方法，所述發(fā)夾樣微核糖核酸因子為例如mir-302a、 mir-302b、mir-302c、mir_302d及它們相互重組的前體微核糖核酸的同源物，和它們的組 合。微核糖核酸通常約長18到27 (nt)的核苷酸，并取決于miRNA和它靶的物的互補(bǔ)程 度能直接降解它們的信使核糖核酸(mRNA)靶或抑制靶蛋白的翻譯。在所有哺乳動物中， mir-302家族是高度保守的，此家族由四個(gè)高度同源的微核糖核酸成員組成(> 90%同源 性)，它們分別是 mir-302a、mir_302b、mir_302c 和 mir_302d。mir-302 家族一起表達(dá)成 長RNA轉(zhuǎn)錄物的簇，該長RNA轉(zhuǎn)錄物編碼從5端到3端的mir-302b-mir-302c-mir-302a-m ir-302d-mir-367 (Suh et al.，(2004) Dev. Biol. 270 :488_498)。雖然 mir-367 共同表達(dá) 在mir-302簇中，然而mir-367實(shí)際上的表達(dá)水平低于mir-302家族。而mir-302家族成 員的表達(dá)被發(fā)現(xiàn)只在小鼠卵細(xì)胞及人類胚胎干細(xì)胞中高水平地表達(dá)(Tang，et al.，(2007) Genes Dev. 21 644-648 ；Suh et al.，(2004)Dev. Biol. 270 :488_498)。小鼠的卵細(xì)胞缺 乏岱塞爾(Dicer)，岱塞爾是一種保守的核糖核酸酶可供微核糖核酸生成，卵細(xì)胞限制在 減數(shù)分裂I的分裂時(shí)期，這現(xiàn)象表示微核糖核酸對于卵細(xì)胞生成的過程扮演重要的腳色 (Murchison et al.，(2007) Genes Dev. 21 :682_693)。因此，mir-302 家族非常有可能是用 于干細(xì)胞維持和復(fù)制的必要的主要母系物質(zhì)。與先前使用提升四種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)水平的iPS細(xì)胞技術(shù)不同，每一個(gè) mir-302家族的成員接能夠調(diào)控超過445種細(xì)胞基因，并且根據(jù)miRBase: Sequences程序 (http:/microrna. sanRer. ac. uk/)的數(shù)據(jù)庫，每一個(gè)mir-302家族的成員幾乎具有相同的 靶基因。許多mir-302的靶基因?qū)嵸|(zhì)上為參與引發(fā)或促進(jìn)胚胎發(fā)育的早期細(xì)胞分化的發(fā)育 信號。因此，mir-302的功能很可能是阻斷或抑制發(fā)育信號的大量產(chǎn)生而不是干擾特定信號 路徑。例如，類胰島素生長因子(IGF))對于神經(jīng)元特定的干細(xì)胞及其先驅(qū)細(xì)胞系是潛在發(fā) 育信號，此信號是經(jīng)由促Ras/Raf/分裂原活化蛋白激酶(MAPK)路徑或經(jīng)由磷脂酰肌醇_3 激酶(PI3K)/Akt信號傳導(dǎo)路徑。超過18種IGF受體(IGFR)與Ras/PI3K信號傳導(dǎo)路徑被 發(fā)現(xiàn)是mir-302家族的靶基因，此現(xiàn)象表示在哺乳卵細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞中有一嚴(yán)密的調(diào)控 來阻止神經(jīng)元特定的細(xì)胞分化。mir-302家族互補(bǔ)地與靶基因的轉(zhuǎn)錄物的同源序列結(jié)合，進(jìn) 而經(jīng)由RNA干擾機(jī)制抑制他們的蛋白翻譯。還觀察到mir-302家族對不同組織細(xì)胞中的許 多其它發(fā)育基因具有類似抑制效應(yīng)。據(jù)上述證據(jù)，mir-302家族很可能對于胚胎干細(xì)胞的 維持與自我復(fù)制扮演很重要的角色。藉由抑制細(xì)胞發(fā)育及分化的靶基因，mir-302家族可 能不僅可將體細(xì)胞重新編程并轉(zhuǎn)化成胚胎干細(xì)胞，而且還能維持該細(xì)胞的多潛能與自我復(fù) 制的胚胎干細(xì)胞能力。為了測試mir-302的干細(xì)胞生成與維持功能，本發(fā)明的發(fā)明人使用基于Pol-的內(nèi) 含子的微核糖核酸表達(dá)系統(tǒng)在不同人類體細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)mir-302家族成員，模仿天然 內(nèi)含子的微核糖核酸生成路徑(圖1)。內(nèi)含子的miRNA的生成過程依賴于初生的Pol- II導(dǎo)的pre-mRNA轉(zhuǎn)錄及內(nèi)含子剪接/切除之間的偶合相互作用，通常發(fā)生在一些靠近基因組染 色質(zhì)纖維附近的細(xì)胞核中(Lin et al. (2004)Drug Design Reviews 1 :247_255 ；Ghosh et al. (2000) RNA 6:1325-1334)。在真核細(xì)胞中，編碼蛋白的基因轉(zhuǎn)錄物，如信使核糖核酸是 由II RNA聚合酶所生成。通?；蚪M基因的轉(zhuǎn)錄生成前體信使核糖核酸(pre-mRNA)，其包 含四個(gè)主要部分5’端非翻譯區(qū)域(UTR)、編碼蛋白的外顯子、無編碼的內(nèi)含子及3’端非翻 譯區(qū)域(3’ -UTR)。廣義來說，5’端及3’端非翻譯區(qū)域可視為特定內(nèi)含子。內(nèi)含子占前體 信使核糖核酸中無編碼序列很大的一部分。每一個(gè)內(nèi)含子可以被被排列成多達(dá)約30個(gè)千 堿基對，且必須在信使核糖核酸成熟前從前體信使核糖核酸中切除。前體信使核糖核酸切 除和內(nèi)含子移除的過程稱為核糖核酸剪接，它通常通過細(xì)胞內(nèi)剪接體執(zhí)行。在核糖核酸剪 接作用之后，一些由內(nèi)含子衍生的核糖核酸片段被進(jìn)一步處理而形成微核糖核酸(miRNA) 樣衍生分子，這些分子能有效地分別沉默抑制它們的靶基因，上述沉默抑制機(jī)制是通過類 核糖核酸干擾機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，而前體信使核糖核酸(pre-mRNA)的外顯子會接合一起而形成 成熟的信使核糖核酸以供蛋白質(zhì)生合成。我們已經(jīng)證實(shí)有效的miRNA能由脊椎動物基因中的內(nèi)含子生成，此生成過程與小 干擾核糖核酸(siRNA)或基因間微核糖核酸(miRNA)生成機(jī)制不同(Lin et al. (2003) Biochem Biophys Res Commun. 310 754-760 ；Lin et al. (2005)Gene 356:32-38)。為 了表示這個(gè)差異，圖2比較了在小干擾核糖核酸(siRNA)、基因間(外顯子)的微核糖核 酸(miRNA)與內(nèi)含子的微核糖核酸(miRNA)之中的天然的生物產(chǎn)生與RNAi機(jī)制。一般推 測，siRNA是由兩條完整互補(bǔ)的核糖核酸所形成，其中這兩條核糖核酸是由同一 DNA模板 上相反位置的啟動子所轉(zhuǎn)錄而成，然后雜交，之后進(jìn)一步被RNase III核酸內(nèi)切酶，即岱塞爾 (Dicer)加工成約20到25堿基對的雙股核糖核酸。不同于siRNA模式，基因間miRNA(如 lin-4及l(fā)et-7)的生成包含一長無編碼初級RNA轉(zhuǎn)錄物，此分子是直接由Pol- II或 Pol-III核糖核酸啟動子所轉(zhuǎn)錄而成；然而對于內(nèi)含子的pri-miRNA，只通過Pol- II將其與 它的編碼基因共同轉(zhuǎn)錄，并在核糖核酸剪接后以剪接的內(nèi)含子形式被釋放。在細(xì)胞核中， pri-miRNA進(jìn)一步由多希亞樣(Drosha-Iike) RNases (用于形成基因間miRNA)或剪接體及 外來體成分(用于形成內(nèi)含子miRNA)切除形成發(fā)夾樣莖環(huán)前體(稱為pri-miRNA)，之后 再被運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)中以被miRNA相關(guān)的Dicer加工而為成熟微核糖核酸。接著，上述三種 形式的小調(diào)節(jié)RNA最后被摻入到核糖核酸誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)中，此復(fù)合體包含雙股 的siRNA或單股的miRNA。Dicer與核糖核酸誘導(dǎo)沉默復(fù)合體用于生成siRNA與miRNA的 路徑是不同的路徑(Tang，G. (2005)Trends Biochem Sci. 30 :106_114)。作為結(jié)果，一般 而言miRNA的效果比siRNA的更專一并且更有利，這是因?yàn)閙iRNA只涉及單股鏈。換句話 說，siRNA主要引發(fā)信使核糖核酸的降解，而miRNA能誘導(dǎo)信使核糖核酸的降解或抑制蛋 白質(zhì)生合成，或者二者，這取決于序列與它們靶基因轉(zhuǎn)錄物的互補(bǔ)性。因?yàn)閮?nèi)含子的miRNA 路徑是被細(xì)胞內(nèi)多重調(diào)控機(jī)制所調(diào)整，其中多重調(diào)控機(jī)制包含Pol- II轉(zhuǎn)錄機(jī)制、RNA剪接、 外來體消化及無義介導(dǎo)降解(NMD)加工，因此內(nèi)含子微核糖核酸的基因沉默效應(yīng)被認(rèn)為 是所有三種RNAi路徑中最有效、最專一、最安全的路徑(Lin et al. (2008)Frontiers in Bioscience 13 :2216_2230)。本發(fā)明揭露一種內(nèi)含子用于基因調(diào)控的新功能及其有關(guān)的應(yīng)用。如圖3A與圖3B 所示，基于內(nèi)含子的核糖核酸剪接作用與加工機(jī)制，本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式是Pol- II介導(dǎo)的重組基因表達(dá)系統(tǒng)，此系統(tǒng)至少包含能經(jīng)剪接的內(nèi)含子，此內(nèi)含子在本發(fā)明當(dāng)中稱的為 SpRNAi, SpRNAi具有抑制靶基因或抑制與SpRNAi序列高度互補(bǔ)的基因的功能。SpRNAi是 與重組基因的前體mRNA (pre-mRNA)通過Pol- II NA聚合酶共同轉(zhuǎn)錄的，并通過核糖核酸剪 接后SpRNA被切割出來。從而，剪接后的SpRNAi進(jìn)一步被加工為成熟的基因沉默劑(例如 小發(fā)夾核糖核酸(shRNA))及微核糖核酸(miRNA))，該些基因沉默劑能激發(fā)RNAi相關(guān)的基 因沉默效應(yīng)。在內(nèi)含子被剪接移除后，重組基因的外顯子轉(zhuǎn)錄物被連接而形成成熟的信使 核糖核酸分子，以供翻譯合成標(biāo)計(jì)或功能性蛋白。如圖3A所示，SpRNAi內(nèi)含子的必要成分包含數(shù)個(gè)相同的核苷酸元件，其包含 5'-剪接位點(diǎn)、分支點(diǎn)模體(BrP)、多嘧啶串以及3'-剪接位點(diǎn)。此外，發(fā)夾樣核糖核酸 (shRNA-like)的前體微核糖核酸序列是在5'-剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)模體(BrP)之間插入 SpRNAi中。此部分的SpRNAi內(nèi)含子于核糖核酸剪接和加工時(shí)能形成套馬索(lariat)結(jié) 構(gòu)。此外，SpRNAi構(gòu)建體的3'端包含多個(gè)翻譯停止子密碼子區(qū)(T密碼子)，以提升內(nèi)含子 RNA剪接作用與無義介導(dǎo)降解過程的精確性。當(dāng)T密碼子顯現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)中的信使核糖核酸， 此T密碼子能傳遞活化無義介導(dǎo)降解路徑的信號，以供降解細(xì)胞中任何異常的核糖核酸積 累。然而，高度二級結(jié)構(gòu)的shRNA與前體微核糖核酸(pre-miRNA)的插入片段能分別地被 保留至Dicer剪接而形成成熟的siRNA與miRNA。再加上，為了在細(xì)胞中表達(dá)，我們利用技 術(shù)手段將SpRNAi構(gòu)建體在紅色螢光蛋白(RGFP)基因(來自珊瑚礁紫點(diǎn)?？?Heteractis crispa)的突變色蛋白)的Drall限制酶切位插入，而形成重組的SpRNAi-RGFP基因。其 中紅色螢光蛋白基因的第兩百零八個(gè)核苷酸位置被限制酶Drall作用后會產(chǎn)生AG-GN核苷 酸的斷點(diǎn)，并于斷點(diǎn)兩端產(chǎn)生三個(gè)核苷酸突出的結(jié)構(gòu)，在SpRNAi插入后上述斷點(diǎn)分別形成 5'剪接位點(diǎn)及3'剪接位點(diǎn)。因?yàn)镾pRNAi的插入破壞了功能性紅色螢光蛋白的結(jié)構(gòu)(該 破壞的結(jié)構(gòu)通過內(nèi)含子剪接可以被恢復(fù)，因此我們可以利用紅色螢光蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的 出現(xiàn)來判定內(nèi)含子的shRNA/miRNA的釋放。紅色螢光蛋白基因還能提供許多外顯子剪接增 強(qiáng)子(ESE)以提升核糖核酸的剪接作用的正確性與效率。如圖3B所示的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供使用合成核糖核酸剪接與 加工元件(例如以5'剪接位點(diǎn)、分支點(diǎn)模體、多嘧啶串以及3'受體剪接位點(diǎn))的遺傳工 程方法形成人造的SpRNAi，此人造的SpRNAi至少包含所需要的用于反義核糖核酸、shRNA 和/或miRNA生成的核糖核酸插入片段。去氧核糖核酸合成器(DNA synthesizer)可化 學(xué)制備及連接這些元件。另一方面這些元件的連接可通過限制酶和連接酶實(shí)現(xiàn)。這樣獲得 的內(nèi)含子可直接轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中或與進(jìn)一步參如到細(xì)胞基因中以通過Pol- II與轉(zhuǎn)錄物(即 pre-mRNA)共表達(dá)。在核糖核酸剪接與信使核糖核酸成熟過程中，所需要的RNA插入片段通 過細(xì)胞內(nèi)的剪接體及無義介導(dǎo)降解機(jī)制被切除并被釋放，然后引發(fā)所需要的對與所述插入 的RNA序列高度互補(bǔ)的特定基因轉(zhuǎn)錄物的基因沉默效應(yīng)；而重組基因轉(zhuǎn)錄物中的外顯子連 接在一起以形成成熟的信使核糖核酸，而表達(dá)所需要的基因功能，例如報(bào)導(dǎo)基因或以下幾 種標(biāo)計(jì)蛋白的翻譯紅色螢光蛋白(RGFP)、綠色螢光蛋白(EGFP)、螢光素酶、β半乳糖苷酶 (Iac-Z)以及它們衍生物的同源物。報(bào)導(dǎo)/標(biāo)計(jì)蛋白的存在能有效定位感染細(xì)胞中插入的 shRNA/miRNA分子產(chǎn)生的位置，有利于鑒定所需基因沉默/RNAi效果。根據(jù)本發(fā)明，由連接外顯子所形成的成熟信使核糖核酸也可能有助于傳統(tǒng)基因治 療去修補(bǔ)損害或缺失的基因功能，或提高特定基因表達(dá)。在其它方面，本發(fā)明提供一種新穎組合物和手段以誘導(dǎo)細(xì)胞通過內(nèi)含子的RNA剪接和加工機(jī)制產(chǎn)生基因沉默分子，此沉默 分子引發(fā)反義介導(dǎo)基因敲除或核糖核酸干擾效果(RNAi)，這些作用能有效抑制靶基因功 能。這樣獲得的衍生自內(nèi)含子的基因沉默分子包含反義核糖核酸、核糖酶、短暫小分子核 糖核酸(stRNA)、雙股核糖核酸(dsRNA)、小干擾核糖核酸(siRNA)、非編碼小分子核糖核 酸(tncRNA)、小發(fā)夾核糖核酸(shRNA)、微核糖核酸(microRNA，miRNA)及與核糖核酸干擾 (RNAi)有關(guān)的前體核糖核酸結(jié)構(gòu)(pri-/pre-RNA)。使用這些內(nèi)含子的核糖核酸所衍生的 基因沉默試劑是用于打靶和沉默不需要的以下基因的有效工具致病轉(zhuǎn)基因、病毒基因、突 變基因、癌基因、與疾病相關(guān)小核糖核酸基因及任何編碼和非編碼蛋白的基因。
使用Pol- II介導(dǎo)的SpRNAi-RGFP表達(dá)系統(tǒng)，我們已成功地于人類前列腺癌細(xì)胞 LNCaP、人類子宮頸癌細(xì)胞HeLa以及大鼠神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞HCN-A94-2(Lin et al. (2006a) Methods Mol Biol. 342 :295-312)產(chǎn)生具有全基因沉默效果的成熟shRNA及miRNA ；在斑 馬魚、雞以及小鼠體內(nèi)(Lin et al. (2006b)Methods Mol Biol. 342 :321_334)亦有相同 的效果。我們已于斑馬魚與許多不同人類細(xì)胞株中，靶向于綠色螢光蛋白與其它細(xì)胞基因 轉(zhuǎn)錄物和表達(dá)，測試過不同的前體微核糖核酸加入片段的構(gòu)建體，并得知較有效的基因沉 默微核糖核酸是來源于5’剪接位點(diǎn)與分支點(diǎn)模體之間的內(nèi)含子序列的靠近5’端。如圖 3C所示，顯著的基因沉默效果近發(fā)生在被抗綠色螢光蛋白的前體微核糖核酸(anti-EGFP pre-miRNA)的插入片段(泳道4)轉(zhuǎn)染中，然而在由左到右的泳道所示的其它插入片段的 組中沒有檢測到此效果1、空載體控制組(Ctl組)；2、針對愛滋病病毒蛋白(HIV-p24)的 前體微核糖核酸插入片段組(模擬組)；3、無發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的反義綠色螢光蛋白插入片段且 組(anti組)；以及5、與抗綠色螢光蛋白的前體微核糖核酸完全互補(bǔ)的反轉(zhuǎn)抗前體微核 糖核酸序列(milf組)組。對于其它非靶基因，例如標(biāo)記紅色螢光蛋白以及管家β肌動 蛋白并沒有效果，這表示這種內(nèi)含子miRNA介導(dǎo)的核糖核酸干擾(RNAi)具有高度靶專一 性。為了進(jìn)一步證實(shí)核糖核酸剪接在內(nèi)含子的核糖核酸干擾的效果，我們已測試三種不同 的SpRNAi-RGFP表達(dá)系統(tǒng)，如圖3D顯示(由左到右)1.表達(dá)無內(nèi)含子的紅色螢光蛋白的 載體(無任何前體微核糖核酸插入片段的SpRNAi-RGFP表達(dá)系統(tǒng))；2.表達(dá)具有內(nèi)含子的 抗綠色螢光蛋白前體微核糖核酸插入片段的紅色螢光蛋白的SpRNAi-RGFP表達(dá)系統(tǒng)；和 3.與2構(gòu)建體類似的但在SpRNAi中具有缺陷的5’ -剪接位點(diǎn)的SpRNAi-RGFP表達(dá)系統(tǒng)。 由Northern印跡法分析資料顯示，成熟的微核糖核酸只從SpRNAi-RGFP表達(dá)系統(tǒng)2構(gòu)建體 的剪接的內(nèi)含子中釋放出來(泳道2)，此SpRNAi-RGFP表達(dá)系統(tǒng)與圖3C的具有抗綠色螢光 蛋白前體微核糖核酸插入片段的SpRNAi構(gòu)建體(泳道4)完全相同，這表明需要靠細(xì)胞內(nèi) RNA剪接來形成內(nèi)含子的miRNA?；谏鲜隼斫?，我們進(jìn)一步確定前體微核糖核酸(pre-miRNA)插入片段的優(yōu)選 的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以誘導(dǎo)最顯著的基因沉默效應(yīng)并認(rèn)識到在RNAi效用物(核糖核酸誘導(dǎo)基因 沉默復(fù)合體(RISC))的裝配過程中細(xì)胞對成熟miRNA鏈的選擇存在很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)偏好(Lin et. al. (2005)Gene 356:32-38)。RISC是一種蛋白核糖核酸復(fù)合體，能導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄物 降解或通過核糖核酸干擾機(jī)制抑制翻譯。siRNA雙鏈體的形成在與siRNA相關(guān)的RISC的組 裝中起了關(guān)鍵的作用。siRNA雙鏈體的兩條鏈在功能上是不對稱的，而且組裝成RISC復(fù)合 體只偏好一條鏈。這種偏好是由每一條鏈5’端堿基對的熱動力穩(wěn)定所決定。基于siRNA 的模式，推測miRNA及與其互補(bǔ)的miRNAOiiiRNA*)雙鏈體的形成在與miRNA相關(guān)的RISC的組裝中是必需的步驟。假如此模式是真的話，則在pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中應(yīng)當(dāng)觀察不到 任何功能偏好。然而我們發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中，內(nèi)含子的pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的參與了用于 RISC組裝的成熟miRNA的鏈的選擇。如圖4A所示，我們構(gòu)建了含有一對對稱的pre-miRNA構(gòu)建體的兩個(gè)不同的插入了 內(nèi)含子的微核糖核酸的SpRNAi-RGFP表達(dá)載體，它們分別命名為miRNA*-莖環(huán)-miRNA[1]及 miRNA-莖環(huán)-miRNA*[2]。這兩組的前體微核糖核酸具有相同的雙鏈莖臂結(jié)構(gòu)，該莖臂結(jié)構(gòu) 針對于EGFP第280到第302的核苷酸序列。具體而言，miRNA是指全長完整的成熟微核糖 核酸序列，而miRNA*是指與成熟微核糖核酸的序列互補(bǔ)的逆向核苷酸序列。經(jīng)脂質(zhì)體將表 達(dá)這些miRNA的SpRNAi-RGFP的載體(每一個(gè)60 μ g)轉(zhuǎn)染到兩周大的斑馬魚幼胚24小時(shí) 后(Lin et al. (2005) Gene 356 :32_38)，我們使用 mirVana微核糖核酸分離管柱(Ambion， Austin,TX)分離了斑馬魚小RNAs并隨后通過含有靶序列的乳膠珠(latex beads)將所有 與靶EGFP區(qū)匹配的具有潛力的微核糖核酸(miRNA)沉淀下來。測序后，一個(gè)有效的微核 糖核酸(miR-EGFP (280-302))被鑒定為在5’ -miRNA-徑環(huán)-miRNA*-3’ [2]構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染 中具有活性，如圖4B所示的灰色陰影序列。因?yàn)槌墒斓奈⒑颂呛怂?miRNA)只有在轉(zhuǎn)染 了 5’ -miRNA-徑環(huán)-miRNA*-3，[2]構(gòu)建體的斑馬魚中被發(fā)現(xiàn)，因此與miRNA相關(guān)的RISC 可能傾向于優(yōu)先與5’ -miRNA-徑環(huán)-miRNA*-3’ [2]構(gòu)建體作用而不是與5’ -miRNA*-徑 環(huán)-miRNA-3’[l]的前體微核糖核酸，這表明對于內(nèi)含子miRNA-RISC組裝存在結(jié)構(gòu)傾向性。 在此實(shí)驗(yàn)中，利用經(jīng)由肌動蛋白啟動子驅(qū)動的斑馬魚Tg(UAS :gfp)鏈，即Tg(aCtin-GAL4 UAS-gfp))，此斑馬魚會在魚體的幾乎所有類型的細(xì)胞中組成型表達(dá)綠色螢光EGFP。如圖 4C所示，在此斑馬魚中轉(zhuǎn)染SpRNAi-RGFP載體后，將使靶EGFP沉默并共表達(dá)紅色螢光標(biāo) 記蛋白RGFP，該蛋白作為內(nèi)含子miRNA在感染的細(xì)胞中生成的陽性指示劑。胃腸部份的 基因沉默效應(yīng)較弱于其它組織，推測可能是此部位的核糖核酸酶(RNase)活性較強(qiáng)的原 故。圖 4D 中，基于 Western 印跡法，在用 5’-miRNA*-莖環(huán)-miRNA-3’ [1]或 5’-miRNA-莖 環(huán)-miRNA*-3’ [2]pre-miRNA轉(zhuǎn)染的魚中均檢測到指示劑RGFP蛋白的表達(dá)；而靶EGFP的 表達(dá)的基因沉默只存在用5’ -miRNA-莖環(huán)-miRNA*-3’ [2]構(gòu)建體中，這驗(yàn)證了圖4C的結(jié) 果。因?yàn)?5’ -miRNA*-莖環(huán)-miRNA_3，[1]及 5’ -miRNA-莖環(huán)-miRNA*-3，[2]的 5 末’端 的莖臂的熱動力穩(wěn)定力相同，因此我們推論內(nèi)含子的前體微核糖核酸的徑環(huán)參與了在RISC 組裝中成熟微核糖核酸的鏈選擇。假設(shè)已知Dicer在莖臂上的切割位點(diǎn)用于確定成熟微核 糖核酸的鏈選擇(Lee et al. (2003) Nature 425 :415_419)，則內(nèi)含子的前體微核糖核酸的 徑環(huán)可能用于確定特定切割位點(diǎn)的識別。在以上早期的設(shè)計(jì)中，因?yàn)樵S多天然的前體微核糖核酸的徑環(huán)結(jié)構(gòu)太大而不 適用于SpRNAi-RGFP表達(dá)載體的有效表達(dá)，因此采用小的tRNAmrt環(huán)(即，5’ - (A/U) UCCAAGGGGG-3，) (SEQ. ID. NO. 29)來取代天然的 pre-miRN 環(huán)。tRNAmet 環(huán)被證明能有效 促進(jìn)設(shè)計(jì)的微核糖核酸(miRNA)通過相同的Ran-GTP及出核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Exportin) -5 運(yùn)輸機(jī)制從核內(nèi)運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)中(Lin et al. (2005)Gene 356:32-38)。當(dāng)前，本發(fā) 明使用一對人工改良的 pre-mir-30 環(huán)(即 5，-GCTAAGCCAGGC-3，(SEQ. ID. NO. 1)及 5’ -GCCTGGCTTAGC-3’ (SEQ. ID. NO. 2)，它們能提供同樣有效的天然前體微核糖核酸的核 運(yùn)輸并且不干擾轉(zhuǎn)移核糖核酸的運(yùn)輸。這些新的前體微核糖核酸環(huán)的設(shè)計(jì)是基于模仿 mir-302s的小徑環(huán)的改進(jìn)，其能在胚胎干細(xì)胞中高水平表達(dá)，但在分化的組織細(xì)胞中表達(dá)程度較低。因此，用這種人造的前體微核糖核酸環(huán)并不會干擾天然的微核糖核酸在人體中 的運(yùn)輸路徑關(guān)于前體微核糖核酸的插入，因?yàn)橹亟M的SpRNAi-RGFP構(gòu)建體的內(nèi)含子插入位點(diǎn) 在其5’端及3’端分別與PvuI及MluI的限制酶切位點(diǎn)側(cè)翼鏈接，此初級內(nèi)含子的插入片段 能被各種具有匹配的粘性末端的基因?qū)Ｒ恍缘那绑w微核糖核酸插入片段取代(例如，抗綠 色螢光蛋白及mir-302的前體微核糖核酸)。通過改變針對于不同基因轉(zhuǎn)錄物的前體微核 糖核酸插入片段，這種內(nèi)含子的微核糖核酸產(chǎn)生系統(tǒng)能被應(yīng)用于在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)靶基因 沉默的一種強(qiáng)大工具。為了確認(rèn)正確的插入片段尺寸，插入pre-miRNA的SpRNAi-RGFP構(gòu) 建體(IOng)可通過采用一對寡核苷酸引物(即，5’ -CTCGAGCATG GTGAGCGGCC TGCTGAA-3， 及 5，-TCTAGAAGTT GGCCTTCTCG GGCAGGT-3’ )的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條 件是在94°C (1分鐘)、52°C (1分鐘)、及70°C (1分鐘)循環(huán)25個(gè)周期。得到的PCR產(chǎn)物 再通過2%的瓊脂糖凝膠電泳層析并然后用凝膠提出試劑盒(Qiagen，CA)提取并純化以進(jìn) 行測序確認(rèn)。本發(fā)明采用原理論證設(shè)計(jì)的Pol- II介導(dǎo)的SpRNAi-RGFP表達(dá)系統(tǒng)，并利用此系 統(tǒng)在人類和/或小鼠細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)mir-302基因家族(mir-302s)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方式中，本發(fā)明提供一種使用非天然存在的內(nèi)含子及其以下成分的方法，所述成分能被 人類或小鼠細(xì)胞加工成mir-302-類似核糖核酸分子，以誘導(dǎo)細(xì)胞中與發(fā)育或分化相關(guān)基 因的特定基因沉默效應(yīng)；所述方法包含下列步驟a)提供1) 一種表達(dá)mir-302s所靶向的 與發(fā)育或分化相關(guān)的多種基因的細(xì)胞底物；并提供2)能表達(dá)的包含能產(chǎn)生驅(qū)動內(nèi)含子的 初級RNA轉(zhuǎn)錄物的重組基因的組合物，所述的驅(qū)動內(nèi)含子的初級RNA轉(zhuǎn)錄物能通過細(xì)胞內(nèi) RNA剪接和/或加工機(jī)制從內(nèi)含子中生成人工設(shè)計(jì)的mir-302-類似核糖核酸分子，從而 在所述細(xì)胞底物中下調(diào)靶基因的表達(dá)或抑制靶基因功能；b)在所述細(xì)胞底物中靶基因的 功能是被抑制的條件下用所述組合物處理所述細(xì)胞底物。之后，所述細(xì)胞底物被轉(zhuǎn)化為表 達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志(如0ct3/4，SSEA3及SSEA4)的類胚胎干細(xì)胞。所述細(xì)胞底物能在體 外(in vitro)、體內(nèi)(in vivo)、離體(ex vivo)等情況下表達(dá)靶基因。廣義而言，內(nèi)含子 為基因中不編碼的序列，其包含閱讀框內(nèi)含子與5’端非反譯區(qū)域及3’端非反譯區(qū)域。在 某些層面，人工設(shè)計(jì)的mir-302-類似核糖核酸分子包含mir_302a、mir-302b, mir-302c或 mir-302d 序列的最靠前的 17 個(gè)核苷酸(如 5，-UAA⑶GCUUC CAUGUUU-3，(SEQ. ID. NO. 3))。 所有mir-302家族的微核糖核酸皆擁有從5’端數(shù)來相同的前17個(gè)核苷酸。或者，人工設(shè) 計(jì)的mir-302-類似核糖核酸分子也能插入到細(xì)胞基因中的內(nèi)含子的區(qū)域以與這些基因共 同表達(dá)。一般而言，內(nèi)含子插入技術(shù)的種類包含類質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染、同源基因重組、轉(zhuǎn)座 子傳遞、跳躍基因整合及反轉(zhuǎn)錄病毒感染。在另一方面，本發(fā)明的重組基因表達(dá)前體信使核糖核酸(pre-mRNA)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建 體。該重組基因主要由外顯子與內(nèi)含子兩大不同部分組成。所述外顯子部分在核糖核酸剪 接后能被連接形成功能性信使核糖核酸(mRNA)進(jìn)而轉(zhuǎn)翻譯成蛋白，以供辨認(rèn)內(nèi)含子的核 糖核酸的釋出，而所述內(nèi)含子從所述重組基因轉(zhuǎn)錄物中被剪接出來并進(jìn)一步被加工成充當(dāng) 基因剪接效用物的所需要的內(nèi)含子RNA分子，其可為反義核糖核酸、微核糖核酸(miRNA)、 小發(fā)夾核糖核酸(shRNA)、siRNA、雙股核糖核酸以及以上核糖核酸的前體(S卩，pre-miRNA 與Pi RNA)。這些所需要的內(nèi)含子的核糖核酸分子可包含發(fā)夾樣莖環(huán)結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)包含與5，-GCTAAGCCAG GC-3，(SEQ. ID. NO. 1)或是 5，-GCCTGGCTTA GC-3，(SEQ. ID. NO. 2)同源的 序列模體，該序列不僅能促進(jìn)核所需要的糖核酸分子正確地從所述內(nèi)含子中被剪接出來， 還能促進(jìn)該分子由細(xì)胞核運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)中。而且這些內(nèi)含子衍生的核糖核酸分子的莖臂包 含互補(bǔ)或同源或者既互補(bǔ)有同源于靶基因或者所述靶基因轉(zhuǎn)錄物的編碼序列的序列。所述 需要的核糖核酸分子的同源或互補(bǔ)序列的大小從約15個(gè)核苷酸堿基到約1500個(gè)核苷酸堿 基，最優(yōu)選為約18個(gè)到約27個(gè)核苷酸堿基。這些所需要的內(nèi)含子的核糖核酸分子對于靶 基因序列的互補(bǔ)或同源率為約30%到100%之間，對于所需要的小發(fā)夾樣內(nèi)含子的核糖核 酸更優(yōu)選為35%到49%之間，對于線形內(nèi)含子的核糖核酸則更優(yōu)選為90%到100%。此外，非天然存在的內(nèi)含子的5’端包含5’剪接位點(diǎn)，其中該5’剪接位點(diǎn)與以下 序列同源:5，-GTAAGAGK-3，(SEQ. ID. NO. 4)或⑶(A/G)A⑶模體(即，5，-GTAAGAGGAT-3，、 5，-GTAAGAGT-3，、5，-GTAGAGT-3，及 5，-GTAAGT-3，)；而它們的 3，端是與 GWKSCYRCAG (SEQ. ID. NO. 5)或 CT(A/G)A(C/T)NG 模體(8口，5，-GATATCCTGC AG_3，、5，-GGCTGCAG-3，和 5’-CCACAG-3’)同源的3’剪接位點(diǎn)。此外，分支點(diǎn)序列是位于5’端與3’端剪接位點(diǎn)之間，其 包含同源于 5，-TACTWAY-3，(SEQ. ID. NO. 6)模體，如，5，_TACTAAC_3，及 5，-TACTTAT_3，)。該 分支點(diǎn)序列中的腺苷酸(A)通過細(xì)胞內(nèi)(2’-5’)-寡腺苷酸合成酶及剪接體在幾乎所有的 剪接體內(nèi)含子中形成(2’-5’)_連接的套馬索的內(nèi)含子核糖核酸的一部分。此外，多嘧啶串 是位于所述分支點(diǎn)模體與3’ -剪接位點(diǎn)之間，并且與5’ -(TY)m(C/-) (T)nS(C/-)-3' (SEQ. ID. NO. 7)或5，-(TC)nNCTAG(G/-)-3，(SEQ. ID. NO. 8)同源的高含量的胸腺嘧啶與胞嘧啶的 寡核苷酸序列。其中，符號“III”與“η”是指大于或等于1的多重復(fù)序列；更優(yōu)選地，m的數(shù) 值為1-3，而η的數(shù)值為7-12。符號“_”是指無任何核苷酸。一些接頭核苷酸序列能用來 連接所有這些內(nèi)含子成分。根據(jù)37CFR1. 822指南中對用于核苷酸和/或氨基酸序列資料 的符號和格式的規(guī)定，符號W是指腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號K是指鳥嘌 呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號S是指胞嘧啶(C)或鳥嘌呤(G)，符號Y是指胞嘧 啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號R是指腺嘌呤㈧或鳥嘌呤(G)以及符號N是指 腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，重組基因組合物可被摻入到表達(dá)載體以供 基因轉(zhuǎn)染。所述表達(dá)載體選自DNA轉(zhuǎn)基因、質(zhì)粒、跳躍基因、轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)錄 病毒載體、慢病毒載體(lentiviral vectors)、腺病毒(AMV)載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載 體、改性的肝炎病毒(HBV)載體、巨細(xì)胞病毒相關(guān)(CMV)的病毒載體。在轉(zhuǎn)染SpRNAi-RGFP 構(gòu)建體過程中，能表達(dá)不同內(nèi)含子的基因沉默效應(yīng)物的多功能載體能用于實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶基因 的沉默效應(yīng)?；蛘?，多基因沉默效應(yīng)物能衍生自SpRNAi-RGFP構(gòu)建體的內(nèi)含子的發(fā)夾核糖 核酸插入片段，以提供多基因沉默效應(yīng)。此方法的優(yōu)勢是通過使用基于載體的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染 或病毒感染而穩(wěn)定傳遞，從而提供穩(wěn)定及相對長期的特定基因沉默效應(yīng)。一方面，在控制 以下核糖核酸啟動子的條件下，本發(fā)明經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)核糖核酸剪接及加工機(jī)制能產(chǎn)生核糖核 酸干擾相關(guān)的基因沉默效應(yīng)物，該基因沉默效應(yīng)物包含小干擾核糖核酸(siRNA)、微核糖核 酸(miRNA)和/或小發(fā)夾核糖核酸(shRNA)；所述啟動子選自II型核糖核酸聚合酶啟動子 (Pol- II )、III型核糖核酸聚合酶啟動子(Pol-III)及病毒啟動子。該病毒啟動子為類II型 核糖核酸聚合酶激活啟動子，并從巨細(xì)胞病毒(CMV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端區(qū)域、乙型肝炎病 毒(HBV)、腺病毒(AMV))和腺相關(guān)病毒(AAV)中分離得到。例如，慢病毒(lentiviral LTR)
15啟動子能在每個(gè)細(xì)胞內(nèi)足以提供高達(dá)5xl05拷貝的前體信使核糖核酸。此外，在所述慢病毒 啟動子的前端插入對藥物敏感的抑制子以控制其基因沉默效應(yīng)物的表達(dá)轉(zhuǎn)錄速率也是可 行的。所述抑制子能被化學(xué)藥物或抗生素抑制，這些化學(xué)藥物或抗生素選自G418、四環(huán)素、 新霉素、氨芐青霉素、卡那霉素及上述抗生素的衍生物等。本發(fā)明提供了在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)含子的核糖核酸以及在體內(nèi)通過核糖核酸剪接和 加工機(jī)制的新穎手段和方法，以產(chǎn)生成熟的siRNA、miRNA及shRNA，這些RNA可誘導(dǎo)核糖 核酸干擾相關(guān)的基因沉默效應(yīng)。取決于細(xì)胞如何表達(dá)與加工本發(fā)明內(nèi)含子前體miRNA/ shRNA插入片段的機(jī)制，所需要的siRNA、miRNA和/或shRNA可產(chǎn)生單個(gè)單位或多個(gè)單 位。例如，據(jù)報(bào)道在斑馬魚中一個(gè)抗綠色螢光蛋白的前體微核糖核酸(pre-miRNA)插入 的內(nèi)含子的異位表達(dá)，如同圖3A所示，實(shí)際上產(chǎn)生兩組不同長度的成熟微核糖核酸，如 mir-EGFP (282/300)與 mir-EGFP (280-302)，這暗示 SpRNAi 的一種基因沉默 RNA 插入物能 產(chǎn)生超過一種的基因沉默效應(yīng)物。相同或相異的基因沉默效應(yīng)物能產(chǎn)生與靶基因轉(zhuǎn)錄物互 補(bǔ)的正義或反義的構(gòu)型或者二者。在某些情況下，內(nèi)含子的基因沉默效應(yīng)物能與靶基因轉(zhuǎn) 錄物(即mRNA)雜交，以形成雙鏈核糖核酸(dsRNA)以引發(fā)二級核糖核酸干擾(RNAi)效應(yīng)。 因?yàn)閮?nèi)含子的基因沉默效應(yīng)物是由本發(fā)明的表達(dá)載體持續(xù)產(chǎn)生，這能減輕小核糖核酸在體 內(nèi)應(yīng)用時(shí)被快速降解的疑慮。此外，本發(fā)明可產(chǎn)生干細(xì)胞。本發(fā)明潛在應(yīng)用包含無飼養(yǎng)層細(xì)胞的人類胚胎干細(xì) 胞系的維持并避免上述細(xì)胞株系分化、成體干細(xì)胞系在體外復(fù)制并培養(yǎng)、純化同構(gòu)型干細(xì) 胞群及利用上述干細(xì)胞進(jìn)行移植。本發(fā)明亦可為用來研究干細(xì)胞功能及機(jī)制的工具或可供 改變干細(xì)胞性質(zhì)以致于用于特定用途的組合物和方法。在不同的實(shí)施方式中，本發(fā)明的類 胚胎干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞選自正常體細(xì)胞、癌化體細(xì)胞、哺乳類(如人類、猴子、大鼠及小 鼠)的成體干細(xì)胞衍生而得。

圖1顯示天然內(nèi)含子的微核糖核酸(miRNA)生成機(jī)制；所述內(nèi)含子的微核糖核酸 通過Pol- II與前體信使核糖核酸共同轉(zhuǎn)錄并經(jīng)RNA剪接作用從前體信使核糖核酸中切割 出來；而鏈接的外顯子成為成熟的信使核糖核酸以供蛋白質(zhì)的合成。經(jīng)剪接并具有反義或 者發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子的微核糖核酸被進(jìn)一步加工成為成熟的微核糖核酸，該成熟的 微核糖核酸能夠引發(fā)RNAi相關(guān)基因沉默效應(yīng)。因此，我們設(shè)計(jì)了至少包含前體微核糖核酸 結(jié)構(gòu)(或稱SpRNAi)、并能模擬天然內(nèi)含子的微核糖核酸的生物合成(圖3A及圖3B)的人 造內(nèi)含子。SpRNAi被摻入到細(xì)胞或重組基因中；在Pol- II啟動子或病毒啟動子(P)調(diào)控 下，其通過Pol- II RNA聚合酶表達(dá)。在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成后，這樣產(chǎn)生的基因轉(zhuǎn)錄物在感染 細(xì)胞中通過RNA剪接和加工，然后釋放預(yù)先設(shè)計(jì)的內(nèi)含子的核糖核酸分子。在某些情況下， 所需要的核糖核酸分子為反義核糖核酸構(gòu)建體，該反義結(jié)構(gòu)可用作反義寡核苷酸探針用于 基因敲除。在其它情況下，所需要的核糖核酸分子包含小反義核糖核酸及正義核糖核酸片 段以形成雙鏈siRNA以誘導(dǎo)RNAi。在一些其它情況下，所需要的核糖核酸分子為能夠?qū)е?RNAi相關(guān)基因沉默效應(yīng)的發(fā)夾樣核糖核酸構(gòu)建體。參照特定的附圖僅用于說 明的目的，而不是用于限制的目的；說明如下圖1顯示細(xì)胞內(nèi)天然內(nèi)含子的微核糖核酸(miRNA)生成機(jī)制。
圖2顯示SiRNA、外顯子(基因之間)的微核糖核酸及內(nèi)含子的微核糖核酸的不同 生成機(jī)制路徑。圖3A到3D顯示本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式的在表達(dá)載體組合物中SpRNAi-RGFP重組 基因構(gòu)建體(A)和使用這種組合物產(chǎn)生能模仿天然內(nèi)含子的微核糖核酸生物合成的人造 微核糖核酸的策略(B)。針對于綠色EGFP的SpRNAi-RGFP表達(dá)組合物在魚中的體內(nèi)測試顯 示，通過蛋白質(zhì)印跡分析確定專一于靶向綠色螢光蛋白基因表達(dá)的基因敲低效果超過85% (C)。通過甲醛瓊脂糖凝膠電泳及RNA印跡分析后可以觀察到內(nèi)含子衍生的抗綠色螢光 蛋白的微核糖核酸及其剪接前體(D)。圖4A到4C顯示SpRNAi-RGFP構(gòu)建體中的不同設(shè)計(jì)的內(nèi)含子的核糖核酸插入片段 的效用評價(jià)。有效的miRNA生物合成，及觀察到它在兩周大的斑馬魚幼魚中針對靶向的綠 色螢光蛋白導(dǎo)致基因沉默效應(yīng)，證實(shí)了核糖核酸誘導(dǎo)沉默復(fù)合體組裝中對在5’-miRNA*_徑 環(huán)-miRNA-3’ [1]與5’-miRNA-徑環(huán)-miRNA*-3’ [2]的發(fā)夾核糖核酸結(jié)構(gòu)分別具有不對稱 的偏好(A)。綠色螢光蛋白的基因沉默只在轉(zhuǎn)染前體微核糖核酸結(jié)構(gòu)[2]中發(fā)現(xiàn)，而不是在 轉(zhuǎn)染結(jié)構(gòu)[1]中被發(fā)現(xiàn)。因綠色螢光蛋白與紅色螢光蛋白的顏色重迭后會呈現(xiàn)紅色大于綠 色(如圖所顯現(xiàn)的深橘色)，因此靶綠色螢光蛋白的表達(dá)量在前體微核糖核酸結(jié)構(gòu)[2]轉(zhuǎn)染 組中降低，而載體的指示物紅色螢光蛋白則在所有載體轉(zhuǎn)染組中等量表達(dá)(B)。用蛋白質(zhì)印 跡分析綠色螢光蛋白的量，證實(shí)在轉(zhuǎn)染前體微核糖核酸結(jié)構(gòu)組[2]中具有明顯的基因沉默 效應(yīng)(C)。在用其它物質(zhì)，例如僅用脂質(zhì)體(Lipo)、無任何插入片段的空載體(Vctr)以及 siRNA(siR)組處理的魚中沒有觀察到任何基因沉默效應(yīng)。圖5A到5C顯示在mir-302-類似的核糖核酸分子在人類原代表皮細(xì)胞(hpESC)、 人類前列腺癌細(xì)胞株(PC3)及人類原發(fā)性黑色素瘤細(xì)胞株(primary melanoma culture) (Colo)中轉(zhuǎn)基因表達(dá)后細(xì)胞型態(tài)及細(xì)胞增殖的改變。在mir-302轉(zhuǎn)染后，表達(dá)mir-302的 細(xì)胞分別稱為 hpESC+mir-302、PC3+mir-302 及 Colo+mir-302。圖 6A 到 6E 顯示具有轉(zhuǎn)染 mir-302 表達(dá)(例如，Colo+mir-302 及 PC3+mir_302)的 Colo及PC3的細(xì)胞株的胚胎干細(xì)胞特性，這些特性包含形成胚樣體，如圖6A所示；0ct3/4、 SSEA-3及SSEA-4標(biāo)記表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析，如圖6B ；基因組的去甲基化分析，如圖6C ； CpG去甲基化分析，如圖6D ；及細(xì)胞遷移，如圖6E。圖7A到7B顯示微核糖核酸微陣列分析的結(jié)果，證實(shí)mir-302家族成員在轉(zhuǎn)染的 Colo細(xì)胞(Colo+mir-302)中全部高水平表達(dá)。圖8A到8B顯示在具有轉(zhuǎn)基因mir-302表達(dá)的Colo細(xì)胞(Colo+mir-302)中改變 的基因表達(dá)的基因微陣列的分析結(jié)果(Affymetrix human GeneChip U133A&B，CA)，結(jié)果顯 示，有許多胚胎標(biāo)志基因的表達(dá)水平明顯升高，而癌癥標(biāo)記及發(fā)育信號基因的表達(dá)則顯著 下降，這與人類胚胎干細(xì)胞HuECS及H9細(xì)胞的基因表達(dá)模式相似。圖9A到9C顯示表達(dá)轉(zhuǎn)基因mir_302Colo細(xì)胞(Colo+mir-302)在用不同的發(fā)育 信號物質(zhì)(如，荷爾蒙或生長因子)能分化為各種細(xì)胞類型，這些細(xì)胞類型類似于衍生自外 胚層、中胚層、內(nèi)胚層及生殖細(xì)胞的組織細(xì)胞，這證實(shí)其具有與胚胎干細(xì)胞的多潛能性相似 的多潛能性。
具體實(shí)施方式盡管下文參照附圖描述了本發(fā)明特定的實(shí)施方式，但應(yīng)當(dāng)理解為這些實(shí)施方式僅 作為實(shí)施例并僅僅說明少量的多種可能的具體實(shí)施方式
，它們代表本申請?jiān)淼膽?yīng)用。各 種改變和修飾對于本發(fā)明所述領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，并屬于本發(fā)明的宗旨、 范圍和打算，這些進(jìn)一步由所附權(quán)利要求所限定。本發(fā)明提供了一種新組合物及方法，該方法通過使用內(nèi)含子衍生的核糖核酸使真 核細(xì)胞遺傳特性改變。不局限于任何特定的理論，這種遺傳特性改變是通過新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含 子驅(qū)動的基因沉默機(jī)制而產(chǎn)生，此機(jī)制是通過將至少包含能進(jìn)行RNA剪接的內(nèi)含子(命 名為SpRNAi)的重組基因轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞或有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)的。SpRNAi還攜帶內(nèi) 含子的核 糖核酸插入片段，該插入片段通過細(xì)胞內(nèi)核糖核酸的剪接與加工機(jī)制而被釋出來，并然后 對靶基因轉(zhuǎn)錄物引發(fā)RNAi/轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)相關(guān)的基因的沉默效應(yīng)，所述靶基因 轉(zhuǎn)錄物與所述內(nèi)含子的核糖核酸的插入片段高度互補(bǔ)。一般來說，如圖4及圖5所示，當(dāng) 重組基因利用化學(xué)方式或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或病毒感染進(jìn)入真核細(xì)胞時(shí)，該內(nèi)含子的核糖核酸 的插入片段經(jīng)由Pol- II與所述重組基因共轉(zhuǎn)錄，并然后通過核糖核酸的剪接與加工的機(jī) 制如剪接體、外來體與無義介導(dǎo)降解系統(tǒng)(NMD)等作用后而釋出。在核糖核酸的剪接期 間，內(nèi)含子的核糖核酸形成套馬索核糖核酸并進(jìn)一步加工成基因沉默效應(yīng)物，如短暫小分 子核糖核酸(stRNA))、反義核糖核酸、小干擾核糖核酸、小發(fā)夾核糖核酸(shRNA)、微核糖 核酸(miRNA)、Piwi相互作用的核糖核酸(piRNA)及這些核糖核酸的前體。因此，這些基 因沉默效應(yīng)物將經(jīng)由RNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默復(fù)合物(RISC)及RNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默引發(fā)劑 (RNAi-induced initiator of transcriptional silencing(RITS))的功能組裝作用而降 解它們的標(biāo)的靶基因轉(zhuǎn)錄物或抑制靶蛋白翻譯。為了模仿天然的前體信使核糖核酸(pre-mRNA)剪接及加工機(jī)制，我們使用細(xì)胞 內(nèi)剪接體、外來體與NMD系統(tǒng)來催化內(nèi)含子移除并加工我們構(gòu)建的SpRNAi-RGFP表達(dá)系統(tǒng)。 經(jīng)由一連串細(xì)胞內(nèi)剪接體組成物對SpRNAi的幾個(gè)snRNP辨識元件(如snRNPs、Ul、U2及 U4/U6. U5tri-snRNP的結(jié)合位點(diǎn))組裝后，SpRNAi被釋出以進(jìn)一步加工成基因沉默效應(yīng)物。 將合成的snRNP辨識元件摻入SpRNAi中并隨后將該SpRNAi摻入本發(fā)明的重組的RGFP構(gòu) 建體表達(dá)系統(tǒng)的方法將分別于實(shí)施例1及二 2中描述。設(shè)i十、建構(gòu)及i平估能誘導(dǎo)內(nèi)含子介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)的Pol-II介導(dǎo)白勺 重組的SpRNAi-RGFP基因表達(dá)系統(tǒng)用于在體內(nèi)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)核糖核酸剪接與加工導(dǎo)致基因沉默效應(yīng)機(jī)制的策略已經(jīng) 被測試，本發(fā)明使用含有人工剪接內(nèi)含子(SpRNAi)的Pol- II轉(zhuǎn)錄的重組基因載體(稱為 SpRNAi-RGFP)以表達(dá)內(nèi)含子的基因沉默效應(yīng)物(如圖3A與3B)，所述基因沉默效應(yīng)物如 miRNA與發(fā)夾樣shRNA。將SpRNAi通過順序鏈接幾段合成的DNA序列基因工程地?fù)饺爰t移螢 光蛋白基因(RGFP)中，如實(shí)施例1及實(shí)施例2所述。SpRNAi包含前體miRNA或shRNA插入片 段，這些插入片段可以通過細(xì)胞核糖核酸的剪接與加工的機(jī)制(例如剪接體，外來體和NMD系 統(tǒng)組成)被釋放，然后通過產(chǎn)生成熟的miRNA或shRNA基因沉默效應(yīng)物引發(fā)內(nèi)含子RNA介導(dǎo) 的基因沉默機(jī)制。盡管在本文中我們顯示了通過內(nèi)含子RNA剪接和加工重組基因轉(zhuǎn)錄物或構(gòu) 建體誘導(dǎo)靶基因沉默的模型，然而同樣的原理還可以用于設(shè)計(jì)和產(chǎn)生通過RNA加工核糖體前 體核糖核酸(pre-rRNA)發(fā)揮功能的基因沉默效用物，該基因沉默效用物主要通過I型核糖核酸聚合酶(Pol-I)轉(zhuǎn)錄。此外能用來攜帶和產(chǎn)生SpRNAi的核糖核酸轉(zhuǎn)錄物包含不均一核核 糖核酸(hnRNA)、核糖體核糖核酸(rRNA)、轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)、小核仁核糖核酸(snoRNA)、 小核核糖核酸(snRNA)、病毒核糖核酸以及上述核糖核酸的衍生物及前體。如實(shí)施例1與2及圖3A所示，SpRNAi被合成被被摻入無內(nèi)含子-紅移螢光蛋白 (RGFP或rGFP)基因，該基因來自紫點(diǎn)?？?Heteractis crispa)的HcRedl突變的色蛋白。 因?yàn)镾pRNAi的破壞了造成紅色螢光蛋白有功能的熒光蛋白的結(jié)構(gòu)，我們通過在成功轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞或者有機(jī)體在570nm波長處重新出現(xiàn)紅色熒光發(fā)射能夠檢測內(nèi)含子的去除和RGF基 因轉(zhuǎn)錄物的信使核糖核酸(mRNA)的成熟。重組的SpRNAi-RGFP構(gòu)建體的構(gòu)建是基于前體信 使核糖核酸(pre-mRNA)中剪接體內(nèi)含子的天然結(jié)構(gòu)。SpRNAi的主要組成包含數(shù)個(gè)snRNP 辨識位點(diǎn)及接頭，如用于精確切割的在末端的5’ -剪接位點(diǎn)和3’ -剪接位點(diǎn)、用于剪接識 別的分支點(diǎn)模體(BrP)、用于與剪接體相互作用的多嘧啶串((PPT))、用于連接每一個(gè)所述 組分的接頭，以及一些用于所需內(nèi)含子插入片段的限制酶切位點(diǎn)。如圖3B所示，本發(fā)明的 SpRNAi在結(jié)構(gòu)上從5’端到3’端包含5’-剪接位點(diǎn)、抗-(靶基因)內(nèi)含子的插入片段(可 被剪接和加工后而形成基因沉默效應(yīng)物)、分支點(diǎn)模體(BrP)、多嘧啶串(PPT)及用于功能 性剪接體組織的3’ -剪接位點(diǎn)。此外，一些翻譯終止密碼子(T codon))位于靠近SpRNAi 的3’ -剪接位點(diǎn)的接頭序列中。一般來說，5 ’ -剪接位點(diǎn)是包含或同源于5 ’ -GTAAGAGK-3，(SEQ. ID. NO. 4) 或是 GU(A/G)AGU 模體(例如，5，-GTAAGAGGAT-3，、5，-GTAAGAGT-3，、5，-GTAGAGT-3， 及5’ -GTAAGT-3’)核苷酸序列；而3’ -剪接位點(diǎn)是包含或同源于GWKSCYRCAG (SEQ. ID. NO. 5)或 CT(A/G)A(C/T)NG 模體(例如，5，-GATATCCTGCAG-3，、5，-GGCTGCAG-3，及 5’ -CCACAG-3’)。此外，分支點(diǎn)序列是位于5’ -與3’ -剪接位點(diǎn)之間，該分支點(diǎn)序列包含或 同源于 5，-TACTffAY-3' (SEQ. ID. NO. 6)模體(例如，5，-TACTAAC-3，及 5，-TACTTAT-3，)。 該分支點(diǎn)序列的腺苷酸(A)通過細(xì)胞內(nèi)2’-5’寡腺苷酸合成酶及剪接體在幾乎所有的剪接 體內(nèi)含子中形成(2’ _5’)_連接的套馬索內(nèi)含子核糖核酸的一部分。此外，多嘧啶串位于 所述分支點(diǎn)與3’-剪接位點(diǎn)之間，其是與5'-(TY)m(C/-) (T)nS(C/-)-3' (SEQ. ID. NO. 7)與 5，-(TC)nNCTAG(G/-)-3' (SEQ. ID. NO. 8)同源的高含量的胸腺嘧啶(T)與胞嘧啶(C)的寡 核苷酸序列。符號“III”與“η”是指大于或等于1的多重復(fù)序列；更優(yōu)選地，m的數(shù)值是1_3， 而η的數(shù)值是7-12。符號“_”是指無任何核苷酸。所有這些內(nèi)含子的組成是通過一些接 頭核苷酸來連接的。根據(jù)37CFR1. 822指南中對用于核苷酸和/或氨基酸序列資料的符號 和格式的規(guī)定，符號W是指腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T))尿嘧啶(U)，符號K是指鳥嘌呤(G) 或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號S是指胞嘧啶(C)或鳥嘌呤(G)，符號Y是指胞嘧啶(C) 或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號R是指腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)以及符號N是指腺嘌呤 (Α)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。對于所有上述剪接體辨識組成， 脫氧胸苷⑴核苷酸/可由尿苷(U)取代。為了確定剪接后的SpRNAi的插入片段的功能。許多寡核苷酸序列可以被克隆到 重組SpRNAi-RGFP構(gòu)建體的抗-(靶基因)內(nèi)含子插入片段位點(diǎn)。這些抗_(靶基因)內(nèi) 含子插入片段位點(diǎn)包含數(shù)種限制酶切位和克隆位點(diǎn)，它們被以下限制酶識別AatII、ACCI、 AflII/ΙΙΙ、Agel、Apal/LI、Asel、Asp718I、BamHI, Bbel、BclI/II、Bglll、BsmI, Bspl20I、 BspHI/LUllI/1201、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/Ul/XI、Clal、Csp6I、DpnI, Dral/II、EagI、Ecll36II、EcoRI/RII/47III、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/ II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、 NruI、Nsi I、PmlI、PpulOI、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、 SspI,StuI,TaiI,TaqI,XbaI,XhoI,XmaI內(nèi)切酶以及它們的組合。這些內(nèi)含子的寡核苷酸插 入片段是DNA模板，此模板可供錄成具有相當(dāng)多的二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄分子，上述分子選自套 馬索型核糖核酸、短暫小分子核糖核酸(stRNA)、反義核糖核酸、小干擾核糖核酸(siRNA)、 雙鏈核糖核酸(dsRNA)、小發(fā)夾核糖核酸(ShRNA)、微核糖核酸(miRNA) ,Piwi相互作用的核 糖核酸(PiRNA)、核酶及這些核糖核酸的前體或衍生物，它們可為正義或反義的構(gòu)型或具有 正義和反義的構(gòu)型，以及上述核糖核酸的組合。
為了在感興趣的細(xì)胞或有機(jī)體中方便地傳送基因和活化，本發(fā)明的重組 SpRNAi-RGFP構(gòu)建體優(yōu)選被摻入以下表達(dá)載體中，該表達(dá)載體可選自DNA轉(zhuǎn)基因、質(zhì)粒、轉(zhuǎn) 座子、跳躍基因、病毒載體及它們的組合。這樣獲得的載體通過以下高效的基因傳遞方法 被導(dǎo)入細(xì)胞或有機(jī)體中，所述的基因傳遞方法選自化學(xué)/脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、轉(zhuǎn)座子 介導(dǎo)的DNA重組法、跳躍基因插入法、病毒感染法、微注射法、基因槍穿透法以及以上方法 的組合。所述載體進(jìn)一步至少包含病毒、Pol- II或Pol-III的啟動子，或它們的組合以表達(dá) SpRNAi-RGFP構(gòu)建體。再者，上述載體可包含科扎克(Kozak)共有(consensus)翻譯起始位 點(diǎn)以增加在真核細(xì)胞中的翻譯效率、SpRNAi-RGFP構(gòu)建體下游的多重SV40的多腺苷酸化作 用信號以加工重組基因轉(zhuǎn)錄物的’端、pUC復(fù)制起始子以用于原核細(xì)胞中的增殖、至少兩個(gè) 限制酶切位點(diǎn)以用于SpRNAi-RGFP構(gòu)建體摻入載體、選擇性的SV40復(fù)制起始子以用于表達(dá) SV40 T抗原的哺乳細(xì)胞中的復(fù)制、及選擇性SV40的早期啟動子以用于在能復(fù)制的原核細(xì) 胞中表達(dá)抗生素的抗性基因?？股乜顾幮曰虻谋磉_(dá)可用來篩選是否順利轉(zhuǎn)染或感染克 隆的選擇性標(biāo)記。上述抗生素抗性基因可對抗選自以下的抗生素青霉素G、氨芐青霉素、 新霉素、巴龍霉素(paromycin)、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、斯派克霉素(spectromycin)、 磷霉素、四環(huán)素、利福平、兩性霉素B、健他霉素(gentamycin)、氯霉素、頭孢霉素、泰樂菌素 (tylosin)以及它們的組合。這樣獲得的SpRNAi-RGFP載體已經(jīng)在(Tg(actin_GAL4 :UAS_gfp))株的斑馬魚體 內(nèi)測試過，證實(shí)可抑制綠色螢光蛋白基因表達(dá)。如實(shí)施例3及6與圖3C所示，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 在SpRNAi-RGFP質(zhì)粒的抗綠色螢光蛋白(anti-EGFP)的前體微核糖核酸插入片段(第四 泳道)顯示出很顯著的綠色螢光蛋白的基因沉默效應(yīng)(大于80%的蛋白被敲低)，然而在 由左到右的泳道所示的其它插入片段的實(shí)驗(yàn)組中并無任何沉默效應(yīng)被檢測到1、空白載體 對照組(Ctl組)；2、針對愛滋病病毒蛋白p-24(HIV-p24)的前體微核糖核酸(pre-miRNA) 組(模擬組)。3、無發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的反義綠色螢光蛋白插入片段(anti)組以及5、與抗綠色 螢光蛋白的前體微核糖核酸(anti-EGFP pre-miRNA)完全互補(bǔ)的反轉(zhuǎn)前體微核糖核酸序列 組(miR*組)。對于非靶基因，如標(biāo)記紅色螢光蛋白及管家肌動蛋白，并沒有發(fā)現(xiàn)這種沉默 效應(yīng)，這表示這種內(nèi)含子的微核糖核酸介導(dǎo)的核糖核酸干擾效應(yīng)(RNAi))具有高度靶專一 性。此外，如圖3D所示，通過印跡法分析，我們觀察到有效用的小的內(nèi)含子的核糖核酸只從 設(shè)計(jì)的SpRNAi-RGFP基因轉(zhuǎn)錄物生成和釋放(中間第2列)，在不從不具有內(nèi)含子的RGFP 的天然轉(zhuǎn)錄物中(左邊第1列)或缺乏功能性5’-剪接位點(diǎn)的缺陷SpRNAi-RGFP構(gòu)建體中 生成和釋放。此時(shí)剪接的紅色螢光蛋白的外顯子可被連接起來形成成熟核糖核酸以進(jìn)行合成具有功能的紅色螢光蛋白。有效的內(nèi)含子的微核糖核酸(miRNA)設(shè)計(jì)的最佳化先前實(shí)驗(yàn)建立內(nèi)含子的微核糖核酸(miRNA)能提供一種在體內(nèi)沉默靶基因表達(dá) 的有效手段與方法。我們首先評估了內(nèi)含子的微核糖核酸介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)的效率并然 后確定了能夠誘導(dǎo)最佳基因沉默效果的的內(nèi)含子的前體微核糖核酸插入片段的最佳結(jié)構(gòu) 設(shè)計(jì)。根據(jù)研究，我們得知在細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸沉默(RNAi)相關(guān)基因沉默效應(yīng)機(jī)制(RISC) 對于成熟的微核糖核酸的特定一股具有結(jié)構(gòu)上的偏好。RISC為蛋白-核糖核酸復(fù)合體，此 復(fù)合體經(jīng)由RNAi機(jī)制或轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(PTGS)影響靶基因轉(zhuǎn)錄物的降解或靶基因轉(zhuǎn) 錄物的翻譯抑制。在斑馬魚中，我們發(fā)現(xiàn)前體微核糖核酸的徑環(huán)結(jié)構(gòu)定了用于RISC組裝的成熟微 核糖核酸序列，所述RISC組裝不同于公知的siRNA-相關(guān)的RISC組裝(Lin et. al. (2005) Gene 356:32-38)。siRNA雙鏈體的形成在siRNA-相關(guān)的RISC組裝中扮演重要的角色。 siRNA的兩條鏈的功能并不相同，只有一條鏈會被優(yōu)選組裝到RISC復(fù)合體中。此偏好現(xiàn)象 是由于siRNA雙鏈體5’端的堿基對的熱動力穩(wěn)定性所決定。基于這種siRNA模式，miRNA 及其互補(bǔ)的miRNA (又稱miRNA*)雙鏈體的形成被認(rèn)為是miRNA-相關(guān)RISC組裝的關(guān)鍵性 的一步。假如此模式是正確的話，則在前體微核糖核酸的徑環(huán)結(jié)構(gòu)中應(yīng)當(dāng)觀察不到任何功 能偏好。然而，我們發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子pre-miRNA的徑環(huán)結(jié)構(gòu)參與了用于RISC組裝的成熟 miRNA的鏈的選擇。如實(shí)施例1與2所述，我們構(gòu)建了表達(dá)anti-EGFP miRNA的SpRNAi-RGFP載體以 及miRNA-徑環(huán)-miRNA*[l]以及miRNA*-徑環(huán)_miRNA[2]這兩個(gè)不同的前體微核糖核酸， 它們通過DNA合成器合成后，分別插入預(yù)先準(zhǔn)備好的重組SpRNAi-RGFP載體中。這兩組的 前體微核糖核酸構(gòu)建體包含相同的雙鏈徑環(huán)區(qū)域，該徑環(huán)區(qū)域針對于EGFP基因第280到第 302的核苷酸序列。因?yàn)镾pRNAi-RGFP構(gòu)建體的內(nèi)含子插入片段在其5’端及3’端分別與 PvuI及MluI限制酶切位點(diǎn)側(cè)翼連接。初級插入片段能輕易地去除并被許多具有粘性末端 的其它抗不同基因的插入片段(例如，anti-EGFP, mir-302前體微核糖核酸)取代。通過 允許針對于不同基因轉(zhuǎn)錄物的SpRNAi的插入片段中的改變，此內(nèi)含子的微核糖核酸表達(dá) 系統(tǒng)能提供在體內(nèi)的發(fā)育微核糖核酸遺傳應(yīng)用的重要工具。為了確定設(shè)計(jì)的前體微核糖核酸結(jié)構(gòu)上的偏好性，我們先通過mirVana微 核糖核酸分離管過濾柱(Ambion，Austin, TX)分離斑馬魚小RNA后，再通過乳膠珠將 與靶EGFP互補(bǔ)的所有具有潛力的微核糖核酸序列沉淀下來。一條全長微核糖核酸， miR-EGFP (280-302)，在5’ -miRNA-徑環(huán)-miRNA*-3’ [2]構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染中被證實(shí)具有活性， 如圖4A及圖4B (灰色陰影序列)所示。因?yàn)榇顺墒煳⒑颂呛怂嶂挥性谵D(zhuǎn)染5’-miRNA-徑 環(huán)-miRNA*-3’ [2]的斑馬魚中被檢測有效，因此推測miRNA-相關(guān)的RISC傾向于優(yōu)選與 5’-1^1 嫩-徑環(huán)-1^1 ^*-3’ [2]構(gòu)建體反應(yīng)，而不是優(yōu)選與[1]pre-miRNA構(gòu)建體反應(yīng)。如 圖4C所示，利用Tg(aCtin-GAL4 :UAS_gfp)株斑馬魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以展現(xiàn)視覺上靶基因沉默 與miRNA表達(dá)的關(guān)系，所述斑馬魚通過位于斑馬魚中幾乎所有細(xì)胞中的通用的β肌動蛋 白啟動子驅(qū)動組成型表達(dá)綠色螢光蛋白(EGFP)。所述斑馬魚轉(zhuǎn)染抗EGFP SpRNAi-RGFP基 因載體并共表達(dá)紅色螢光蛋白(RGFP)，該紅色螢光蛋白可作為微核糖核酸在感染細(xì)胞中生 成的陽性標(biāo)記的指示劑。在用FuGene陽離子脂質(zhì)體試劑(FuGene cationic liposomal
21reagent) (Roche, In)包封的SpRNAi-RGFP載體進(jìn)入斑馬魚胚胎后，發(fā)現(xiàn)所有測試載體在轉(zhuǎn) 染24小時(shí)內(nèi)完全進(jìn)入斑馬魚中，提供了除了骨胳及魚鱗部分以外其它所有系統(tǒng)的載體傳 遞。 該紅色螢光蛋白標(biāo)記在所有被轉(zhuǎn)染載體的斑馬魚中都能檢測到，然而靶綠色螢 光蛋白(EGFP)的沉默效應(yīng)只在被轉(zhuǎn)染5’-miRNA-徑環(huán)-miRNA*-3’ [2]的前體微核糖核 酸的斑馬魚中被觀察到。如圖4D所示，蛋白質(zhì)印跡分析法定量地確認(rèn)基因沉默的結(jié)果， 在[2]構(gòu)建體所轉(zhuǎn)染的斑馬魚有大于85%的基因被抑制。然而在腸道(GI)中的基因抑 制效應(yīng)低于其它組織中的，此現(xiàn)象可能與腸道中較高RNase活性有關(guān)。因?yàn)橄嗤?’端 的熱穩(wěn)定性被施于EGFP pre-miRNA徑環(huán)，因此推測此前體微核糖核酸的徑環(huán)結(jié)構(gòu)是與用 于具有功能的RISC組裝的熟微核糖核酸的鏈選擇有關(guān)。而岱塞爾(Dicer)在徑環(huán)結(jié)構(gòu)的 切割位點(diǎn)已知可決定成熟微核糖核酸的鏈選擇，因而前體微核糖核酸的徑環(huán)結(jié)構(gòu)可能扮 演確定辨識特殊切割位點(diǎn)的角色。因此基于不同天然微核糖核酸的天然徑環(huán)結(jié)構(gòu)的多樣 性，本發(fā)明使用一組改良的 pre-mir-302 環(huán)(如 5，-GCTAAGCCAGGC-3，(SEQ. ID. NO. 1)及 5，-GCCTGGCTTAGC-3，(SEQ. ID. NO. 2))這些環(huán)被測試提供了用于本發(fā)明的最佳的RISC裝配 效果。SpRNAi-RGFP介導(dǎo)的Mir-302在人類原代表龍細(xì)朐(hpESC)、人類前歹U腺癌細(xì)朐 PC3(PC3)與人類原發(fā)件黑盧,素瘤細(xì)胞,Colo (Colo)細(xì)胞,的轉(zhuǎn)染作用基于上述研究，我們設(shè)計(jì)和測試了具有人工連接的mir-302a-mir-302b-mir-3 02c-mir-302d的前體微核糖核酸子簇插入片段或重新設(shè)計(jì)的mir-302前體微核糖核酸 插入片段(如發(fā)夾樣序列，其包含 5，-UAAGUGCUUC CAU⑶UUUAG UGU-3，(SEQ. ID. NO. 9)) 的最佳SpRNAi-RGFP構(gòu)建體在hpESC、PC3及Colo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染沉默與發(fā)育及分化相關(guān)的 基因。mir-302a、mir_302b、mir_302c 及 mir_302d 的成熟序列分別為 5，-UAA⑶GCUUC CAUGUUUUGG UGA-3' (SEQ. ID.NO. 10),5' -UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UAG-3' (SEQ. ID.NO. 11),5' -UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG-3，(SEQ.ID. NO. 12)及 5，-UAAGUGCUUC CAUGUUUGAG UGU-3，(SEQ. ID. NO. 13)。這些mir-302的同源物的前十七個(gè)核苷酸具有高 度保守的5’端區(qū)域(100%同源)，這十七個(gè)核苷酸與5’ -UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’ (SEQ. ID. NO. 3)的序列相同。在這些mir-302同源序列中，胸腺嘧啶(T)能用來取代尿嘧啶(U)。在這些實(shí)驗(yàn)中，mir-302a-mir-302b-mir-302c-mir-302d的前體微核糖核酸簇被 轉(zhuǎn)染到hpESC及PC3細(xì)胞中，而重新設(shè)計(jì)的mir-302同源序列(SEQ. ID. NO. 9)則被轉(zhuǎn)染到 Colo細(xì)胞中。在mir-302轉(zhuǎn)染后，所有的細(xì)胞株的型態(tài)(下部圖面))發(fā)生改變，從紡錘狀 或變形蟲狀改變成較圓的外型，顯示這些細(xì)胞可能喪失細(xì)胞遷移的能力且其細(xì)胞復(fù)制速率 很低，此時(shí)如同干細(xì)胞復(fù)制速率(圖5A至圖5C)。流式細(xì)胞儀(上部圖面)分析的細(xì)胞DNA 含量(Y軸)對應(yīng)不同細(xì)胞周期(X軸)所顯示有絲分裂的細(xì)胞數(shù)量減少超過67%，證實(shí)這 些mir-302轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞增殖速率變慢，而上述細(xì)胞數(shù)量是由每一個(gè)細(xì)胞周期的DNA含 量所決定。第一峰(左)與第二峰(右)分別顯示為靜止期G0/G1與有絲分裂M期的細(xì) 胞數(shù)量與整體細(xì)胞數(shù)量的比值。在mir-302轉(zhuǎn)染后，hpESC細(xì)胞中有絲分裂的細(xì)胞數(shù)量從 36. 降低至10. 9% ；PC3細(xì)胞中有絲分裂的細(xì)胞數(shù)量從38. 4%降低至12. 6% ；Colo細(xì)胞 中有絲分裂的細(xì)胞數(shù)量從36. 5%降低至11.5%。然而，當(dāng)轉(zhuǎn)染空的SpRNAi-RGFP載體或含 有mir-gfp前體微核糖核酸插入片段的載體時(shí)，細(xì)胞形態(tài)或細(xì)胞增殖皆無明顯改變。上述mir-gfp前體微核糖核酸是設(shè)計(jì)為靶向螢火蟲的綠色螢光蛋白基因的，該基因與人類或小 鼠的基因序列并無任何同源?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，mir-302同源物的基因轉(zhuǎn)表達(dá)能將人類初胚細(xì) 胞及癌化細(xì)胞轉(zhuǎn)型為更類似胚胎干細(xì)胞的型態(tài)及復(fù)制速率的細(xì)胞，如同在先前報(bào)道的iPS 細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的改變(Okita et al.，(2007) Nature 448 :313_317 ；Wernig et al.，(2007) Nature 448 318-324)。胚樣體形成、胚胎干細(xì)胞j示記,表汰、某因鉬DNA去甲某化及H有轉(zhuǎn)某因mir-302表 汰的Colo(Colo+mir-302)及PC3 (PC3+mir_302)細(xì)胞中細(xì)胞遷移減低的評估為了進(jìn)一步證實(shí)mir-302轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的類胚胎干細(xì)胞性質(zhì)，本發(fā)明評估了胚樣體 形成、胚胎干細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)、基因組去甲基化及細(xì)胞遷移的降低。mir-302轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 有著很高的細(xì)胞培養(yǎng)匯合率(> 80% -90% )并傾向于形成胚樣體的緊密的細(xì)胞群落，如 同由原生人類胚胎干細(xì)胞所衍生的胚樣體(如圖6A)。然而，如果缺乏荷爾蒙或生長因子的 適當(dāng)導(dǎo)引，這些胚樣體樣的小體在再次培養(yǎng)時(shí)將相互分散并分化成類神經(jīng)元原始細(xì)胞(如 右下圖)。為了證實(shí)胚胎干細(xì)胞及胚樣體細(xì)胞的遺傳特性，進(jìn)一步評估這些胚胎干細(xì)胞的標(biāo) 記表達(dá)。如圖6B所示，mir-302轉(zhuǎn)染的Colo細(xì)胞(Colo+mir-302)顯著表現(xiàn)出所有類的胚 胎干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)記，如0ct3/4、SSEA-3、SSEA-4及Sox2等，然而在對照的Colo細(xì)胞中或 轉(zhuǎn)染空SpRNAi-RGFP載體的Colo細(xì)胞(colo+載體)中、轉(zhuǎn)染表達(dá)mir-gfp微核糖核酸的 載體的Colo細(xì)胞(Colo+mir-gfp)或轉(zhuǎn)染表達(dá)天然mir-434_5p微核糖核酸的載體的Colo 細(xì)胞(Colo+mir-434-5p)等細(xì)胞中沒有檢測到上述胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記。mir-434_5p的序 列并不與mir-302s同源。因?yàn)镃olo細(xì)胞是已分化的人類黑色素瘤細(xì)胞株，因此結(jié)果顯示 SpRNAi-RGFP介導(dǎo)的mir-302轉(zhuǎn)染能使Colo細(xì)胞重新編程為類胚胎干細(xì)胞的狀態(tài)，該狀態(tài) 與胚胎干細(xì)胞的狀態(tài)相似。0ct3/4(或稱為Oct-3或Oct-4)是POU轉(zhuǎn)錄因子的一種，其主要在全能胚胎干 細(xì)胞及生殖細(xì)胞中高度表達(dá)(Scholer et al.，(1989)EMBO J. 8 2543-2550 ；Rosner et al.，(1990)Nature 345:686-692)。0ct3/4的嚴(yán)格表達(dá)對于維持干細(xì)胞自我更新及多潛 能性是必需的。0ct3/4的下調(diào)導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞分化進(jìn)入不同的發(fā)育過程。SSEA蛋白包含 SSEA-U3及4，它們最初是由單株抗體所辨識，此單克隆抗體能辨識在初期著床階段的鼠 科胚胎細(xì)胞的表面及畸形癌細(xì)胞表面的乳系糖脂和球系糖脂，但不能辨識上述細(xì)胞分化后 的衍生細(xì)胞(Solter et al.，(1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5565-5569)。未分化 的初期胚胎干(ES)細(xì)胞、人類胚胎癌細(xì)胞(hEC)及胚胎干細(xì)胞皆表達(dá)SSEA-3及SSEA-4， 但不表達(dá) SSEA-I (Thomson et al.，(1998) Science 282:1145-1147)。在卵子生成過程中 SSEA-3及SSEA-4被合成，并主要存在于卵子、受精卵及早期分裂的胚胎細(xì)胞的細(xì)胞膜表面 (Shevinsky et al.，(1982)Cell 30:697-705)。Sox2在維持多潛能性上扮演核心轉(zhuǎn)錄分 子的角色，但此功能并非專一于胚胎干細(xì)胞中(Boyer et al.，(2005)Cell 122:947-956)。 因此，基于現(xiàn)有的對于胚胎干細(xì)胞標(biāo)記的知識，經(jīng)mir-302轉(zhuǎn)染的Colo細(xì)胞具有這些胚胎 干細(xì)胞標(biāo)記的所有特性及相關(guān)功能。此外，多潛能干細(xì)胞具有另一獨(dú)特特征是表觀遺傳(印igenetic)修飾改變，尤其 是基因組去甲基化(Hochedlinger et al. , (2006)Nature 441 :1061_1067)。為了重新編程 已經(jīng)分化的體細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞階段，許多胚胎基因需要被重新激化以抑制與發(fā)育及分化 相關(guān)信號或基因。DNA甲基化對于調(diào)控上述基因的表達(dá)或不表達(dá)扮演重要的角色。因?yàn)樯嫌螁幼訁^(qū)域的甲基化通常干擾眾多對于基因表達(dá)所必需的轉(zhuǎn)錄機(jī)器的組裝，去甲基化過程 必須存在以重新活化胚胎基因，如Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4及Sox2。為了評估Colo+mir-302 細(xì)胞及Colo細(xì)胞的甲基化程度，首先分離細(xì)胞的基因組(DNA分離試劑盒，Roche, IN)；并 用切割位點(diǎn)為CCGG的限制酶Hpa II將分離的基因組消化，Hpa II對于CpG甲基化具有敏感 性，并只切割沒有甲基化的CCGG位點(diǎn)，但不能切割具有甲基化的CCGG位點(diǎn)。如圖6C所示， 對照Colo細(xì)胞的消化后的基因組片段遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于類胚胎干細(xì)胞(Colo+mir-302)的，這暗示 轉(zhuǎn)染mir-302的Colo細(xì)胞中確實(shí)存在高程度的去甲基化。Colo細(xì)胞及Colo+mir-302細(xì)胞 的基因組的原始尺寸大小幾乎相同。
圖6D進(jìn)一步顯示了與轉(zhuǎn)染mir-302的hpESC、PC3及Colo細(xì)胞相比，對照的 hpESC、PC3及Colo細(xì)胞中的0ct3/4基因啟動子區(qū)域甲基化模式發(fā)生改變。為了證實(shí)這些 區(qū)域的甲基化，本實(shí)驗(yàn)利用酸式亞硫酸鹽(bisulfite) (CpGenome DNA modification kit, Chemicon, CA)處理分離的基因組DNA，酸式亞硫酸鹽可將所有未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟?嘧啶，然后利用兩條正向引物 5’ -GTTGTTTTGT TTTGGTTTTG GATAT-3’ 及 5’-ATTGTTTTGT TTTGGTTTTG GATTTA-3，以及一條反向引物 5，-GTAGAAGTGC CTCTGCCTTC C-3，進(jìn)行聚合酶鏈 式反應(yīng)(PCR))(廠模板PCR延伸試劑盒Roche，IN)分離0ct3/4的5’端上游啟動子區(qū)域。 細(xì)胞基因組(IOOng)先與引物(共150pmole)及IxPCR緩沖液混合，加熱至94°C至保持四分 鐘后立即放置冰上冷卻。而后，進(jìn)行25個(gè)PCR循環(huán)，其條件如下92°C 1分鐘；55°C 1分鐘； 以及70°C 5分鐘。而后，通過PCR純化試劑盒(Qiagen，CA)收集PCR反應(yīng)產(chǎn)物，此PCR產(chǎn) 物用等量的切割A(yù)CGT序列的多重限制酶混合物消化(每一種酶各5單位(5U))，所述限制 酶包含 AclI (AACGTT) ,BmgBI (CACGTC) ,PmlI (CACGTG) ,SnaBI (TACGTA)及 HpyCH4IV(ACGT)。 因?yàn)樵诖藚^(qū)域中無甲基化的ACGT位點(diǎn)被酸式亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化為AUGT位點(diǎn)，而AUGT位點(diǎn)不 能被上述限制酶混合物切割。如圖6D所示，結(jié)果表明在對照的hpESC、PC3及Colo細(xì)胞中 的至少四個(gè)甲基化的ACGT位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)染mir-302的hpESC、PC3及Colo細(xì)胞中被重新編程 成去甲基化的ACGT處。0ct3/4基因啟動子區(qū)域的mir-302介導(dǎo)的去甲基化還可能是導(dǎo)致 mir-302轉(zhuǎn)染細(xì)胞(如Colo+mir-302)中0ct3/4基因表達(dá)的再度活化的原因。除此之外，細(xì)胞遷移的減少通常在mir-302所轉(zhuǎn)染的癌化細(xì)胞(如PC3和Colo細(xì) 胞系)中被觀察到。假設(shè)胚胎干細(xì)胞傾向于停留于一處并原位形成胚樣體，這可能可以解 釋為何PC3及Colo細(xì)胞在mir-302轉(zhuǎn)染的后會喪失遷移能力。如圖6E所示，當(dāng)將PC3細(xì)胞 置于PC3+mir-302細(xì)胞旁時(shí)，我們能清楚觀察到癌化的PC3細(xì)胞沿著PC3+mir_302細(xì)胞的 一側(cè)快速遷移約30秒。黑色箭頭指示PC3細(xì)胞移動的方向。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示mir-302轉(zhuǎn) 染在癌細(xì)胞中的潛在治療應(yīng)用，這不僅可以使癌細(xì)胞重新編程為有用的干細(xì)胞而且可降低 癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)會。更有優(yōu)勢的是，因?yàn)閙ir-302轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞仍然與病人的免疫系統(tǒng)兼 容，這樣獲得的類胚胎干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞能被用來移植治療而無任何免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。利用miRNA微矩陣分析辨識轉(zhuǎn)基因mir-302表達(dá)為了確定在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中轉(zhuǎn)mir-302基因的表達(dá)，我們進(jìn)行了 miRNA微矩陣分析。 在約70%的匯合率，使用mirVanaTMmiRNA分離試劑盒(Ambion，Inc.，Austin, TX)按照廠 商建議從每株細(xì)胞系中分離小核糖核酸。所分離的小核糖核酸經(jīng)純化并定量后使用 甲醛-瓊脂糖凝膠電泳法及光譜儀分析(spectrophotometer measurement) (Bio-Rad， Hercules, CA)以及送至 LC Sciences (San Diego, CA)以進(jìn)行 miRNA 微矩陣分析。在 Cy3 及Cy5的強(qiáng)度圖片中，當(dāng)信號的強(qiáng)度由第1級增加至第65535級，其相對應(yīng)的色彩由藍(lán)轉(zhuǎn)綠到 黃至紅。在Cy5/Cy3的圖片比率來看，當(dāng)Cy3的強(qiáng)度高于Cy5的強(qiáng)度時(shí)，顏色為綠色，當(dāng)Cy3 的強(qiáng)度與Cy5的強(qiáng)度相同時(shí)，顏色為黃色，以及當(dāng)Cy5的強(qiáng)度較Cy3的強(qiáng)度高時(shí)，顏色為紅 色。如圖7A所示，Cy3是指沒經(jīng)任何處理的細(xì)胞(如Colo)，而Cy5為轉(zhuǎn)染mir_302的細(xì)胞 (如 Colo+mir-302)。在 Cy5/Cy3 的圖片比率(最右)，在 SpRNAi-RGFP 介導(dǎo)的 mir_302 轉(zhuǎn) 染后，全部天然的mir-302家族成員(白圈)都高度表達(dá)。因?yàn)閙ir-302家族成員及重新 設(shè)計(jì)的mir-302試劑有約91 %的同源性，這顯示重新設(shè)計(jì)的mir_302試劑能當(dāng)成mir_302 成員，并代替天然的mir-302的功能。圖7B顯示在Colo+mir-302細(xì)胞中不同的表達(dá)量的 miRNA的條列。基于如圖7A所示的結(jié)果，我們也發(fā)現(xiàn)mir-302表達(dá)量的增加能增加天然mir-302s 的表達(dá)以及一些其它微核糖核酸，例如mir-92、mir-93、mir_200c、mir-367、mir-371、 mir-372、mir-373、mir-374以及全部的mir-520家族成員。使用miR庫序列程序 (miRBase: Sequence proRram) (http//microrna. sanRer. ac. uk/)對它們的革巴基因的分 析表明mir-302s與這些miRNAs共同具有超過400種的靶基因，這暗示這些微核糖核酸可 能對于維持干細(xì)胞的多潛能及再生性扮演重要的角色。這些保守的靶基因包括但不限于 RAB/RAS相關(guān)的癌基因成員、ECT相關(guān)的癌基因、多形性腺瘤((pleiomorphic adenoma)基 因、E2F轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期蛋白D結(jié)合Myb樣轉(zhuǎn)錄因子、HMG-框轉(zhuǎn)錄因子、Sp3轉(zhuǎn)錄因子、 類CP2蛋白轉(zhuǎn)錄因子、NFkB活化蛋白基因、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)、MAPK相關(guān)激 酶、SNF相關(guān)激酶、肌球蛋白輕鏈激酶、TNF-α誘導(dǎo)蛋白基因、DAZ-相關(guān)蛋白基因、LIM相關(guān) 同源異型盒(homeobox)基因、DEAD/H盒蛋白基因、叉頭(forkhead box)蛋白基因、BMP調(diào) 控子、Rho/Rac鳥嘌呤核苷酸交換因子、IGF受體、內(nèi)皮素受體、左右決定因子(left-right determination factors)、細(xì)胞周期蛋白、p53誘導(dǎo)核蛋白基因、RB樣1 (RB-likel)、RB接合 蛋白基因、Max接合蛋白基因、c-MIR細(xì)胞免疫辨識調(diào)節(jié)子(c_MIR cellular modulator of immune recognition)、Bcl2_ 樣細(xì)胞凋亡促進(jìn)子(Bcl2_like apoptosis facilitator)、]^ 鈣粘蛋白(protocadherins)、整合素 β 4/β 8、抑制子、錨蛋白(ankyrins)、SENP1、NUFIP2、 FGF9/19、SMAD2、CXCR4、EIF2C、PCAF, MECP2、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶 MYST3、細(xì)胞核蛋白 RNP Η3 (nuclear RNP H3)以及許多核受體及因子。這些所有基因都與胚胎發(fā)育和/或癌化生成 相關(guān)。利用基因微矩陣分析辨識胚胎干細(xì)胞標(biāo)志表汰在胚胎干細(xì)胞標(biāo)計(jì)與轉(zhuǎn)mir-302基因的共同表達(dá)相關(guān)性被證實(shí)后，我們利用基 因微矩陣分析來篩選在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染mir-302前后以及在mir-302轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及其它人類 胚胎干細(xì)胞之間的基因組范圍內(nèi)的基因表達(dá)譜的改變。Affymetrix基因芯片(GeneChip U133A&B arrays, Santa Clara, CA)被用來評估在Colo細(xì)胞和Colo+mir-302細(xì)胞之間以及 Colo+mir-302細(xì)胞與其它人類胚胎干細(xì)胞(如HuEC8及H9)之間超過32668個(gè)人類基因表 達(dá)模式的變化。每個(gè)測試細(xì)胞株的總核糖核酸使用RNeasy旋轉(zhuǎn)柱(spin column) (Qiagen, Valencia, CA)分離。為了清楚地鑒定背景中不同的靶，我們使用相同Colo+mir302樣本重 復(fù)微矩陣測試并選出兩百個(gè)基因，這些基因稍微存在在測試的一側(cè)以便進(jìn)一步比較。如圖 8A所示，在Colo+mir-302的重復(fù)兩次的測試中，這些選擇的基因(白點(diǎn))的表達(dá)量的改變 全都小于一倍，這表明這些背景值的噪聲是相當(dāng)小的?；谶@些預(yù)先選擇的基因的分散模
25式，其變化的閾值為一倍，我們能計(jì)算出兩組比較基因轉(zhuǎn)錄文庫的相關(guān)系數(shù)。給出的CC比 率顯示在比較的樣品中32668個(gè)人類基因表達(dá)模式具有相似的比例。根據(jù)該CC比率，如 圖8A所示的結(jié)果證實(shí)Colo+mir-302細(xì)胞的基因表達(dá)模式與hES HuECS及H9細(xì)胞之間具 有88%及86%的高相似性，然而只有53%的低相關(guān)系數(shù)比率存在于Colo與Colo+mir-302 細(xì)胞之間。這表明SpRNAi-RGFP介導(dǎo)的mir_302轉(zhuǎn)染改變高達(dá)15354個(gè)細(xì)胞基因的表達(dá)模 式，這些基因可能與癌化Colo細(xì)胞重新編程成類胚胎干細(xì)胞Colo+mir-302細(xì)胞相關(guān)。
在Colo與Colo+mir-302細(xì)胞之間一些主要表達(dá)不同的基因列表顯示于圖8B中。 與H9及HuEC8細(xì)胞一樣，Colo+mir-302細(xì)胞高水平表達(dá)許多胚胎干細(xì)胞及生殖細(xì)胞的細(xì)胞 標(biāo)計(jì)，如 SSEA-3，SSEA-4, Utfl, 0ct4, Sox2, Pulimio-2 及 Nanog)。然而，Klf4 并不表達(dá)于 Colo+mir-302細(xì)胞中，這顯示與iPS細(xì)胞有些許不同(如圖6B所示)。此外，在mir_302 轉(zhuǎn)染后，許多癌癥特異性標(biāo)計(jì)、發(fā)育信號及細(xì)胞增殖因子被顯著地下調(diào)，這與觀察到的未分 化的圓形細(xì)胞的型態(tài)及如圖5所示的較慢的細(xì)胞復(fù)制速度相一致。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表 明使用新發(fā)明的mir-302轉(zhuǎn)染的方法能遺傳地重新編程和轉(zhuǎn)化已分化的Colo細(xì)胞株成具 有高度類胚胎干細(xì)胞Colo+mir-302細(xì)胞株，與多潛能的H9及HuECS干細(xì)胞的那些相似。就定義上來說，多潛能干細(xì)胞能分化成許多細(xì)胞型態(tài)，這些形態(tài)與從胚胎外胚層、 中胚層及內(nèi)胚層衍生的組織細(xì)胞相似。舉例來說，在無飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下在體外使用荷 爾蒙及生長因子進(jìn)行處理，本發(fā)明已經(jīng)可成功的導(dǎo)引Colo+mir-302細(xì)胞分化成三種不同 細(xì)胞形態(tài)，如圖9A到9C所示。首先，在無飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下，用天然的雄激素與雙氫罩 固酮(DHT 50ng/ml)處理Colo+mir-302細(xì)胞六小時(shí)后，移植上述細(xì)胞(約IO5個(gè)細(xì)胞) 到六周大雌性免疫缺陷(immunocompromised)的SCID米黃色小鼠的子宮中，一周后在移 植處生成精原細(xì)胞樣細(xì)胞的孢囊(圖9A中間)。其次，運(yùn)用轉(zhuǎn)化生長因子i3 1(TGF-M 100ng/ml)處理Colo+mir-302細(xì)胞12小時(shí)后，移植處理后的細(xì)胞到六周大雌性免疫缺陷 (immunocompromised)的SCID米黃色小鼠的子宮中，這些細(xì)胞分化成成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞 并開始分泌膠原蛋白，在一周內(nèi)，這些細(xì)胞占據(jù)了子宮大部分的區(qū)域(圖9B)。最后，用骨 HH胃白 4 (bone morphogenetic protein 4 (BMP4 100ng/ml)) ^hii Colo+mir-302 ig 胞12小時(shí)后，再用異種皮移植(xenograft)方式將處理后的細(xì)胞移植到六周大免疫缺陷 的SCID米黃色小鼠的肝臟中，上述細(xì)胞會分化成類軟骨細(xì)胞，其周圍有些許鈣化沉淀(圖 9C)。無胸腺小鼠(thymic nude mice)的使用提供了一種體內(nèi)模仿移殖治療的環(huán)境。這些 發(fā)現(xiàn)提供了有力的證據(jù)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的mir-302的轉(zhuǎn)染方法可成功地產(chǎn)生新穎的類胚 胎干細(xì)胞的細(xì)胞系，這些細(xì)胞株可在無飼養(yǎng)層細(xì)胞的體外環(huán)境中經(jīng)導(dǎo)引生成不同組織細(xì)胞 形態(tài)。因此，本發(fā)明不僅能夠重新編程和轉(zhuǎn)化已經(jīng)分化的體細(xì)胞成為類胚胎干細(xì)胞的多潛 能細(xì)胞，而且可在無飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境下維持干細(xì)胞的多潛能及自我復(fù)制的特性。因此，本發(fā)明通過利用內(nèi)含子的mir-302表達(dá)載體提供一種新穎的有效的干細(xì)胞 生成方法，具體來說，由原代體細(xì)胞及癌細(xì)胞所衍生的生成方法。因?yàn)閮?nèi)含子的微核糖核酸 介導(dǎo)的基因沉默路徑與許多細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控機(jī)制協(xié)調(diào)反應(yīng)，這些機(jī)制包含基因轉(zhuǎn)錄成分、核 糖核酸剪接(RNA splicing)、外來體消化及無義介導(dǎo)降解加工體系。在所有三種當(dāng)前已知 的RNAi路徑中，內(nèi)含子的微核糖核酸的基因沉默效應(yīng)被認(rèn)為最有效、最專一、最安全?；?全部的優(yōu)勢，本發(fā)明的內(nèi)含子的mir-302試劑的使用提供一種簡單、有效及安全的基因操縱方法，該方法不僅可將體細(xì)胞重新編程為類胚胎干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞，也可在無飼養(yǎng)層 細(xì)胞的培養(yǎng)條件下維持胚胎干細(xì)胞的多潛能特性，因此可避免在先前的iPS方法中所使用 的通過令人厭煩的反轉(zhuǎn)錄病毒將四種巨大轉(zhuǎn)錄因子基因插入單一細(xì)胞。A.定義為了有助于理解本發(fā)明，一些術(shù)語定義如下核苷酸是指去氧核糖核酸(DNA)或核糖核(RNA)單體單元，這些分子包含戊糖、 磷酸根及含氮雜環(huán)堿基。此堿基通過糖苷鍵的碳(戊糖的1’碳)與糖部分聯(lián)接，并且堿基 與糖的組合形成核苷。含有至少一個(gè)磷酸根與所述戊糖的3’端與5’端的位置連接的核苷 為核苷酸。寡核苷酸意指包含兩個(gè)以上的DNA或RNA的分子，優(yōu)選包括超過三個(gè)所述分子， 而通常超過十個(gè)所述分子。而其精確的尺寸是取決于許多因素，這些又取決于所述寡核苷 酸的最佳功能或用途。寡核苷酸可以通過包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄及或它們的組合 的多種方式形成。核酸意指核苷酸的聚合體，可為單鏈或雙鏈。核苷酸相似物意指在結(jié)構(gòu)與A、T、C、G或U不同，但其相似性足以在核苷酸分子 中取代正常核苷酸的嘌呤或嘧啶核苷酸。核酸組合物意指多核苷酸，如DNA或RNA，其以單鏈或雙鏈分子結(jié)構(gòu)存在?；蛞庵钙浜塑账嵝蛄芯幋aRNA和/或多肽(蛋白質(zhì))的核酸?；蚩蔀镽NA 或 DNA。 堿基對(bp)意指在雙鏈DNA分子中A與T或C與G的配對。在RNA中，U取代T 與A配對。一般來說配對是以氫鍵實(shí)現(xiàn)。前體信使核糖核酸(pre-mRNA)意指在真核細(xì)胞中通過Pol_ II型RNA聚合酶以 稱為轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞機(jī)制所產(chǎn)生的基因的初級核糖核苷酸轉(zhuǎn)錄物。前體信使核糖核酸序列包含 5’端非翻譯區(qū)域(、3’端非翻譯區(qū)域、外顯子及內(nèi)含子。內(nèi)含子意指編碼非蛋白閱讀框的基因轉(zhuǎn)錄序列的一部分或多個(gè)部分，如框內(nèi) (in-frame)內(nèi)含子、5’端非翻譯區(qū)域(5’ -UTR)及3’端非翻譯區(qū)域(3’ -UTR)。外顯子意指編碼蛋白閱讀框的基因轉(zhuǎn)錄序列的一部分或多個(gè)部分。信使核糖核酸(mRNA):意指經(jīng)由核內(nèi)剪接體機(jī)制除去內(nèi)含子后所組成的前體信 使核糖核酸的外顯子，該外顯子充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)編碼RNA以用于蛋白質(zhì)的合成?；パa(bǔ)去氧核糖核酸(cDNA)意指與mRNA序列互補(bǔ)的單鏈DNA，此cDNA無任何內(nèi)含 子序列。正義核酸(sense)意指其序列順序和組成與同源的mRNA相同的核酸分子。此正 義核酸構(gòu)型標(biāo)示為“ + ”、“s”或“正義”。反義核酸(antisense):意指其序列順序與各自的mRNA分子互補(bǔ)的核酸分子。此 反義核酸構(gòu)型標(biāo)示為在DNA或RNA之前的“-”、“a”或“反義”，例如“aDNA"或“aRNA”。5’端意指在連續(xù)核苷酸的5’位置缺乏核苷酸的端點(diǎn)，其中一個(gè)核苷酸的5’羥 基與相鄰核苷酸的3’羥基通過磷酸二酯鍵連接。其它的基團(tuán)，例如一個(gè)或多個(gè)磷酸根可能 存在端點(diǎn)。3’端意指在連續(xù)核苷酸的3’位置缺乏核苷酸的端點(diǎn)，其中一個(gè)核苷酸的5’羥基與相鄰核苷酸的3’羥基通過磷酸二酯鍵連接。其它的基團(tuán)，通常為羥基可能存在端點(diǎn)。模板此意指能被核核酸聚合酶復(fù)制的核酸分子，根據(jù)不同的聚合酶，模板可為單 鏈、雙鏈、部分雙鏈。合成的復(fù)制核酸與模版互補(bǔ)，或者與雙鏈或者部分雙鏈模版中的至少 一鏈互補(bǔ)。RNA與DNA都從5’端到3’端的方向合成。核酸雙鏈的兩鏈通常排列成使兩條 鏈的5’端位于雙鏈的相反兩端(需要的話，使兩條鏈的3’端位于雙鏈的相反兩端)。核酸模板意指雙鏈DNA分子、雙鏈RNA分子、雜交分子如DNA-RNA或RNA-DNA雜 交雙鏈、或單鏈DNA或單鏈RNA。保守的意指如果核苷酸序列與預(yù)先選定的序列的精確互補(bǔ)物不是隨機(jī)雜交，則 該核苷酸與預(yù)先選定(參照)的序列是保守的。互補(bǔ)意指以堿基配對的規(guī)律發(fā)生關(guān)系的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如序列 “ AGT，，是互補(bǔ)于序列“ TCA，，或“ TCU”?；パa(bǔ)可以是DNA的兩條鏈之間、DNA與RNA之間、RNA 的兩條鏈之間?；パa(bǔ)能是部分互補(bǔ)或完全互補(bǔ)。部分互補(bǔ)是只有某些核苷酸堿基根據(jù)堿基 配對規(guī)律能夠配對；然而完全互補(bǔ)則是鏈中的核苷酸堿基全部能配對。而核酸鏈之間互補(bǔ) 的程度顯著影響兩條鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度?；パa(bǔ)對于擴(kuò)增反應(yīng)以及取決于核酸之間結(jié) 合的檢測方法尤其重要。互補(bǔ)率是非配對的堿基數(shù)量與核酸中一條鏈的全部堿基數(shù)量的比 率，因此50%的互補(bǔ)率就是一半的堿基非配對，一半的堿基配對。即使是堿基數(shù)量不同的雙 鏈也能配對。在此情況下，互補(bǔ)發(fā)生于較長的一鏈中的能夠與較短的一鏈的堿基配對的堿 基部分與較短的一鏈的堿基之間。同源意指多核苷酸序列與基因或mRNA的序列具有相似性。如，一核酸序列可能 部分或完全與一特定基因或mRNA的序列同源。同源也可以表示相似核苷酸數(shù)量與全部核 苷酸數(shù)量的比率?；パa(bǔ)堿基意指當(dāng)DNA或RNA形成雙鏈構(gòu)型時(shí)正常配對的核苷酸?；パa(bǔ)核苷酸序列意指單鏈RNA或DNA的核苷酸序列與另一鏈的互補(bǔ)程度足以使 兩條鏈之間通過隨后發(fā)生的氫鍵專一地雜交。雜交意指足以互補(bǔ)形成復(fù)合體的核苷酸序列通過堿基配對所形成雙鏈體。而當(dāng) 引物(或剪接模板)與靶(模板)雜交時(shí)，這種復(fù)合物(雜交體)的穩(wěn)定性足以行使DNA 聚合酶引發(fā)DNA合成所需要的引物功能。在兩條互補(bǔ)多核苷酸之間存在專一的(即非隨機(jī) 的)相互作用，這種作用可以被競爭性地抑制。核糖核酸干擾(RNAi):意指在真核細(xì)胞中可以被小RNA分子(例如，微核糖核酸 (miRNA)及小于擾核糖核酸(siRNA))引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。這些小RNA分子通?？?當(dāng)成基因沉默效應(yīng)物，干擾與其完全或部分互補(bǔ)的細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)。微核糖核酸(miRNA)意指能與靶基因轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的單鏈核糖核酸(RNA)，所述靶 基因與所述miRNA部分互補(bǔ)。miRNA通常是長約17到27個(gè)核苷酸，并能經(jīng)由miRNA與它的 靶mRNA之間的互補(bǔ)直接降解細(xì)胞中的其靶mRNA或抑制其靶mRNA的蛋白質(zhì)翻譯。天然的 miRNA能在幾乎所有真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，它們防御病毒感染，并在動植物生長發(fā)育過程中調(diào)控 基因的表達(dá)。前體微核糖核酸(Pre-miRNA)意指發(fā)夾樣單鏈核糖核酸，此Pre-miRNA包含莖臂 和徑環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)域以與細(xì)胞內(nèi)RNase III內(nèi)切酶相互作用而產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)miRNA，該miRNA能 沉默一個(gè)或多個(gè)與其互補(bǔ)的靶基因。Pre-miRNA的徑臂能形成完全或部分(不匹配)雜交雙鏈體，此時(shí)徑環(huán)結(jié)構(gòu)與莖臂雙鏈體的一個(gè)末端形成圓形或發(fā)夾環(huán)的結(jié)型。小干擾核糖核酸(SiRNA)意指小雙鏈核糖核酸，其長優(yōu)選約18到25個(gè)堿基配對 的核糖核苷酸雙鏈體，其能將與其幾乎完整互補(bǔ)的靶基因轉(zhuǎn)錄物降解。小發(fā)夾核糖核酸(shRNA)意指具有一對部分或完全匹配的徑臂核苷酸序列的單 鏈核糖核酸，所述徑臂核苷酸序列被不匹配的環(huán)核苷酸分開形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)。許多天然微 核糖核酸(miRNA)是自發(fā)夾樣RNA前體所衍生，此發(fā)夾樣RNA前體又稱為前體微核糖核酸 (pre-miRNA)。載體意指能夠移動并存在于不同遺傳環(huán)境中的重組核酸分子，如重組DNA(如 rDNA)。通常，另一個(gè)核酸分子被操作地連接在那。此載體在細(xì)胞中能自動復(fù)制，在這種情況 下，所述載體和被連接的片段被復(fù)制。優(yōu)選的一類載體為附加體(印isome)，即能在染色體 外自我復(fù)制的核酸分子。優(yōu)選的載體是那些能自動復(fù)制和/或表達(dá)所攜帶的核酸的載體。 在本文中，能夠表達(dá)編碼一種或多種多肽的基因的載體為成為表達(dá)載體。尤其重要的載體 能夠從由反轉(zhuǎn)錄酶形成mRNA克隆cDNA。順反子意指在DNA分子中編碼氨基酸殘基序列并包括上游和下游DNA表達(dá)控制 元件的核苷酸序列。啟動子意指能被聚合酶辨認(rèn)的(可能是結(jié)合)并能引發(fā)合成的核酸。本發(fā)明中 啟動子可為已知聚合酶的接合位點(diǎn)、增強(qiáng)子等、通過所需聚合酶能夠引發(fā)合成的任何序列?？贵w意指具有預(yù)先選定的保守結(jié)構(gòu)域的多肽或蛋白分子，所述結(jié)構(gòu)域編碼能夠 結(jié)合預(yù)先選定的配體的受體。B、組合物一種用于誘導(dǎo)內(nèi)含子的核糖核酸介導(dǎo)的基因沉默的重組核糖核酸組合物，該組合 物包含a)至少一個(gè)內(nèi)含子，其中該內(nèi)含子與多個(gè)外顯子側(cè)翼連接并能通過細(xì)胞內(nèi)RNA剪 接和/或加工機(jī)制從外顯子切除；以及b)多個(gè)外顯子，其中該外顯子能連接成具有所需功能的基因。上述的重組核酸組合物，進(jìn)一步包含a)至少一個(gè)限制酶/克隆位點(diǎn)，其中該限制酶/克隆位點(diǎn)用于將所述重組核酸組 合物摻入表達(dá)載體中，以在哺乳細(xì)胞中表達(dá)該重組核酸組合物的初級RNA轉(zhuǎn)錄物；以及多個(gè)轉(zhuǎn)錄及翻譯終止位點(diǎn)，其中該轉(zhuǎn)錄及翻譯終止位點(diǎn)用于制造該重組核酸組合 物的RNA轉(zhuǎn)錄物的正確尺寸。上述重組核酸組合物的內(nèi)含子進(jìn)一步包含a)與至少一個(gè)靶基因互補(bǔ)或同源的基因沉默效應(yīng)物的插入片段；b)5’ _供體剪接位點(diǎn)；c)3’ _受體剪接位點(diǎn)；d)用于剪接體辨識的分支點(diǎn)模體域；e)用于供剪接體相互作用的多嘧啶串；和f)多個(gè)可供連接主要組件的接頭?；虺聊?yīng)物的插入片段編碼同源于5 ’ -UAAGUGCUUC CAUGUUU-3 ’ (SEQ. ID. NO. 3)的核苷酸序列。該5’ -供體剪接位點(diǎn)是含有或同源于5’ -GTAAGAGK-3’ (SEQ.ID. NO. 4)或者 GU(A/G)AGU 模體(例如，5 ’ -GTAAGAGGAT-3 ’、5 ’ -GTAAGAGT-3 ’、 5’ -GTAGAGT-3’及5’ -GTAAGT-3’)的核苷酸序列；3’ -受體剪接位點(diǎn)是含有或同源 于 GWKSCYRCAG (SEQ. ID. NO. 5)或 CT (A/G) A (C/T) NG 模體(例如，5，-GATATCCTGCAG-3，、 5，-GGCTGCAG-3，和5，-CCACAG-3，)的序列。此外，分支點(diǎn)序列是位于5’ -與3’ -剪 接位點(diǎn)之間，含有同源于5，-TACTWAY-3，(SEQ. ID. NO. 6)模體(如，5，-TACTAAC-3，及 5’-TACTTAT-3’)的模體。此外，多嘧啶串是位于分支點(diǎn)與3’-剪接位點(diǎn)之間，其核苷酸序 列含有高含量的胸腺嘧啶與胞嘧啶并同源于5’-(TY)m(C/-) (T)nS(C/-)-3’ (SEQ. ID. NO. 7) 與5，-(TC)nNCTAG(G/-)-3' (SEQ. ID. NO. 8)。其中，符號“m”與“η”是指大于或等于1的多 重復(fù)序列；更優(yōu)選地，m的數(shù)值為1-3，而η的數(shù)值為7-12。符號“_”是指無任何核苷酸。一 些接頭核苷酸序列能用來連接所有這些內(nèi)含子成分。根據(jù)37CFR1. 822指南中對用于核苷 酸和/或氨基酸序列資料的符號和格式的規(guī)定，符號W是指腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)/尿 嘧啶(U)，符號K是指鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號S是指胞嘧啶(C)或鳥 嘌呤(G)，符號Y是指胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號R是指腺嘌呤㈧或鳥 嘌呤(G)以及符號N是指腺嘌呤(Α)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。 對于上述所有剪接體辨識成分中，脫氧胸苷(T)核苷酸是可用尿苷(U)來取代。C、方法一種用于在哺乳細(xì)胞中誘導(dǎo)內(nèi)含子mir-302介導(dǎo)的基因沉默的轉(zhuǎn)基因方法，其包 含下列步驟a建構(gòu)重組核酸組合物，該重組核酸組合物包含至少一個(gè)編碼mir-302樣基因沉 默效應(yīng)物的內(nèi)含子，該內(nèi)含子與外顯子側(cè)翼連接，其中該內(nèi)含子能經(jīng)切除后與該外顯子分 離以誘導(dǎo)mir-302介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)；b將該重組核酸組合物克隆到表達(dá)載體中；以及c將該表達(dá)載體導(dǎo)入多個(gè)哺乳細(xì)胞中，其中該細(xì)胞產(chǎn)生多該重組核酸組合物的 初級RNA轉(zhuǎn)錄物，其中該細(xì)胞將該內(nèi)含子從從該初級RNA轉(zhuǎn)錄物中剪接出來，以對含有與 mir-302類似基因沉默效應(yīng)物同源或互補(bǔ)的序列的基因產(chǎn)生mir-302介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)。
實(shí)施例以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施方式和方面，而不是用于限制本發(fā) 明的范圍。在以下的實(shí)施例公開的內(nèi)容中，使用以下縮寫M(摩爾的)；mM(毫摩爾)；μπ!(微 摩爾)；mol(摩爾)；pmol(皮摩爾)；gm(克)；mg(豪克)；Pg(微克)；ng(納克)； L(升)；ml(毫升)；μ1(微升)；°C (攝氏度)；cDNA(復(fù)制或互補(bǔ)的DNA) ；DNA(脫氧核 糖核酸)；ssDNA (單鏈DNA) ；ds DNA (雙鏈DNA) ；dNTP (脫氧核糖核苷三磷酸)；RNA (核糖 核酸)；PBS (磷酸鹽緩沖液)；NaCl (氯化鈉)；HEPES (N-2-羥乙基呱嗪-N-2-乙硫磺酸)； HBS(HEPES緩沖鹽)；SDS (十二烷基磺酸鈉)；Tri-HCl (三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽)； 和ATCC(美國菌種保藏中心)。實(shí)施例1建構(gòu)包含SpRNAi的重組基因(SpRNAi-RGFP)用于產(chǎn)生三種不同SpRNAi內(nèi)含子的合成核酸序列，該序列包含正義、反義或發(fā)夾-EGFP 插入片段，如下所示N1-正義，5，-GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GA-3，(SEQ. ID. NO. 14) ；Nl-反義，5，-CGCGTCTTGA AGAAGATGGT GCGCTCCTGC GATCGGATCC TCTTAC-3' (SEQ. ID. NO. 15) ；N2-正義，5' -GTAAGAGGAT CCGATCGCTT GAAGAAGATG GTGCGCTCCT GA-3，(SEQ. ID. NO. 16) ；N2-反義，5，-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGC GATCGGATCC TCTTAC-3' (SEQ. ID.NO. 17) ；N3-正義，5' -GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GTTAACTTGA AGAAGATGGT GCGCTCCTGA-3’ (SEQ. ID. NO. 18) ；N3-反義，5，-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGT TAACTTGAAG AAGATGGTGC GCTCCTGCGA TCGGATCCTC TTAC-3，(SEQ. ID. NO. 19) ；N4-正義，5，-CGCGTTACTA ACTGGTACCT CTTCTTTTTT TTTTTGATAT CCTGCAG-3' (SEQ. ID. NO.20) ；N4-反義，5' -GTCCTGCAGG ATATCAAAAA AAAAAGAAGA GGTACCAGTT AGTAA-3，(SEQ. ID. NO. 21)。從 SEQ. ID. NO. 14 到 SEQ. ID. NO. 21的所有序列在其5’端是磷酸化。此外，兩外顯子片段是經(jīng)由通過DraII限 制酶在紅色螢光RGFP基因(SEQ. ID. NO. 22)的第208個(gè)核苷酸處所切割產(chǎn)生，5，-片段進(jìn) 一步通過T4DNA聚合酶作用而生成平端。RGFP是指在紫點(diǎn)海葵(Heteractis crispa) (BD Biosciences, CA)的HcRedl色蛋白的第69位氨基酸(a. a.)處嵌入一額外的天冬氨酸產(chǎn)生 的新穎的紅移螢光色蛋白基因；具有較少聚集并在570nm波長處發(fā)射幾乎兩倍強(qiáng)度的遠(yuǎn)紅 外線螢光。本發(fā)明用XhoI及XbaI限制酶切割pHcRedl-Nl/Ι質(zhì)粒(BD Biosciences,CA)， 然后用2%瓊脂糖凝膠電泳和提取(gel extraction kit, Qiagen, CA)分別分離全長769 堿基對(bp)的RGFP基因片段與3934bp的空質(zhì)粒。通過在以下條件下加熱每一種正義與反義序列(1 1)的互補(bǔ)混合物分別使 Nl-正義與Nl-反義雜交、N2-正義與N2-反義雜交、N3-正義與N3-反義雜交及N4-正義 與N4-反義雜交，所述條件為94°C 2分鐘，然后在IxPCR緩沖液(如50mM Tris-HCl, pH 9. 2，在25°C下，16mM(NH4)2SO4U. 75mM MgCl2)中于70°C加熱10分鐘。接著立刻通過分別 逐漸冷卻(一小時(shí)期間從50°C降到10°C )m+N4、N2+N4、N3+N4(l 1)的雜交混合物而實(shí) 施Ni、N2、N3雜交到N4的序列連接(sequential ligation)。之后加入T4DNA連接酶及 相對應(yīng)的Ix鏈接緩沖液，混合物在12°C保持12小時(shí)，而獲得SpRNAi內(nèi)含子以插入DraII 切割的RGFP外顯子的切口處。在RGFP外顯子片段被加入反應(yīng)(1 1 1)后，T4DNA連 接酶及緩沖液相應(yīng)地調(diào)整以再一次進(jìn)行連接反應(yīng)(在12°C下反應(yīng)12小時(shí))。為了克隆正 確大小尺寸的重組SpRNAi接入RGFP基因，IOng的連接的核苷酸序列通過PCR技術(shù)及一 對 RGFP 特定引物進(jìn)行擴(kuò)增；所述引物為 5，-CTCGAGCATG GTGAGCGGCC TGCTGAA-3，(SEQ. ID. NO. 23)與 5，-TCTAGAAGTT GGCCTTCTCG GGCAGGT—3，(SEQ. ID. NO. 24)；所述 PCR 條件 為在94°C 1分鐘、52°C 1分鐘、68°C 2分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。而后，利用2%瓊脂糖凝 膠分離出得到的PCR的產(chǎn)物，通過凝膠提取試劑盒(Gel Extraction kit) (Qiagen, CA)提 取并純化約900bp大小的核苷酸序列。此約900bp大小的SpRNAi-含有RGFP基因的組合 物進(jìn)一步用測序確認(rèn)。優(yōu)選地，在缺乏內(nèi)含子插入片段的情況下，SpRNAi內(nèi)含子的正義鏈 的序列為 5' -GTAAGTGGTC CGATCGTCGC GACGCGTCAT TACTAACTAT CAATATCTTA ATCCTGTCCC TTTTTTTTCC ACAGTAGGAC CTTCGTGCA-3 ‘ (SEQ. ID. NO. 25)，而 SpRNAi 內(nèi)含子的反義鏈的 序列為 5' -TGCACGAAGG TCCTACTGTG GAAAAAAAAG GGACAGGATT AAGATATTGA TAGTTAGTAA TGACGCGTCG CGACGATCGG ACCACTTAC-3‘ (SEQ. ID. NO. 26)。選擇性地，按照上述方法，重組SpRNAi-RGFP轉(zhuǎn)基因通過將SEQ. ID. NO. 25及SEQ.ID. NO. 26的SpRNAi雜交體插入DraII的限制酶切割的RGFP外顯子的限制酶切位點(diǎn)制備。 在測試重新設(shè)計(jì)的mir-302前體miRNA插入片段(編碼SEQ. ID. NO. 9)的試驗(yàn)中使用的 SpRNAi-RGFP轉(zhuǎn)基因建構(gòu)體是由這種方式形成。因?yàn)橹亟M的SpRNAi-RGFP基因分別在5’端及3’端具有XhoI與XbaI限制酶切位 點(diǎn)，因此其能輕易地克隆到對XhoI與XbaI克隆位點(diǎn)的具有粘性末端的載體中。此載體必 須為能夠表達(dá)的有機(jī)體或亞有機(jī)體(suborganism)，所述有機(jī)體或亞有機(jī)體選自DNA轉(zhuǎn)基 因、質(zhì)粒、跳躍基因、轉(zhuǎn)座子及病毒載體。此外，因?yàn)槲挥趦?nèi)含子的該插入片段分別在5’端 及3’端與PvuI及MluI限制酶切位點(diǎn)側(cè)翼連接，因此本發(fā)明能夠除去所述內(nèi)含子插入片段 并利用對PvuI及MluI克隆位點(diǎn)具有粘性末端的另一種不同的插入片段取代。該插入序列 優(yōu)選為發(fā)夾樣的基因沉默效應(yīng)物，該基因沉默效應(yīng)物含有與靶基因高度互補(bǔ)的序列，所述 靶基因選自螢光蛋白(GFP)基因、螢光素酶基因、β半乳糖苷酶(Iac-Z)基因、病毒基因、細(xì) 菌基因、植物基因、動物及人類基因。這些沉默效應(yīng)物插入片段與其靶基因序列的互補(bǔ)和/ 或同源率為約30%到100%的，對發(fā)夾shRNA插入片段更優(yōu)選為35%到49%，對正義-RNA 與反義-RNA插入片段更優(yōu)選為90%到100%。實(shí)施例2將句,含SpRNAi的某因克降到表汰裁體中因?yàn)橹亟M的SpRNAi-RGFP基因分別于5’端及3’端具有XhoI與XbaI的限制酶切位 點(diǎn)，因此它能夠容易地克隆到對XhoI與XbaI的限制酶切位點(diǎn)具有相應(yīng)粘性末端的載體中。 本發(fā)明將SpRNAi-RGFP基因與線性化的3934bp的空的pHcRed-Nl/1質(zhì)粒以1 16 (w/w)混 合，將混合物并從65°C降溫到15°C超過50分鐘，之后加入T4連接酶及其緩沖液，混合物在 12°C保持12小時(shí)進(jìn)行連接反應(yīng)。所形成的SpRNAi-RGFP表達(dá)載體能利用E. coli DH5a LB培 養(yǎng)基(含有SOyg/ml卡那霉素(Sigma Chemical, St. Louis,Mo))進(jìn)行大量復(fù)制增殖。并利 用 PCR技術(shù)及其RGFP特定引物(SEQ. ID. NO. 23)及(SEQ. ID. NO. 24)于94°C 1 分鐘、68°C 2分 鐘并進(jìn)行30次循環(huán)反應(yīng)，然后進(jìn)一步進(jìn)行測序以確認(rèn)陽性克隆。為了克隆到病毒載體中， 可以采用相同的連接程序，除了使用Xhol/Xbal-線性化的pLNCX2反轉(zhuǎn)錄病毒載體(BD)代 替以外。因?yàn)樵赟pRNAi內(nèi)中的插入片段分別在5’端及3’端與PvuI及MluI限制酶切位點(diǎn) 連接，因此本發(fā)明能去除該插入片段并以重新設(shè)計(jì)的對PvuI及MluI克隆位點(diǎn)具有粘性末 端的mir-302插入片段取代anti-EGFP shRNA插入片段；該重新設(shè)計(jì)的mir-302插入片段 序列包含同源的 5，-UAA⑶GCUUC CAUGUUU-3，(SEQ. ID. NO. 3)區(qū)域，相似于 5，-UAAGUGCUUC CAU⑶UUUAG UGU-3，(SEQ. ID. NO. 9)、5，-UAAGUGCUUC CAU⑶UUUGG UGA-3，(SEQ. ID. NO. 10)、 5' -UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UAG-3' (SEQ. ID. NO. 11),5' -UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG-3，(SEQ. ID. NO. 12)或 5，-UAA⑶GCUUC CAU⑶UUGAG UGU-3' (SEQ. ID. NO. 13)。用來產(chǎn)生許多同SpRNAi內(nèi)含子的合成核酸序列編碼mir-302家族前體微核糖 核酸叢簇或重新設(shè)計(jì)的mir-302插入片段，示例如下mir_302a-正義，5’ -GTCCGATCGT CCCACCACTT AAACGTGGAT GTACTTGCTT TGAAACTAAA GAAGTAAGTG CTTCCATGTT TTGGTGATGG ATCTCGAGCT C-3' (SEQ. ID. NO. 39) ；mir_302a-反義，5' -GAGCTCGAGA TCCATCACCA AAACATGGAA GCACTTACTT CTTTAGTTTC AAAGCAAGTA CATCCACGTT TAAGTGGTGG GACGATCGGA C-3' (SEQ. ID. NO.40) ；mir_302b-正義，5' -ATCTCGAGCT CGCTCCCTTC AACTTTAACA TGGAAGTGCT TTCTGTGACT TTGAAAGTAA GTGCTTCCAT GTTTTAGTAG GAGTCGCTAG CGCTA-3，(SEQ.ID. NO. 41) ；mir-302b-反義，5，-TAGCGCTAGC GACTCCTACT AAAACATGGA
32AGCACTTACT TTCAAAGTCA CAGAAAGCAC TTCCATGTTA AAGTTGAAGG GAGCGAGCTC GAGAT-3，(SEQ.ID. NO. 42) ；mir-302c-正義，5，-CGCTAGCGCT ACCTTTGCTT TAACATGGAG GTACCTGCTG TGTGAAACAG AAGTAAGTCG TTCATGTTTC AGTGGAGGCG TCTAGACAT-3， (SEQ. ID. NO. 43) ；mir-302c-反義，5' -ATGTCTAGAC GCCTCCACTG AAACATGAAC GACTTACTTC TGTTTCACAC AGCAGGTACC TCCATGTTAA AGCAAAGGTA GCGCTAGCG-3' (SEQ. ID. NO.44)； mir-302d-正義，5’ -CGTCTAGACA TAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCTAA GCCAGGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TCGACGCGTC AT-3' (SEQ. ID. NO.45) ；mir_302d-反義， 5' -ATGACGCGTC GAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCCTG GCTTAGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TATGTCTAGA CG-3，(SEQ. ID. NO. 46)；和 miR-302s_ 正義，5，-GTCCGATCGT CATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCTAA GCCAGGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TCGACGCGTC AT-3' (SEQ. ID. NO. 27) ；mir_302s-反義，5‘ -ATGACGCGTC GATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCCTG GCTTAGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TGACGATCGG AC-3' (SEQ. ID. NO. 28)。Mir-302家族前體微核糖核酸簇的內(nèi)含子插入片段可分別經(jīng)通過雜交 mir-302a-正義與 mir_302a-反義、mir_302b-正義與 mir_302b-反義、mir_302c-正義與 mir-302c-反義及 mir_302d-正義與 mir_302d-反義而形成。接著，mir_302a、mir_302b、 mir-302c 及 mir_302d 的雜交體分別通過 Pvul/Xhol，XhoI/NheI, Nhel/Xbal 及 Xbal/Mlul 等限制酶消化，然后用35微升的高壓滅菌的雙蒸水(ddH20)通過凝膠萃取過濾管柱(gel extraction filter column) (Qiagen, CA)收集。接著立刻，將所收集的雜交體通過T4DNA 連接酶(Roche，20U)互相接合而形成mir-302家族微核糖核酸插入片段簇，并進(jìn)一步用于 插入到Pvul/Mlul線性化的SpRNAi-RGFP表達(dá)載體。包含mir_302家族微核糖核酸插入片 段簇的重組SpRNAi-RGFP基因被插入具有pVSV_G表面抗原的反轉(zhuǎn)錄病毒pLNCX2載體中， 所述抗原可用于轉(zhuǎn)基因感染hpESC與PC3細(xì)胞。為了形成人工重新設(shè)計(jì)的mir-302前體 微核糖核酸插入片段，本發(fā)明雜合SEQ. ID. NO. 27與SEQ. ID. NO. 28兩條合成序列，而后以 Pvul/Mlul等限制酶切開它們的雜交體，并以T4DNA連接酶(20U)將此雜交體插入并連接到 Pvul/Mlul線性化的表達(dá)SpRNAi-RGFP的pHcRedl載體中。包含所述重新設(shè)計(jì)的mir_302 前體微核糖核酸的SpRNAi-RGFP基因直接用于Colo細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因DNA重組。成功轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞24小時(shí)后通過流式細(xì)胞儀和抗RGFP的單克隆抗體Clontech，Palo Alto, CA)被分離 并收集，以用于傳代培養(yǎng)。這樣獲得的mir-302前體微核糖核酸簇及mir-302表達(dá)載體可在E. coli DH5 α LB 培養(yǎng)基(含有50微克/毫升卡那霉素)進(jìn)行pHcRedl-Nl/Ι質(zhì)粒載體的增殖或在E. coli DH5 α LB培養(yǎng)基(100微克/毫升氨芐青霉素)進(jìn)行pLNCX2反轉(zhuǎn)錄載體的增殖。增殖的 SpRNAi-RGFP表達(dá)載體按照廠商的建議通過微量制備(mini-pr印)或大量制備質(zhì)粒提取試 齊[J盒(maxi-prep plasmid extraction kit) (Qiagen, CA)分離及純化。對于 pLNCX2 載體 而言，本發(fā)明還可利用包裝細(xì)胞株(packaging cell line) GP2-293 (Clontech，CA)以供制 造具有感染性但卻無復(fù)制能力的病毒。被感染的GP2-293細(xì)胞培養(yǎng)在37°C及5%的二氧化 碳Ix DMEM培養(yǎng)液中，該培養(yǎng)液添加有碳吸附的10%胎牛血清(FBS)、4mM L-谷氨酰氨、ImM 丙酮酸鈉、100微克/毫升硫酸鏈酶素、50微克/毫升新霉素(Sigma Chemical,M0) 0經(jīng) GP2-293細(xì)胞產(chǎn)生的病毒數(shù)量在轉(zhuǎn)染的前測定至少為106CfU/ml。實(shí)施例3體內(nèi)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染
33
為了將反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染入hpESC及PC3細(xì)胞中，首先培養(yǎng)具有含抗-EGFP mir-gfp或mir-302家族簇前體微核糖核酸插入片段的SpRNAi-RGFP表達(dá)pLNCX2反轉(zhuǎn)錄表 達(dá)載體的PVSV-G共同轉(zhuǎn)染的GP2-293細(xì)胞(Clontech，CA)。在37°C、5%的二氧化碳中培養(yǎng) 36個(gè)小時(shí)后，GP2-293細(xì)胞的培養(yǎng)液(每10毫升)通過過濾(0. 25微米的孔徑)并直接分 別傳送到hpESC及PC3細(xì)胞培養(yǎng)液中。因?yàn)樵撆囵B(yǎng)液中含有很高的設(shè)計(jì)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體 劑量，因此全部的測試細(xì)胞都被所述載體轉(zhuǎn)基因感染，并在24小時(shí)內(nèi)開始表達(dá)內(nèi)含子的插 入片段及RGFP。為了轉(zhuǎn)基因傳遞重新設(shè)計(jì)的人造mir-302前體微核糖核酸進(jìn)入Colo細(xì)胞 中，本發(fā)明首先按照廠商的建議將預(yù)先準(zhǔn)備好的SpRNAi-RGFP轉(zhuǎn)基因(對于每種細(xì)胞培養(yǎng) 采用10毫升培養(yǎng)基60微克(μ g)轉(zhuǎn)基因)，該轉(zhuǎn)基因包含實(shí)施例2的預(yù)先設(shè)計(jì)的mir-302 前體微核糖核酸插入片段與FuGene試劑(Roche，IN)混合。接著，混合物用于Colo細(xì)胞培 養(yǎng)24小時(shí)。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因也包含轉(zhuǎn)座子樣序列，其同源于人類基因組一些不編碼的區(qū)域，因 此陽性轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀及抗RGFP的單克隆抗體(Clontech，CA)選擇，以 供傳代培養(yǎng)。實(shí)施例4RNA印跡分析RNA (20 μ g總RNA或2 μ g聚[A+] RNA)通過1 %甲醛-瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移 到尼龍膜上(Schleicher&Schuell，Keene，NH)。能互補(bǔ)于與RGFP的5，端外顯子與先前設(shè) 計(jì)的前體微核糖核酸插入片段側(cè)翼連接的75bp連接序列(junction sequence)的合成探 針采用 Prime-It II kit (Stratagene, La Jolla, CA)在[32P] -dATP ( > 3000Ci/mM, Amersham International, Arlington Heights, IL)存在下通過隨機(jī)引物延長標(biāo)記，并使用IObp閾 值(cutoff)的 Micro Bio-Spin chromatography columns (Bio-Rad, Hercules, CA)進(jìn)行 純化。雜交是通過混合50%新制備的去離子甲酰胺(pH 7.0)、5x Denhardt's溶液、0. 5% SDS、4x SSPE和250mg/mL變性鮭魚精子DNA片段(18小時(shí)，42°C))而實(shí)施。膜在2x SSC、 0. 1% SDS(15*#、25°C )中洗滌兩次，然后以 0. 2x SSC、0· 1% SDS (45 分鐘，37°C )洗滌一 次后，進(jìn)行放射自顯影。實(shí)施例5十二烷基磺酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及蛋白質(zhì)印跡分析為了靶蛋白進(jìn)行免疫印跡，在除去生長培養(yǎng)液后，將分離的細(xì)胞用冰冷的(PBS) 漂洗，然后按照廠商建議用添加了蛋白酶抑制劑、亮抑酶肽、TLCK、TAME及PMSF的 CelLytic-M裂解/萃取劑(Sigma，M0)處理。將細(xì)胞在室溫中在振蕩器上孵育15分鐘，將 細(xì)胞刮入微管中，用12000xg的轉(zhuǎn)速離心5分鐘將細(xì)胞碎片沉淀。將含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解 液收集并儲存在_70°C以待使用。利用SOFmax軟件包在E-max微孔板閱讀器(microplate reader) (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)測定蛋白量。每 30 μ g 的細(xì)胞裂解液被加 入SDS-PAGE樣品緩沖液，該緩沖液含有(還原的)或不含有(未還原的)50mM DTT)，并 煮沸3分鐘，再將樣本注入8%聚丙酰胺凝膠，同時(shí)將2 3μ 1蛋白標(biāo)計(jì)(Bio-Rad)注入 參照泳道。而SDS-丙酰胺凝膠電泳是依據(jù)在分子克隆(Molecular Cloning, 3rd ED)中 描述的標(biāo)準(zhǔn)程序來實(shí)施。蛋白級份通過電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜，并用Odyssey封閉劑 (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NB)在室溫作用1 2小時(shí)。然后利用一抗在4°C過夜評 價(jià)蛋白質(zhì)的表達(dá)，所述一抗分別為抗EGFP(1 5,000 ；幾-8，BD)、RGFP(1 10, 000 ；BD), 0ct3/4(l 500 ；Santa Crutz)、SSEA-3 (1 500 ；Santa Crutz)、SSEA-4 (1 500 ；Santa Crutz)、Sox2(l 1000 ；Santa Crutz)或 Klf4 (1 200 ； Santa Crutz))。接著用 TBS-T漂洗蛋白帶三次，然后在室溫下暴露在二抗(結(jié)合Alexa FluOr680反應(yīng)燃料的山羊抗小鼠 IgG(l 2, 000 ；Molecular Probes))中 1 小時(shí)。再用 TBS-T漂洗三次后用 Li-Cor Odyssey Infrared Imager 及 Odyssey Softeare v. IO(Li-Cor)進(jìn)行掃描和紀(jì)錄影像。種· 6船.Φ力好隨謝亥盼馳細(xì)磁在轉(zhuǎn)染過程中將Tg(actin_GAL4 :UAS_gfp)株斑馬魚幼魚養(yǎng)在含有IOml 0. 2x 無血清RPMI 1640培養(yǎng)液的容器中。通過將60μ1 FuGene脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Roche Biochemicals, Indianapolis, IN)逐漸地溶解到Iml的Ix無血清RPMI 1640培養(yǎng)液中準(zhǔn) 備轉(zhuǎn)染預(yù)混合物(pre-mix)。如實(shí)施例1與2所述，具有與不具有抗-EGFP前體微核糖核酸 插入片段的SpRNAi-RGFP載體(20 μ g)與上述預(yù)混合物溶液混合并置于冰上，30分鐘后直 接導(dǎo)入容器中的斑馬魚幼魚。所有三個(gè)劑量(共60yg)以12小時(shí)間隔給予，在第一次轉(zhuǎn) 染60小時(shí)后收集樣本。實(shí)施例7流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶作用后、沉淀并通過Iml在PBS中的預(yù)冷的70%甲醇在_20°C重 懸1小時(shí)固定。將細(xì)胞沉淀以并Iml PBS洗滌一次。將細(xì)胞再一次沉淀并以Iml在PBS中 的lmg/ml的碘化丙啶及0. 5mg/ml RNase在37°C重懸30分鐘。約有15，000個(gè)細(xì)胞經(jīng)BD FACSCalibur (San Jose, CA)分析。雙聯(lián)體細(xì)胞通過脈沖寬度對脈沖面積作圖并對單細(xì)胞設(shè) 定閘門口徑而排除。收集的資料通過Flowjo軟件包及Watson Pragmatic算法(algorithm) 分析。實(shí)施例八8去氧核糖核酸(DNA)甲基化試驗(yàn)本發(fā)明首先使用DNA分離試劑盒(Roche，IN)分離細(xì)胞的基因組。基因組DNA樣 本可以通過將試驗(yàn)細(xì)胞孵育在55°C的IOmM Tris-HCl (pH 8. 0) UOmM EDTA和0. 2mg/ml蛋 白酶K溶液中3小時(shí)，接著用乙醇沉淀而制備。之后將分離的基因組分別在37°C用CCGG切 位的限制酶Hpa II (10U)作用4小時(shí)。將得到的DNA片段通過的瓊脂糖凝膠電泳所分 離。為了確定0ct3/4啟動子區(qū)域的甲基化位點(diǎn)，本發(fā)明進(jìn)一步用酸式亞硫酸鹽(CpGenome DNA修飾試劑盒，Chemicon, CA)處理分離的基因組DNA。接著通過PCR(長模板PCR延長 試劑盒，Roche, IN)與兩條正向引物 5，-GAGGAGTTGA GGGTACTGTG-3，及 5’ -GAGGAGCTGA GGGCACTGTG-3，與一條相反引物 5，-GTAGAAGTGC CTCTGCCTTC C-3，來分離 0ct3/45，端上 游啟動子區(qū)域。細(xì)胞基因組(IOOng)首先與引物(全部150pmole)混合于Ix PCR緩沖液， 并加熱至94°C 4分鐘，然后立刻用冰冷卻。之后進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下 920C 1分鐘；55°C 1分鐘；以及70°C 5分鐘。得到的PCR產(chǎn)物通過PCR純化試劑盒(Qiagen， CA)收集，并以等量的多重ACGT切位的限制酶(每一種5U)的混合物消化，限制酶混合物包 含 AclI (AACGTT)、BmgBI (CACGTC)、PmlI (CACGTG)、SnaBI (TACGTA)及 HpyCH4IV(ACGT)。得 到的DNA片段經(jīng)由3%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得的。實(shí)施例9微核糖核酸微矩陣分析人類PC3及Colo細(xì)胞株從美國菌種保藏中心(ATCC，Rockville, MD)獲得，而 hpESC細(xì)胞通過胰蛋白酶分離發(fā)明人的手臂皮膚外植體得到。在70%匯合率時(shí)，小核糖 核酸使用mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion, Inc.，Austin, TX)按照廠商建議從每 株細(xì)胞株中分離。小核糖核酸的純度及品質(zhì)經(jīng)由甲醛瓊脂糖凝膠電泳及光譜分析儀 (Bio-Rad, Hercules, CA)來評估，之后送至 LC Sciences (San Diego, CA)以進(jìn)行微核糖核酸微矩陣分析。每一微矩陣芯片雜交標(biāo)記Cy3或Cy5的單一樣本或雜交標(biāo)定標(biāo)記的Cy3或 Cy5的一對樣本。消除背景并標(biāo)準(zhǔn)化(normalization)。對于雙樣本分析(dual sample assay)，計(jì)算ρ-值，獲得差異表達(dá)超過3倍的轉(zhuǎn)錄物。實(shí)施例10基因微矩陣分析為了制備用于微矩陣雜交標(biāo)記的探針，將提取出來的總核糖核酸(2yg)使用 Superscript Choice system kit (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)及修飾后的寡(dT)24_T7 啟動子引物(如 5' -GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA GGGAGGCGG-(dT)24_3‘ (SEQ. ID. NO. 50))按照廠商的方案轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA。將雙鏈cDNAs用酚/氯仿提取純化后， 利用乙醇沉淀，用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的ddH20以濃度為0.5yg/y 1重懸沉淀。 Phase-Lock Gel (5‘引物一3'引物，Inc.，Boulder，C0)用于所有有機(jī)體提取物以增加回 收率。體外轉(zhuǎn)錄在以下條件中進(jìn)行T7核糖核酸聚合酶與1μ g的cDNA、7. 5mM未標(biāo)記的 ATP和GTP、5mM未標(biāo)記的UTP和CTP及2mM生物素標(biāo)記的CTP及UTP (生物素-11-CTP、生 物素-16_UTP，Enzo Diagnostics)。在 37°C 反應(yīng) 4 小時(shí) cRNA 利用 RNeasy 旋轉(zhuǎn)柱(Qiagen, CA)純化。樣品經(jīng)的瓊脂糖凝膠分離以檢測尺寸大小，接著在40mM Tris-醋酸鹽、pH 8. OUOOmM K0Ac/30mMMg0Ac中將μ g的cRNA加熱到94°C 35分鐘而使其隨機(jī)斷裂成平均 50個(gè)堿基的大小。利用含有總計(jì)32668個(gè)基因的一組四個(gè)寡核苷酸的微矩陣(GeneChip U133A&Barrays, Affymetrix, Santa Clara, CA)進(jìn)行雜交，雜交反應(yīng)是于 200 μ 1 的 AFFY 緩 沖液(Affymetrix)于40°C中16小時(shí)連續(xù)攪動下完成。在雜交反應(yīng)完成后，_用200 μ 1 的 6x SSPE-T 緩沖液(Ix 0. 25Μ 氯化鈉 /15mM 磷酸鈉、pH 7. 6/lmM EDTA/0. 005% Triton) 洗滌3次，接著用200 μ 1的6x SSPE-T緩沖液于50°C洗滌一小時(shí)。接著用0. 5X SSPE-T 洗滌矩陣兩，并用0. 5x SSPE-T于50°C沖洗15分鐘。用2 μ g/ml鏈霉親合素-藻紅素 (Molecular Probes)及 lmg/ml 乙?；疊SA(Sigma)于6x SSPE-T(pH 7.6)中進(jìn)行染色，將矩 旌用共聚焦掃描儀(Molecular Dynamics)在 7. 5 μ m 處閱讀并以 Affymetrix Microarray Suite version 4. 0軟件進(jìn)行分析。通過完全配對探針與非配對探針的總平均差將樣本標(biāo) 準(zhǔn)化。收集信號差異大于兩倍的信號。實(shí)施例11細(xì)胞分化測試本發(fā)明所有的細(xì)胞株皆培養(yǎng)于無酚紅的DMEM培養(yǎng)液(10%炭吸附的胎牛血清 (10% (FBS))，在70%匯合率時(shí)，不同的荷爾蒙及生長因子被分別添加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，如 50ng/ml DHTU00ng/ml TGF-β 1 及 / 或 100ng/ml BMP4。經(jīng)過 6 到 12 個(gè)小時(shí)培養(yǎng)，經(jīng)處理 后的細(xì)胞在胰蛋白酶作用，以4等份的200 μ 1 Ix PBS溶液收集后，立刻植入6周大無胸腺 免疫缺陷的SCID米黃色小鼠的頸部皮膚、尾部靜脈、子宮及肝臟中。實(shí)施例12統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以平均值士SE表示。通過單因素方差分析(one-way AN0VA)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分 析。當(dāng)具有統(tǒng)計(jì)上顯著差異時(shí)，Durmett's post-hoc test被用來辨認(rèn)與對照具有顯著差異 的組。為了在兩組處理組之間進(jìn)行配對比較，使用雙側(cè)配對t檢驗(yàn)(two-tailed sudent t test)。為了比較超過兩組的處理組，ANOVA分析后再post-hoc進(jìn)行多范圍檢驗(yàn)(post-hoc multiple range test)。概率值ρ < 0. 05被認(rèn)定為具有統(tǒng)計(jì)上的意義，所有ρ值是藉由雙 側(cè)檢驗(yàn)確定。
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31.U. S. Pat. No. 6，875，607 to Reubinoff.
應(yīng)當(dāng)理解的是本文中所述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅僅用于說明的目的，對于它們的 各種修飾和改變對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們屬于本發(fā)明的宗旨并被包
37含在所附權(quán)利要求限定的范圍。本文中所引用的所有出版物和專利文獻(xiàn)以其全文的方式引 入作為參考。
權(quán)利要求
一種用于誘導(dǎo)哺乳細(xì)胞中內(nèi)含子的mir 302介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)的轉(zhuǎn)基因方法，該方法包含以下步驟a.建構(gòu)重組核酸組合物，該重組核酸組合物包含至少一個(gè)編碼mir 302 類似基因沉默效應(yīng)物的內(nèi)含子，該內(nèi)含子與外顯子側(cè)翼連接，其中該內(nèi)含子能經(jīng)切除后與該外顯子分離以誘導(dǎo)mir 302介導(dǎo)的基因沉默；b.將該重組核酸組合物克隆到表達(dá)載體中；以及c.將該表達(dá)載體導(dǎo)入多個(gè)哺乳細(xì)胞中，其中該細(xì)胞產(chǎn)生多個(gè)該重組核酸組合物的初級RNA轉(zhuǎn)錄物，其中該細(xì)胞將該內(nèi)含子從該初級RNA轉(zhuǎn)錄物中剪接出來，以對含有與mir 302 類似基因沉默效應(yīng)物互補(bǔ)的序列的基因產(chǎn)生mir 302介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)，這因而導(dǎo)致該細(xì)胞重編程成多個(gè)類干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該哺乳細(xì)胞為人類細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該哺乳細(xì)胞為體細(xì)胞。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該哺乳細(xì)胞為癌細(xì)胞。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該內(nèi)含子的mir-302-類似基因沉默效應(yīng)物是合成 DNA序列。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括合成該內(nèi)含子或該外顯子序列或者 二者的核酸組成的步驟。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該重組核酸組合物為重組的細(xì)胞基因。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該重組核酸組合物為衍生自以下基因的重組基 因綠色螢光蛋白基因、病毒基因、哺乳基因、跳躍基因、轉(zhuǎn)座子及它們的組合。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該內(nèi)含子是通過遺傳工程方法所建構(gòu)的，該遺傳 工程方法選自DNA限制酶處理及連接、同源重組、轉(zhuǎn)基因摻入、轉(zhuǎn)座子插入、跳躍基因整合、 反轉(zhuǎn)錄病毒感染以它們的組合。
10.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該內(nèi)含子是含有編碼以下序列的內(nèi)含子插入片 段組成的核酸序列mir-302-類似基因沉默效應(yīng)物、分支點(diǎn)模體、多嘧啶串、供體剪接位點(diǎn) 及受體剪接位點(diǎn)。
11.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中該內(nèi)含子插入片段是含有同源于SEQ.ID. NO. 1 或SEQ. ID. NO. 2的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾樣核酸序列。
12.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中該內(nèi)含子插入片段是含有與SEQ.ID. NO. 3同源 或互補(bǔ)或既同源又互補(bǔ)的核酸序列。
13.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中該內(nèi)含子插入片段是含有選自以下核酸序列的 發(fā)夾樣前體微RNA序列SEQ. ID. NO. 9,SEQ. ID. NO. 10,SEQ. ID. NO. 11,SEQ. ID. NO. 12 及 SEQ. ID. NO. 13。
14.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中該內(nèi)含子插入片段是通過至少一個(gè)限制酶切位 點(diǎn)/克隆位點(diǎn)摻入到該內(nèi)含子中的，所述限制酶切位點(diǎn)/克隆位點(diǎn)選自AatII、ACCI、Af 111/ III、Agel、Apal/LI、Asel、Asp718I、BamHI、Bbel、BclI/II、Bglll、BsmI、Bspl20I、BspHI/ LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/Ul/XI、Clal、Csp6I、DpnI, Dral/II、EagI, Ecll36II、EcoRI/RII/47III、Ehel、Fspl、Haelll、Hhal、HinPI、Hindlll、Hinfl、Hpal/II、 KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、Nsi I、PmlI、PpulOI、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、 StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI切割位點(diǎn)及它們的組合。
15.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中該分支點(diǎn)為位于包含或同源于SEQ.ID. NO. 6序 列的核酸序列中的腺苷酸。
16.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中該分支點(diǎn)為位于包含至少一個(gè)與 5’ -TACTAAC-3’同源的寡核苷酸模體的核酸序列中的腺苷酸。
17.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中該多嘧啶串為具有高含量的胸腺嘧啶與胞嘧啶 的核酸序列，該核酸序列包含或同源于SEQ. ID. NO. 7或SEQ. ID. NO. 8序列。
18.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中該供體剪接位點(diǎn)為包含或同源于SEQ.ID. NO. 4 序列的核酸序列。
19.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中該供體剪接位點(diǎn)為包含或同源于5’-GTAAG-3’ 的核酸序列。
20.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中該受體剪接位點(diǎn)為包含或同源于SEQ.ID. NO. 5 序列的核酸序列。
21.按照權(quán)利要求10所述的方法，其中該受體剪接位點(diǎn)為包含或同源于5’-CTGCAG-3’ 的核酸序列。
22.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該mir-302-類似基因沉默效應(yīng)物為包含或互補(bǔ) 于或既包含又互補(bǔ)于SEQ. ID. NO. 3的核酸序列。
23.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該mir-302-類似基因沉默效應(yīng)物為包含SEQ. ID. NO. 10、SEQ. ID. NO. 11、SEQ. ID. NO. 12 及 / 或 SEQ. ID. NO. 13 的核酸序列。
24.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該mir-302-類似基因沉默效應(yīng)物為包含SEQ. ID. NO. 9的核酸序列。
25.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該表達(dá)載體選自DNA轉(zhuǎn)基因、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn) 錄轉(zhuǎn)座子、跳躍基因、病毒載體及它們的組合。
26.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該載體包含病毒或II型RNA聚合酶啟動子或兩 者、科扎克共有翻譯起始位點(diǎn)、多腺苷酸化信號及多個(gè)限制酶切/克隆位點(diǎn)。
27.按照權(quán)利要求26所述的方法，其中該限制酶切/克隆位點(diǎn)是用于選自以下內(nèi)切 酶作用的寡核苷酸切割結(jié)構(gòu)域AatII、AccI, AflII/ΙΙΙ、Age I, Apal/LI、Asel、Asp718I、 BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bspl20I、BspHI/LUllI/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、 BstBI/Ul/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecll36II、EcoRI/RII/47III、EheI、FspI、 HaeII I、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、 MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、PpulOI、PstI、PvuI/II、RsaI、 SacI/II、Sail、Sau3AI、SmaI> SnaBI> SphI> Sspl、StuI> Tail、TaqI> XbaI> XhoI> XmaI 限制 酶及它們的組合。
28.按照權(quán)利要求26所述的方法，其中該載體進(jìn)一步包含pUC復(fù)制起始子、用于在復(fù) 制_感受態(tài)的原核細(xì)胞中表達(dá)至少一種抗生素抗性基因的SV40早期啟動子以及任選的用 于在哺乳細(xì)胞中復(fù)制的SV40起始子。
29.按照權(quán)利要求28所述的方法，其中該抗生素抗性基因選自抗以下抗生素的抗生 素的抗生素抗性基因抗青霉素G、氨芐青霉素、新霉素、巴龍霉素、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、斯派克霉素、磷霉素、四環(huán)素、利福平、兩性霉素B、健他霉素、氯霉素、頭孢霉素、泰樂霉 素、G418及它們的組合。
30.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該載體通過基因傳遞方法送入該哺乳類細(xì)胞，該 基因傳遞方法選自脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、化學(xué)轉(zhuǎn)染法、轉(zhuǎn)基因DNA重組法、病毒感染法、轉(zhuǎn)座子插 入法、跳躍基因轉(zhuǎn)染法、微注射法、電穿孔法、基因槍穿透法及它們的組合。
31.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該重組核酸組合物的該初級RNA轉(zhuǎn)錄物是經(jīng)由一 轉(zhuǎn)錄機(jī)制而產(chǎn)生，該轉(zhuǎn)錄機(jī)制選自II型核糖核酸聚合酶轉(zhuǎn)錄機(jī)制、III型核糖核酸聚合酶轉(zhuǎn) 錄機(jī)制、I型核糖核酸聚合酶轉(zhuǎn)錄機(jī)制及病毒核糖核酸聚合酶轉(zhuǎn)錄機(jī)制。
32.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該重組核酸組合物的該初級RNA轉(zhuǎn)錄物是核糖核 苷酸序列，該核糖核苷酸序列選自信使核糖核酸、不均一核核糖核酸、核糖體核糖核酸、轉(zhuǎn) 移核糖核酸、小核仁核糖核酸、小核核糖核酸、前體微核糖核酸、病毒核糖核酸及上述核糖 核酸的衍生物及前體。
33.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該mir-302-類似基因沉默效應(yīng)物是通過內(nèi)含子 切除機(jī)制從該內(nèi)含子中釋出，該內(nèi)含子切除機(jī)制選自核糖核酸剪接、外來體消化及無義介 導(dǎo)降解加工以及它們的組合。
34.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該mir-302介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)是由細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄 后基因沉默、翻譯抑制、RNA干擾及/或無義介導(dǎo)降解機(jī)制導(dǎo)致的。
35.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該類干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞表達(dá)mir-302微核糖核酸。
36.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該類干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記 Oct3/4、SSEA-3 及 SSEA-4。
37.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該類干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞培養(yǎng)于無飼養(yǎng)層細(xì)胞 培養(yǎng)環(huán)境中。
38.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該類干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%炭吸 附胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)環(huán)境中。
39.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該類干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞能分化為類生殖細(xì)胞。
40.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該類干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞能分化為類精原細(xì)胞。
41.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該類干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞能分化為類成纖維細(xì)胞。
42.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該類干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞能分化為類軟骨細(xì)胞。
43.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該類干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞能分化為類胚樣體細(xì) 胞群。
44.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該mir-302-類似基因沉默效應(yīng)物與mir-93、 mir-367、mir-371、mir-372、mir-373及mir-520家族成員享有一定同源性靶基因。
45.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中該類干細(xì)胞的多潛能細(xì)胞通過使用mir-302微核 糖核酸作為標(biāo)記而選擇性地分離。
46.一種用于誘導(dǎo)內(nèi)含子的mir-302介導(dǎo)基因沉默的重組核酸組合物，該組合物包含 至少一種編碼mir-30-類似基因沉默效應(yīng)物的內(nèi)含子，該內(nèi)含子與外顯子側(cè)翼連接，其中該內(nèi)含子能經(jīng)切除后與該外顯子分離以誘導(dǎo)mir-302介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)，該外顯子能連接形成具有所需功能的基因。
47.按照權(quán)利要求46所述的重組核酸組合物，其中該內(nèi)含子包含(a)編碼mir-302-類似基因沉默效應(yīng)物的內(nèi)含子插入片段；(b)供體剪接位點(diǎn)及受體剪接位點(diǎn)；(c)分支點(diǎn)模體；以及(d)至少一個(gè)多嘧啶串。
48.按照權(quán)利要求47所述的重組核酸組合物，其中該內(nèi)含子插入片段是含有同源于 SEQ. ID. NO. 1或SEQ. ID. NO. 2的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾樣核酸序列。
49.按照權(quán)利要求47所述的重組核酸組合物，其中該內(nèi)含子插入片段含有與SEQ. ID. NO. 3同源或互補(bǔ)或既同源又互補(bǔ)的核酸序列。
50.按照權(quán)利要求47所述的重組核酸組合物，其中該內(nèi)含子插入片段是含有選自以 下核酸序列的核酸序列的發(fā)夾前體微核糖核酸序列SEQ. ID. NO. 9、SEQ. ID. NO. 10、SEQ. ID. NO. 11、SEQ. ID. NO. 12 及 SEQ. ID. NO. 13。
51.按照權(quán)利要求47所述的重組核酸組合物，其中該內(nèi)含子插入片段通過至少一中 限制酶切位點(diǎn)/克隆位點(diǎn)摻入該內(nèi)含子中，該限制酶切位點(diǎn)/克隆位點(diǎn)選自Aatll、AccI, AflII/ΙΙΙ、Agel、Apal/LI、Asel、Asp718I、BamHI, Bbel、BclI/II、Bglll、BsmI, Bspl20I、 BspHI/LUllI/1201、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/Ul/XI、Clal、Csp6I、DpnI, Dral/II、 EagI、Ecll36II、EcoRI/RII/47III、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/ II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、 NruI、Nsi I、PmlI、PpulOI、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、 SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI 切割位點(diǎn)以及它們的組合。
52.按照權(quán)利要求47所述的重組核酸組合物，其中該分支點(diǎn)為位于包含或同源于SEQ. ID. NO. 6序列的核酸序列中的腺苷酸。
53.按照權(quán)利要求47所述的重組核酸組合物，其中該分支點(diǎn)為位于包含至少一個(gè)與 5’ -TACTAAC-3’同源的寡核苷酸模體的核酸序列中的腺苷酸。
54.按照權(quán)利要求47所述的重組核酸組合物，其中該多嘧啶串包含一具有高含量的胸 腺嘧啶與胞嘧啶的核酸序列，該核酸序列包含或同源于SEQ. ID. NO. 7或SEQ. ID. NO. 8序列。
55.按照權(quán)利要求47所述的重組核酸組合物，其中該供體剪接位點(diǎn)為包含或同源于 SEQ. ID. NO. 4的核酸序列。
56.按照權(quán)利要求47所述的重組核酸組合物，其中該供體剪接位點(diǎn)為包含或同源于 5’ -GTAAG-3，的核酸序列。
57.按照權(quán)利要求47所述的重組核酸組合物，其中該受體剪接位點(diǎn)為包含或同源于 SEQ. ID. NO. 5序列的核酸序列。
58.按照權(quán)利要求47所述的重組核酸組合物，其中該受體剪接位點(diǎn)為包含或同源于 5，-CTGCAG-3，的核酸序列。
59.按照權(quán)利要求46所述的重組核酸組合物，其中該mir-302-類似基因沉默效應(yīng)物為 包含同源或互補(bǔ)于或既包含又互補(bǔ)于SEQ. ID. NO. 3的核酸序列。
60.按照權(quán)利要求46所述的重組核酸組合物，其中該mir-302-類似基因沉默效應(yīng)物為 包含 SEQ. ID. NO. 10、SEQ. ID. NO. 11、SEQ. ID. NO. 12 及 / 或 SEQ. ID. NO. 13 的核酸序列。
61.按照權(quán)利要求46所述的重組核酸組合物，其中該類mir-302的基因沉默效應(yīng)物為 包含SEQ. ID. NO. 9的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)于一種用來培育、生成與篩選人類類胚胎干細(xì)胞的方法，該項(xiàng)方法通過使用內(nèi)含子的微核糖樣的RNA試劑的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。具體而言，本發(fā)明是關(guān)于一種用來生成非天然產(chǎn)生的內(nèi)含子的方法與組合物。此內(nèi)含子的組成在哺乳細(xì)胞中能加工成mir-302-類似的RNA分子；因此將導(dǎo)致細(xì)胞中某些與分化相關(guān)和決定命運(yùn)的基因發(fā)生基因沉默效應(yīng)，進(jìn)而使該等細(xì)胞重新編程為類胚胎干細(xì)胞似的多潛能細(xì)胞。所得的類胚胎干細(xì)胞顯著表達(dá)人類胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)計(jì)，如Oct3/4、SSEA-3及SSEA-4，這些細(xì)胞能通過荷爾蒙或生長因子在無飼養(yǎng)層細(xì)胞的情況下體外發(fā)育成各同組織細(xì)胞類型，而這些細(xì)胞可用來進(jìn)行移植或基因治療。因此，本發(fā)明提供一種簡單、有效、安全的基因操縱方法，其不僅可用來將體細(xì)胞重新編程成類胚胎干的多潛能細(xì)胞，亦可在無飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中維持上述細(xì)胞的多潛能性與自我復(fù)制的功能，因而能避免在先前技術(shù)(iPS方法)中中所使用的通過令人厭煩的反轉(zhuǎn)錄病毒將四種巨大轉(zhuǎn)錄因子基因插入單一細(xì)胞。
文檔編號C12N15/113GK101970661SQ200880114042
公開日2011年2月9日 申請日期2008年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日
發(fā)明者吳堂熙, 應(yīng)紹堯, 林希龍 申請人:林希龍;應(yīng)紹堯;吳堂熙