專利名稱：基于聚合酶的單分子測(cè)序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)利用核酸聚合酶的活性，對(duì)單獨(dú)的核酸分子進(jìn)行核酸測(cè)序的 新的熒光光譜法和分析平臺(tái)(基于聚合酶的單分子測(cè)序)。
背景技術(shù)：
人類基因組的首次測(cè)序在生物、生物醫(yī)藥和健康領(lǐng)域開(kāi)啟了一個(gè)新的時(shí)代。這一 偉業(yè)有賴于全世界持續(xù)超過(guò)十年的艱苦努力，并且花費(fèi)了超過(guò)20億美元。近來(lái)，新的技術(shù)， 例如由 Solexa/Illumina、Roche/454 Life Sciences 和 ABI 提供的那些(所說(shuō)的“第二代” 測(cè)序技術(shù))，已經(jīng)成數(shù)量級(jí)地提高了人類基因組測(cè)序的速度并降低了其成本；2008年，這一 成本已達(dá)到約100，000美元。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，對(duì)于研究大量個(gè)體、采用測(cè)序用于藥物 基因組學(xué)和個(gè)性化藥物、監(jiān)控個(gè)體一生當(dāng)中基因組的變化(基因組再測(cè)序)、鑒別蛋白質(zhì)的 結(jié)合位點(diǎn)(例如用ChipSeq方法)、發(fā)現(xiàn)新基因和小RNAs的序列編碼以及比較健康細(xì)胞和 腫瘤細(xì)胞的基因組，測(cè)序仍然是一種非常昂貴的方法。為了使這些應(yīng)用更能負(fù)擔(dān)得起，新的 測(cè)序技術(shù)是必需的；這些技術(shù)的絕大多數(shù)包括對(duì)單獨(dú)的DNA分子進(jìn)行測(cè)序，并且往往被稱 為“第三代”測(cè)序技術(shù)。開(kāi)發(fā)此類技術(shù)已受到許多國(guó)家機(jī)構(gòu)的鼓勵(lì)，包括美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究 院(USNational Insitutes of Health)新方案，該方案旨在到2015年開(kāi)發(fā)出能夠在一天 內(nèi)對(duì)人類基因組進(jìn)行測(cè)序且具有99. 9%的準(zhǔn)確性的方法，并且成本僅為1000美元。幾種現(xiàn)有的DNA測(cè)序法都以核酸聚合酶的活性為基礎(chǔ)，核酸聚合酶是從核酸模板 (DNA或RNA)讀取信息，并且把信息復(fù)制到一條新的核酸鏈上的蛋白質(zhì)。例如，DNA聚合酶 (DNAPs)讀取DNA模板中的信息，并將其復(fù)制到新的DNA鏈上；RNA聚合酶(RNAPs)讀取DNA 模板中的信息，并將其復(fù)制到新的RNA鏈上。DNAPs更為普遍地用于測(cè)序；例如，SangerDNA 測(cè)序法(完成人類基因組首次測(cè)序所使用的主要方法)基于DNAP的活性將雙脫氧核苷酸 (作為鏈終止子)加入到新的DNA鏈上?；贒NAP的測(cè)序需要DNA模板和用于起始復(fù)制過(guò) 程的DNA引物。RNAPs已被用于測(cè)序，其使用不太廣泛；基于RNAPs的測(cè)序模式已知為轉(zhuǎn)錄測(cè)序。 在過(guò)去，轉(zhuǎn)錄測(cè)序大量使用(即其中數(shù)十億的分子被同時(shí)探測(cè))；其依賴于常用于RNA體外 合成的被表征清楚的單一亞單位噬菌體RNAPs (例如細(xì)菌噬菌體T7或SP6RNAP)。轉(zhuǎn)錄需要 啟動(dòng)子DNA (可以采用PCR或連接反應(yīng)引入)；然而，比較基于DNA聚合酶的測(cè)序，它不需要 起始引物。此外，轉(zhuǎn)錄測(cè)序與每個(gè)單DNA分子的若干個(gè)測(cè)序讀取結(jié)果(sequencing reads) 相一致，因?yàn)槿舾蒖NAP可以在同一個(gè)DNA上同時(shí)進(jìn)行，因此提高了對(duì)每個(gè)分子可能讀取的 數(shù)量和重新獲得的序列的準(zhǔn)確性。近來(lái)，報(bào)道了采用大腸桿菌RNAP，以高分辨度光鑷設(shè)備進(jìn) 行的原理論證性單分子實(shí)驗(yàn)，表明了單分子轉(zhuǎn)錄DNA測(cè)序的可行性。在這里我們描述了 一種DNA測(cè)序策略，該策略利用了核酸聚合酶進(jìn)行的模板弓I導(dǎo) 的實(shí)時(shí)核酸合成(一種“通過(guò)合成進(jìn)行測(cè)序”的方法)。具體地，我們描述了一種采用了 RNA 合成酶進(jìn)行的單RNA合成的實(shí)施。我們注意到該策略的主要思想與基于其它核酸聚合酶， 例如DNAP和反轉(zhuǎn)錄酶的測(cè)序完全一致。我們描述了用于確定每一個(gè)被加入的堿基的單顏 色方案和多顏色方案。兩種方法都需要表面固定化和全內(nèi)反射熒光(TIRF)顯微術(shù)，包括Kapanidis小組在內(nèi)的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室可以提供這些技術(shù)。此外，兩種方法都基于5’修飾的三 磷酸核苷(NTPs)的有效加入，該5’修飾的三磷酸核苷在每個(gè)NTP的γ-(或磷酸上 攜帶淬滅劑；該淬滅劑能夠借助于熒光的確定堿基，并且在每一個(gè)加入循環(huán)結(jié)束時(shí)被釋放。 專利號(hào)為7，052，847的美國(guó)專利描述了一種對(duì)靶核酸分子進(jìn)行測(cè)序的方法，包括 提供靶核酸分子的混合物、互補(bǔ)引物、核酸聚合酶和在活性位點(diǎn)被加入到不斷延長(zhǎng)的核酸 鏈的多種類型核苷酸；和在適合形成不斷延長(zhǎng)的核酸鏈的條件下，通過(guò)模板引導(dǎo)的引物延 伸，使混合物進(jìn)行聚合反應(yīng)；以及以光學(xué)方法鑒定核苷酸加入到不斷延長(zhǎng)的核酸鏈的時(shí)序。申請(qǐng)?zhí)枮?005/2148849的美國(guó)專利申請(qǐng)描述了用于確定多核苷酸序列的方法， 包括以下步驟在足以誘導(dǎo)酶活性的條件下，將靶多核苷酸與酶反應(yīng)，該酶能夠和多核苷酸 反應(yīng)并且沿著該多核苷酸處理，以及檢測(cè)當(dāng)該酶沿著多核苷酸處理時(shí)酶的構(gòu)象變化。構(gòu)象 變化的檢測(cè)通過(guò)測(cè)定連接到酶上的單一熒光團(tuán)的變化而進(jìn)行。申請(qǐng)?zhí)枮?006/078937的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種用于對(duì)分子序列測(cè)序的方法， 包括將未知序列的核苷酸提供給單分子測(cè)序儀，該測(cè)序儀包含具有共價(jià)地附于其上的熒光 供體的聚合酶和用于該聚合酶的單體；激發(fā)該熒光供體并檢測(cè)發(fā)射的熒光。申請(qǐng)?zhí)枮?006/292583的美國(guó)專利申請(qǐng)描述了一種對(duì)核酸進(jìn)行測(cè)序的方法，包括 將聚合酶附著到基底上；在用于加入到互補(bǔ)核酸中的核苷酸存在下，使得樣品核酸和退火 的寡核苷酸結(jié)合到聚合酶上，其中該聚合酶和核苷酸共同地用供體和受體熒光團(tuán)標(biāo)記，該 熒光團(tuán)在特殊核苷酸被加入到互補(bǔ)核酸時(shí)發(fā)射特定信號(hào)，并且隨著核苷酸被按順序添加到 互補(bǔ)核酸中，檢測(cè)該特定信號(hào)的系列順序。Visigen的申請(qǐng)?zhí)枮?007/0172867的美國(guó)專利申請(qǐng)指出該文描述的測(cè)序體系包 括聚合酶上的熒光標(biāo)簽和dNTPs上的特定淬滅劑，其中優(yōu)選地，該淬滅劑具有對(duì)于該聚合 酶標(biāo)簽的可區(qū)分的淬滅效率。因此，每一個(gè)進(jìn)來(lái)的標(biāo)有淬滅劑的dNTP的種類通過(guò)其聚合酶 熒光標(biāo)簽發(fā)射的特定淬滅效率而確定。檢測(cè)和分析在加入過(guò)程中產(chǎn)生的信號(hào)從而確定每一 個(gè)加入的堿基，信號(hào)的順序產(chǎn)生該DNA堿基順序。然而，在美國(guó)‘867中的公開(kāi)內(nèi)容并沒(méi)有闡明造成可區(qū)分淬滅效率的特定淬滅劑 將如何選擇；淬滅效率是如何測(cè)定的同樣不清楚。即使這兩個(gè)問(wèn)題都被解決了，此基于單 一標(biāo)記的聚合酶的方法也被單一熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度信號(hào)的波動(dòng)混淆，該波動(dòng)是由于熒光團(tuán) 的光物理狀態(tài)和/或構(gòu)象狀態(tài)的變化而發(fā)生的。在單分子熒光領(lǐng)域中被廣泛接受的是熒光 團(tuán)進(jìn)入“暗”狀態(tài)，在此期間它們不發(fā)射熒光或者在此期間它們不吸收光子(從而不發(fā)射熒 光)；這些狀態(tài)可以持續(xù)幾個(gè)微秒(例如三線態(tài))到長(zhǎng)達(dá)幾秒。這一間歇發(fā)射對(duì)于所有基 于聚合酶的方法產(chǎn)生了兩個(gè)重要的問(wèn)題。第一，缺乏來(lái)自單一供體熒光團(tuán)的熒光發(fā)射(對(duì) 于暗_淬滅劑方法)將會(huì)造成在若干堿基對(duì)讀取期間的信息的丟失，在要讀取的序列中產(chǎn) 生了缺口，因此使最終序列不準(zhǔn)確和不可信。第二，毫秒時(shí)間規(guī)模的波動(dòng)將會(huì)造成時(shí)間平均 的熒光強(qiáng)度，其可以造成堿基的不正確確定，這是由于光強(qiáng)度的變化將不僅反映特殊淬滅 劑的存在，而且反映無(wú)關(guān)于核苷酸的熒光強(qiáng)度干擾的發(fā)生。采用雙重標(biāo)記的RNAP和暗-淬 滅劑NTPs的方法，通過(guò)只針對(duì)引起兩種熒光團(tuán)上同時(shí)且相關(guān)的熒光強(qiáng)度變化的情況(即明 顯的信號(hào)降低之后強(qiáng)度上升至返回初始水平)確定堿基，規(guī)避了該問(wèn)題。此外，Visigen專利申請(qǐng)描述了包含聚合酶的組合物，該組合物包括至少一對(duì)分子 標(biāo)簽，該分子標(biāo)簽位于或接近該聚合酶的位點(diǎn)、與該位點(diǎn)相連或共價(jià)地連接于該位點(diǎn)，在該處至少一種所述標(biāo)簽的可檢測(cè)性質(zhì)在單體加入之前、期間和/或之后經(jīng)歷變化。這一總的權(quán)利要求試圖涵蓋多個(gè)帶有標(biāo)簽的聚合酶用于測(cè)序的用途。之后的權(quán)利 要求集中在互補(bǔ)(主要熒光的)探針對(duì)的用途上，該探針對(duì)報(bào)告單體加入過(guò)程中的構(gòu)象狀 態(tài)和構(gòu)象變化；這些變化(據(jù)推測(cè))與特定核苷酸的結(jié)合相聯(lián)系，并且可以確定堿基和提高 堿基確定的準(zhǔn)確性。然而，這些熒光性質(zhì)將如何被翻譯成序列信息也不清楚。此外，雙重標(biāo) 記的聚合酶與暗淬滅劑的結(jié)合應(yīng)用還沒(méi)有描述。

發(fā)明內(nèi)容
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，我們提供了一種用于確定核酸樣品中堿基順序 的分析方法，該分析方法包括采用至少一種熒光團(tuán)、淬滅劑基團(tuán)和核酸聚合酶對(duì)單個(gè)堿基 進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)并推斷所述至少一種熒光團(tuán)的淬滅效率。該淬滅過(guò)程，作為所述分析思想的 核心，建立于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET ；

圖1)上。優(yōu)選地，熒光劑基團(tuán)為暗淬滅劑基團(tuán)。優(yōu)選地，聚合酶被修飾成包括至少一種熒光團(tuán)。該熒光團(tuán)位于或接近于聚合酶上 的一個(gè)位點(diǎn)，在該處該熒光團(tuán)經(jīng)淬滅劑(例如暗淬滅劑)基團(tuán)(標(biāo)記了淬滅劑(如暗淬滅 劑)部分的核苷酸)的結(jié)合而經(jīng)歷熒光變化。例如，至少一種熒光團(tuán)的熒光性質(zhì)(例如由 該熒光團(tuán)發(fā)射的熒光的強(qiáng)度)在該熒光團(tuán)與淬滅劑反應(yīng)之前具有第一值，并在與淬滅劑反 應(yīng)時(shí)具有第二值。優(yōu)選地，聚合酶被修飾成包括多個(gè)熒光團(tuán)，例如熒光團(tuán)對(duì)。本發(fā)明提供了被修飾成 包括至少一種熒光團(tuán)對(duì)的聚合酶，其中該熒光團(tuán)對(duì)相互反應(yīng)，從而在淬滅劑加入之前形成 第一熒光發(fā)射狀況(emission profile)，并在淬滅劑加入后形成第二發(fā)射狀況。通常，該熒光團(tuán)對(duì)中的一個(gè)為受綠光(范圍514-560nm，優(yōu)選在532nm)激發(fā)的熒光 團(tuán)，而另一個(gè)為受紅光(范圍633-647nm，優(yōu)選在638nm)激發(fā)的熒光團(tuán)；我們將這兩個(gè)熒光 團(tuán)分別定義為“綠色”和“紅色”熒光團(tuán)。在光譜的藍(lán)色和紅外區(qū)域被激發(fā)的熒光團(tuán)也和該 分析兼容。該熒光團(tuán)對(duì)在一種或一系列淬滅劑基團(tuán)加入之前、期間和/之后的熒光性質(zhì)被 轉(zhuǎn)化成與該核酸樣品中的核苷酸序列互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸或一條核苷酸序列的識(shí)別 fn息o優(yōu)選地，該分析利用兩種熒光團(tuán)。這些熒光團(tuán)應(yīng)該與單分子熒光檢測(cè)兼容；這意味 著熒光團(tuán)(或者，如果其由多于一個(gè)熒光部分組成則為熒光體系)應(yīng)該是光穩(wěn)定的和明亮 的；此類熒光團(tuán)通常被在可見(jiàn)范圍(400-800nm，例如400-700nm)的激發(fā)源所激發(fā)，盡管采 用近紅外波長(zhǎng)(700-350 iim，例如800-1. 2 ym)可激發(fā)的熒光團(tuán)也可以是可用的?？梢栽诖似脚_(tái)使用的熒光團(tuán)可以選自(但不限于)5_羧基熒光素(FAM)、四甲 基羅丹明(TMR)、Alexa-Fluor 熒光團(tuán)(例如 Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、 Alexa568、Alexa594 禾口 Alexa647 ；可從 MolecularProbes/Invitrogen 購(gòu)買)，B0DIPY 染料、 ATT0 染料(例如 ATT0532、ATT0568、ATT0594 和 ATT0647n ；可從 Atto-tec 購(gòu)買)，花青染料 (例如 Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5 和 Cy7 ；可從 GE Healthcare 購(gòu)買)以及量子點(diǎn)。 盡管熒光團(tuán)的數(shù)目可以改變，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，我們提供由1種熒光團(tuán)(單一顏色 方法)或2種熒光團(tuán)(雙重顏色方法)組成的分析方法，盡管對(duì)于采用多種熒光團(tuán)/顏色 而言也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。優(yōu)選的熒光團(tuán)對(duì)可以包含熒光團(tuán)Cy3B和ATT0647n。
與Visigen的專利申請(qǐng)相比，本文描述的發(fā)明并不依賴于放置在聚合酶上的熒光 團(tuán)探針對(duì)中組成部分的相互作用或互補(bǔ)性(例如不需要兩個(gè)探針之間的FRET)，并且不依 賴于單體加入過(guò)程中構(gòu)象變化的存在。然而，如果存在的FRET被認(rèn)為是能夠確定堿基順 序的時(shí)間記錄分析中的參數(shù)，那么本發(fā)明與放置在聚合酶上的探針之間存在FRET是兼容 的。此外，本發(fā)明清楚地描述了在光譜上相區(qū)別的兩種熒光探針有差別淬滅的基礎(chǔ)上，單體 的種類是如何得以確定的，其中探針被加入到核酸聚合酶上，例如T7RNA聚合酶或DNA聚合 酶。淬滅劑基團(tuán)是被修飾的核苷酸，特別是用淬滅劑部分標(biāo)記的核苷酸。優(yōu)選地，淬滅 劑基團(tuán)是暗淬滅劑基團(tuán)。暗淬滅劑基團(tuán)是被修飾的核苷酸，特別是被暗淬滅劑部分標(biāo)記的 核苷酸。如本文所用“暗淬滅劑部分”是發(fā)色團(tuán)，該發(fā)色團(tuán)淬滅至少一種熒光團(tuán)的熒光，而 不發(fā)射光。暗淬滅劑部分是在電磁輻射頻譜的可見(jiàn)區(qū)具有強(qiáng)吸光率的發(fā)色團(tuán)。同樣地，該暗 淬滅劑能夠通過(guò)發(fā)揮熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)受體的作用，降低一種或多種熒光團(tuán)的熒 光強(qiáng)度和熒光壽命；重要的是，暗淬滅劑既不經(jīng)直接激發(fā)也不經(jīng)基于FRET的激發(fā)發(fā)出熒 光。暗淬滅劑部分附著于核苷酸，主要是三磷酸核苷(NTP)或脫氧三磷酸核苷(dNTP)。暗淬 滅劑將能夠淬滅單一熒光團(tuán)(對(duì)于單一顏色方法)和2種熒光團(tuán)(對(duì)于雙重顏色方法)的 熒光。優(yōu)選的是淬滅劑部分共價(jià)地連接于核苷酸的Y磷酸基團(tuán)或核苷酸的3磷酸基團(tuán)。優(yōu) 選的是針對(duì)每一種核苷酸類型的淬滅劑部分是不同的，例如針對(duì)A、C、G和T/U的淬滅劑部 分是不同。暗淬滅劑可以改變，但是可以選自(但不限于)DABCYL、BHQ1、BHQ2、QSY7、QSY9、 QSY21、QSY35、BHQ0、BHQ1、BHQ2、QXL680、ATT0540Q、ATT0580Q、ATT0612Q、DYQ660 和 DYQ661 ； 最后5種淬滅劑作為核苷酸的磷酸衍生物是可商購(gòu)的(來(lái)自Jena Biosciences).在 本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的方面，在本發(fā)明的分析中至少存在四種淬滅劑基團(tuán)。優(yōu)選地，所述至 少四種淬滅劑基團(tuán)中的每一種都是不同的。例如，淬滅劑基團(tuán)中的每一種包括淬滅劑部分 和核苷酸，它們不同于其它淬滅劑基團(tuán)的淬滅劑部分和核苷酸。優(yōu)選地，在本發(fā)明的分析中 采用的一組淬滅劑基團(tuán)包括用于核苷酸A、G、C和T/U中每一種的淬滅劑基團(tuán)。盡管可以采用多種核苷酸部分，但核苷酸部分可以選自三磷酸腺苷、三磷酸胞苷、 三磷酸鳥(niǎo)苷、三磷酸尿苷、三磷酸脫氧腺苷、三磷酸脫氧胞苷、三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷和三磷酸脫 氧胸苷。該分析和任何可以被加入到新生核酸中且可以報(bào)告作為模板的核苷酸種類的核 酸_聚合酶識(shí)別的部分兼容。優(yōu)選地，堿基是DNA或RNA中的胺類堿基。因此，聚合酶可以選自DNA聚合酶、RNA 聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶。優(yōu)選地，該聚合酶是RNA聚合酶。又一優(yōu)選地，該聚合酶是DNA聚合酶。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于確定核酸樣品的核酸序列的方法，該方法包 括以下步驟i)提供一種組合物，該組合物包含例如DNA樣品的核酸樣品，和被修飾的聚合酶， 其中所述被修飾的聚合酶包括第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)；ii)將i)中的組合物與至少一種淬滅劑(例如暗淬滅劑)基團(tuán)相接觸；和iii)檢測(cè)第一和第二熒光基團(tuán)在步驟ii)之前、期間和/或之后的熒光性質(zhì)的變 化(例如檢測(cè)或推斷淬滅效率)；和iv)任選的，將iii)中的信息轉(zhuǎn)化成與核酸樣品中核苷酸序列互補(bǔ)的一種或多種核苷酸的識(shí)別信息。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法中，該方法包括用激發(fā)源激發(fā)該熒光團(tuán)的步驟。熒光團(tuán)的熒光性質(zhì)的變化可以包括熒光的持續(xù)時(shí)間、熒光的強(qiáng)度和/或熒光的頻率。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法中，存在至少四種淬滅劑基團(tuán)。優(yōu)選地，至少四種淬滅劑 基團(tuán)中的每一種都是不同的。例如，淬滅劑基團(tuán)的每一種包括淬滅劑部分和核苷酸，它們不 同于其它淬滅劑基團(tuán)的淬滅劑部分和核苷酸。優(yōu)選地，在本發(fā)明的分析中采用的一組淬滅 劑基團(tuán)包括用于核苷酸A、G、C和T/U中的每一種的淬滅劑基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，我們提供了核苷三磷酸(NTP)探針，該NTP探針由具有 附著于其上的熒光團(tuán)部分的NTP和淬滅劑部分組成，該淬滅劑部分充分接近熒光團(tuán)以阻止 或阻礙熒光團(tuán)的熒光；優(yōu)選地，該NTP探針包括至少4種如前所述的接近的淬滅部分。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，我們提供了一種試劑盒，該試劑盒包含一種或多種熒 光團(tuán)部分和被附著的NTPs ；多種，例如四種，相連的淬滅劑和至少一種聚合酶。在本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了被修飾的聚合酶，例如被修飾的RNA聚合酶，其中 被修飾的聚合酶包含已被修飾成包含多個(gè)熒光團(tuán)的聚合酶，例如，如本文限定的熒光團(tuán)對(duì)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了被修飾的聚合酶的應(yīng)用，例如在核酸(如DNA)測(cè) 序中的RNA聚合酶。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含被修飾的聚合酶和至少一種淬滅劑(如暗淬 滅劑)基團(tuán)的試劑盒。優(yōu)選地，該試劑盒包含一組淬滅劑(例如暗淬滅劑)基團(tuán)，其中該組 包含至少4種淬滅劑基團(tuán)(例如如本文所限定的暗淬滅劑基團(tuán))。發(fā)明詳述如所討論的，該平臺(tái)與多種核酸聚合酶兼容。將詳細(xì)描述采用RNAP的實(shí)施方案。 用于基于RNAP的單分子DNA測(cè)序的代表性方法包含下列步驟1)將被修飾的基因組DNA、擴(kuò)增的DNA或合成DNA固定在固相支持物上；2)將熒光標(biāo)記的RNAP引入并將RNAP結(jié)合到啟動(dòng)子DNA上；3)引入淬滅劑修飾的核苷酸；4)開(kāi)始RNA合成，之后進(jìn)行RNA的延伸，期間通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度水平讀取DNA序 列。如所描述的，該方法的實(shí)施需要被修飾的轉(zhuǎn)錄組分。一組代表性的試劑將包括1)被修飾成加入啟動(dòng)子和固定化標(biāo)簽的基因組DNA ；2)熒光標(biāo)記的RNAP ；3) 4種淬滅劑修飾的NTPs ；DNA制備和表面固定化為了制備被修飾的基因組DNA，該基因組DNA將被連接到短(例如30_50個(gè)堿基 對(duì))雙鏈DNA序列上，該序列含有用于將要采用的RNAP的強(qiáng)啟動(dòng)子序列；這一操作采用商 業(yè)試劑且為常規(guī)方法。此外，被添加的短DNA將含有表面固定化標(biāo)簽(例如生物素部分)， 該標(biāo)簽將DNA錨定在被修飾的固相支持物上。該固相支持物(例如石英或玻璃)已被修飾 以防止生物分子(聚合酶、NTPs、DNA)的非特異性吸收；這通過(guò)采用公開(kāi)的方法實(shí)現(xiàn)，這些 方法采用結(jié)合了低比率( )被修飾的親水聚合物(例如生物素-PEG)的親水聚合物(例如聚乙二醇，PEG)，該親水聚合物使得被修飾的生物分子被特異性固定。在優(yōu)選的情況 中，除一層鏈霉親和素或中性鏈親和素(一種和生物素結(jié)合非常緊密的蛋白質(zhì))外，還包括 生物素-PEG的使用，提供了用于生物素化DNA片段或生物素化聚合酶特異性附著的位點(diǎn)。 這一策略使得被修飾的基因組DNA穩(wěn)定且特異地固定在表面上，并且使得采用寬場(chǎng)激發(fā)的 熒光的成像和所發(fā)射的熒光的成像得以實(shí)現(xiàn)。在分析的另一種形式中，熒光RNAP被固定在固相支持物上(例如采用生物素_鏈 霉親和素相互作用或六聚組氨酸標(biāo)簽_Ni2+ 次氮基三乙酸相互作用)，之后使得該基因組 DNA形成RNAP-DNA相互作用，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄以及RNA向前延伸；后一過(guò)程是能夠讀取DNA序列 的過(guò)程。核酸聚合酶的熒光標(biāo)記為了制備熒光標(biāo)記的RNAP，在RNAP上產(chǎn)生了 一個(gè)或多個(gè)特異性反應(yīng)位點(diǎn)；之后 這些位點(diǎn)能夠與一種或多種熒光團(tuán)的特異性反應(yīng)形式發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生被標(biāo)記的RNAP衍生 物。為了制備單一或雙重標(biāo)記的RNAP，采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，即定點(diǎn)突變來(lái)產(chǎn)生沒(méi)有表 面可接近半胱氨酸的RNAP衍生物。對(duì)于多種聚合酶(包括T7RNAP、Klentaq DNAP和DNAP I的Klenow片段)而言，此類衍生物都已提供。作為一個(gè)具體例子，T7RNAP已被修飾以去 除其12個(gè)天然半胱氨酸殘基中的7個(gè)；這一蛋白質(zhì)衍生物(“少Cys的T7RNAP”)已經(jīng)基 本上不含暴露于表面的半胱氨酸了。對(duì)不含暴露于表面的半胱氨酸的聚合酶衍生物進(jìn)行修飾(采用定點(diǎn)突變)以產(chǎn)生 具有一個(gè)或多個(gè)暴露于表面的半胱氨酸的聚合酶衍生物。用于突變的半胱氨酸取代位點(diǎn)基 于以下考慮進(jìn)行選擇熒光團(tuán)到核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的距離并且保證原始氨基酸(在對(duì)半胱氨 酸進(jìn)行突變之前)并不是保守的或不會(huì)顯著地干擾聚合酶折疊或干擾其聚合活性。作為一 個(gè)具體例子，能夠獲得T7RNAP延伸復(fù)合物在加入的核苷酸(IsOv)存在時(shí)其已公開(kāi)的晶體 結(jié)構(gòu)，使得可以精確選擇將要標(biāo)記的位點(diǎn)從而使該基于熒光的分析的信號(hào)最大化。為了產(chǎn)生單一標(biāo)記的RNAP，RNAP的具有單一暴露于表面的半胱氨酸的衍生物與 熒光團(tuán)的馬來(lái)酰亞胺(或碘乙酰胺)衍生物反應(yīng)。這一方法已被用于產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)衍生 物，這些蛋白質(zhì)衍生物在多個(gè)興趣位點(diǎn)上具有引入的單一暴露于表面的半胱氨酸。T7RNAP 和其它生物噬菌體RNAPs (例如SP6和T3RNAPS)的高同源性使得類似方法得以用于廣泛的 單一亞基RNAP?！┒鄠€(gè)暴露于表面的半胱氨酸被引入到興趣位點(diǎn)，通過(guò)和可商購(gòu)熒光團(tuán)的馬來(lái) 酰亞胺(或碘乙酰胺)衍生物相互作用，將它們進(jìn)行標(biāo)記以制備多重標(biāo)記的聚合酶。例如， 對(duì)于雙重標(biāo)記的RNAP，可以用“綠色”(G)和“紅色”(R)熒光團(tuán)對(duì)暴露于表面的兩個(gè)半胱氨 酸進(jìn)行標(biāo)記。如果該兩個(gè)半胱氨酸的反應(yīng)性基本不同，那么將使用等摩爾量(或小量摩爾 過(guò)量，在第一反應(yīng)熒光團(tuán)超過(guò)蛋白質(zhì)的50-100%量級(jí)上)主要標(biāo)記反應(yīng)性最強(qiáng)的位點(diǎn)；在 第一反應(yīng)完成之后(即超過(guò)2小時(shí)孵育之后)，之后加入的第二反應(yīng)熒光團(tuán)將和反應(yīng)性最弱 的位點(diǎn)反應(yīng)，產(chǎn)生位點(diǎn)特異性雙重標(biāo)記的聚合酶；自由和未反應(yīng)的熒光團(tuán)采用過(guò)量的含硫 醇試劑(例如二硫蘇糖醇或巰基乙醇)進(jìn)行淬滅并采用例如凝膠過(guò)濾或透析的標(biāo)準(zhǔn)方 法去除。此類方法已被用于標(biāo)記DNAPI的Klenow片段。在Allen等人的Protein Sci. 2008 Mar ； 17 (3) :401_8中描述了用雙重?zé)晒鈭F(tuán)標(biāo) 記的DNA聚合酶。
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還可以采用在蛋白質(zhì)中引入用于位點(diǎn)特異性標(biāo)記的位點(diǎn)的其它方法，例如采用 CCPGCC基序用于用雙砷熒光試劑的標(biāo)記和引入(His)n>5(聚組氨酸)基序用于用鎳-次氮 基三乙酸熒光試劑的標(biāo)記。如果熒光團(tuán)位點(diǎn)特異性地被加入到存在于整個(gè)轉(zhuǎn)錄通路的RNAP 核心機(jī)制中，多亞基RNAPs，例如大腸桿菌RNAP也可以被用于該分析。標(biāo)記也可以是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的導(dǎo)致GG-、GR-、RG-和RR-標(biāo)記的種類，這些種類可以在 單分子水平上通過(guò)信號(hào)強(qiáng)度鑒別；在“GR”蛋白質(zhì)衍生物中，第一半胱氨酸(半胱氨酸-1) 用綠色熒光團(tuán)標(biāo)記，而第二半胱氨酸(半胱氨酸-2)用紅色熒光團(tuán)標(biāo)記；在“RG”蛋白質(zhì)衍 生物中，標(biāo)記位點(diǎn)反過(guò)來(lái)。已經(jīng)報(bào)道了這些方法用來(lái)標(biāo)記Klentaq DNAP I。被淬滅劑修飾的核苷酸的制備對(duì)于基于RNAP的方法而言，我們采用可商購(gòu)的淬滅劑修飾的核苷酸(來(lái)自Jena Biosciences)。在暗-淬滅劑無(wú)法商購(gòu)的情況下，淬滅劑-核苷酸衍生物可以通過(guò)將三磷 酸核苷(NTPs)的反應(yīng)形式與若干不同的暗淬滅劑的反應(yīng)形式進(jìn)行孵育而制備。淬滅劑將 被引入到NTPs的磷酸上，并且這樣將不會(huì)在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)期間積累。暗淬滅劑反而將導(dǎo)致 熒光淬滅的發(fā)生，即一旦它們結(jié)合到聚合酶_模板復(fù)合物就開(kāi)始，并且一旦核酸延伸反應(yīng) 的焦磷酸產(chǎn)物的解離就停止。之前已經(jīng)描述了用發(fā)色團(tuán)修飾磷酸并且其化學(xué)性質(zhì)是簡(jiǎn) 單的。還可以將淬滅劑引入到核苷酸的磷酸基團(tuán)中，因?yàn)榱姿岚诤塑账岬牟?分中，并在核酸延伸的每一循環(huán)期間被切除(幾種前述合成路線見(jiàn)美國(guó)6，399，335)。單一轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的成像經(jīng)修飾的基因組DNA在玻璃(或石英)表面的固定使得用于形成RNAP-DNA復(fù)合 物的被標(biāo)記RNAPs和被標(biāo)記核苷酸加入并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。對(duì)于DNA大片段而言，能夠延伸長(zhǎng)DNA 片段的方法(例如流動(dòng)的微流控通道或分子梳的采用)將能夠?qū)υ趩我?DNA片段上的多個(gè) RNAPs的活性進(jìn)行監(jiān)測(cè)。當(dāng)熒光RNAP結(jié)合于固定于表面的DNA時(shí)，可以采用寬場(chǎng)成像方法對(duì)單一 RNAP分 子進(jìn)行成像，而全內(nèi)反射熒光(TIRF)顯微術(shù)是優(yōu)選的。TIRF顯微術(shù)采用在離開(kāi)表面的薄 層里的衰減波激發(fā)和在超敏感照相機(jī)(例如來(lái)自Andor Technology的電子倍增⑶D照相 機(jī)iXon+897)上的寬場(chǎng)成像，以觀察延長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的固定在表面的分子。當(dāng)光線以一個(gè)比臨 界角度大的角度穿過(guò)界面進(jìn)入具有較低折射率的介質(zhì)時(shí)，就產(chǎn)生接近該界面的衰減波，該 場(chǎng)1(d)的強(qiáng)度隨著距離以指數(shù)形式衰減I(d)=乙？"，其中z為距表面的距離，d為特征 深度，一般在lOOnm數(shù)量級(jí)上。因?yàn)樵撍p波隨著距離而迅速衰減，固定在表面上的單一 分子可以在照相機(jī)上成像，而在遠(yuǎn)離該表面的焦平面處由溶液中的分子擴(kuò)散造成的背景很 小。對(duì)于產(chǎn)生用于TIRF顯微術(shù)的衰減波存在幾種方法；優(yōu)選的方法為物鏡型TIRF和棱鏡 型TIRF。物鏡型TIRF采用高數(shù)值孔徑的油浸物鏡(NA ^ 1. 4，60x或100x放大倍數(shù)和超低 熒光背景)以產(chǎn)生平行的窄射束，該窄射束以所需的臨界角度到達(dá)玻璃-水界面；通過(guò)同一 物鏡收集熒光。棱鏡型TIRF采用與石英玻片光學(xué)接觸的棱鏡，以在該玻片的底部激發(fā)熒光 分子；通過(guò)遠(yuǎn)離該棱鏡和激發(fā)源的水浸物鏡(NA1. 2,60-100x放大倍數(shù)；具有遠(yuǎn)工作距離) 收集熒光。而且，使用基于TIRF的成像同時(shí)以及交替激發(fā)“綠色”和“紅色”熒光團(tuán)是通過(guò) 采用同時(shí)或交替由兩個(gè)激光器的激光激發(fā)得以實(shí)現(xiàn)的，其中每個(gè)激光器主要激發(fā)兩個(gè)熒光 團(tuán)中的一個(gè)。在所有TIRF方法中，被固定的分子作為相對(duì)于暗背景具有熒光強(qiáng)度的點(diǎn)出現(xiàn)(圖2B)。重要的是控制pre-生物素和生物素化DNA的濃度以確保被標(biāo)記的復(fù)合物稀疏地覆蓋 在表面上。依據(jù)所使用物鏡的放大倍數(shù)和用于成像的照相機(jī)的數(shù)目，在單一畫面中可以對(duì) 多達(dá)1000個(gè)熒光分子進(jìn)行成像。采用物鏡型TIRF，一般監(jiān)測(cè)30X 30 y m的區(qū)域；棱鏡型方 法可以照亮更大的區(qū)域(100X 100 u m)，其代價(jià)是樣品和成像室操作的復(fù)雜性。在兩個(gè)通道中監(jiān)測(cè)隨時(shí)間的熒光強(qiáng)度使得可以監(jiān)測(cè)綠色和紅色熒光的瞬態(tài)淬滅， 并采用這一信息來(lái)確定堿基。由于從單分子獲得的信息的量與熒光團(tuán)在其由于不可逆的 光化學(xué)反應(yīng)最終光致褪色之前發(fā)射的時(shí)間成比例，我們采用通過(guò)將光致褪色最小化從而最 大化觀察的持續(xù)時(shí)間的測(cè)量條件(緩沖液組合物、氧排除、激發(fā)功率)。為了延長(zhǎng)時(shí)間追蹤 (time traces)的長(zhǎng)度，我們?cè)诜忾]的室進(jìn)行觀察，該室充滿了含有酶促氧清除體系(含有 1665單位的葡萄糖氧化酶、26000單位過(guò)氧化氫酶和葡萄糖)的觀察緩沖液和三線態(tài)清 除劑(TR0L0X， 2mM)。采用這些條件，我們已經(jīng)常規(guī)地獲得了持續(xù)長(zhǎng)于15min的單分子熒 光追蹤；這一延長(zhǎng)的光致褪色壽命應(yīng)該能夠?qū)γ總€(gè)單一熒光RNAP分子進(jìn)行數(shù)千次核苷酸 加入反應(yīng)的連續(xù)監(jiān)測(cè)。T7RNAP的體外轉(zhuǎn)錄速率為 lOOnt/sec，因此原則上，在10分鐘內(nèi)可 以從單一 RNAP分子讀取60，000個(gè)核苷酸。我們目前的儀器使得我們用大于5的信噪比監(jiān) 測(cè)綠色和紅色熒光達(dá)4ms的暴露時(shí)間，這樣應(yīng)該使得我們可信地監(jiān)測(cè)多步驟反應(yīng)，例如通 過(guò)RNAP的核苷酸加入反應(yīng)。如果必要，可以通過(guò)在反應(yīng)期間降低NTPs的濃度降低T7RNAP 的轉(zhuǎn)錄速度。數(shù)據(jù)分析兩個(gè)不同光譜區(qū)域(通常為“綠色”和“紅色”熒光團(tuán)的主要發(fā)射帶)的視場(chǎng)影片 采用照相機(jī)制造商提供的軟件進(jìn)行記錄。之后分析這些影片以獲得適當(dāng)?shù)膱D像配準(zhǔn)、自動(dòng) 化顆粒檢測(cè)和關(guān)聯(lián)以及熒光光度測(cè)定。用在0. 2 y m熒光珠或在微型模板上的測(cè)量進(jìn)行校 準(zhǔn)，獲得適當(dāng)?shù)膱D像配準(zhǔn)。自動(dòng)化顆粒檢測(cè)和關(guān)聯(lián)通過(guò)鑒別在每個(gè)采用順序空間低和高通 濾波器的監(jiān)測(cè)通道中的微粒進(jìn)行，之后在兩個(gè)通道中進(jìn)行最鄰近查找。通過(guò)計(jì)算以顆粒中 心的小圈的總熒光強(qiáng)度對(duì)被鑒別的顆粒進(jìn)行熒光光度測(cè)定(孔徑光度測(cè)定)，并對(duì)背景光 子進(jìn)行校正。在不同的方法中，我們采用二維高斯函數(shù)與顆粒的強(qiáng)度曲線的擬合并從高斯 函數(shù)中獲得它們的總強(qiáng)度(曲線擬合光度測(cè)定)。采用FRET鑒別核苷酸種類單一顏色方法依賴于RNAP上的熒光團(tuán)被一組淬滅劑修飾的NTPs的區(qū)別性淬滅。 每種不同核苷酸在磷酸上用不同的暗淬滅劑標(biāo)記。該淬滅劑通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)減少RNAP熒光團(tuán)的熒光。FRET通常用作基于接近度的分析，因?yàn)镕RET的效率E取決于兩種熒光團(tuán)供體和 受體之間的距離(圖1)。根據(jù)F6rster理論，F(xiàn)RET效率E通過(guò)下列公式與熒光團(tuán)之間的距 離相關(guān)
(eq. 1)其中禮代表所使用熒光團(tuán)對(duì)的F6ster半徑 k 2 = (cos 0 t-3cos 0 Dcos 0 A)2用于具體供體-受體FRET對(duì)的Filter半徑Rq是FRET效率為50%時(shí)的距離。R。 值是FRET測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍的測(cè)量值，并且具體地與供體和受體熒光團(tuán)相關(guān)；其可以通過(guò)測(cè) 量供體的量子場(chǎng)QD、供體的熒光光譜FDU)、受體的依賴于波長(zhǎng)的消光系數(shù)和介質(zhì) n的折射率(N:阿伏伽德羅常數(shù))以實(shí)驗(yàn)確定。染料的相對(duì)定向以K2表示，來(lái)自于供體和 受體的偶極距相對(duì)于連接線的角度(9 D和0 A)和彼此相對(duì)的角度(e T)。如果為自由旋轉(zhuǎn) 的熒光團(tuán)，k 2可以接近2/3。由于禮與供體發(fā)射光譜和受體吸收光譜的光譜重疊成比例(通過(guò)公式2中的積 分概括)，F(xiàn)RET的過(guò)程與不發(fā)射熒光的受體完全兼容；對(duì)FRET受體唯一的要求就是要具有 與供體發(fā)射光譜顯著重疊的吸收光譜。作為FRET受體但不發(fā)射熒光的發(fā)色團(tuán)通常被稱為 “暗淬滅劑”。因?yàn)榘荡銣鐒┎划a(chǎn)生任何FRET敏化的發(fā)射，所以通過(guò)測(cè)定供體被降低的量子 場(chǎng)(基于熒光強(qiáng)度的測(cè)量)或者供體熒光被減少的熒光壽命來(lái)監(jiān)測(cè)FRET過(guò)程。在這種方法 中，我們將通過(guò)監(jiān)測(cè)隨著單一轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的被降低的熒光強(qiáng)度被降低的量子場(chǎng)來(lái)測(cè)量FRET 效率(圖2C)。采用單一標(biāo)記的RNAP的方法由于單一顏色方法采用了 RNAP上的單一位點(diǎn)，對(duì)于所有淬滅劑修飾的NTPs來(lái)說(shuō)， 熒光團(tuán)之間的距離和每種暗淬滅劑將都是相似的。為了在不同淬滅劑(因而不同的核苷 酸)之間區(qū)分，必須選擇具有相對(duì)于RNAP上的熒光團(tuán)不同特征性距離&的淬滅劑。這可 以通過(guò)選擇暗淬滅劑達(dá)到，該暗淬滅劑具有產(chǎn)生和供體發(fā)射光譜不同光譜重疊的吸收光譜 (圖3)。這將在距RNAP供體熒光團(tuán)相似的距離處獲得不同淬滅劑的不同F(xiàn)RET效率。在RNAP轉(zhuǎn)錄的情況下，觀察到每種NTP的結(jié)合和加入時(shí)在4種熒光淬滅水平的一 種水平上的短停留(圖4A)。被淬滅狀態(tài)下的每個(gè)停留通過(guò)回到未淬滅狀態(tài)而結(jié)束；未淬 滅狀態(tài)從淬滅劑_焦磷酸基團(tuán)的釋放持續(xù)到下一個(gè)NTP結(jié)合到活性位點(diǎn)上。堿基確定基于 單一加入循環(huán)期間的熒光強(qiáng)度而完成。由于淬滅劑不發(fā)熒光，這一方法應(yīng)該能夠以PM濃 度進(jìn)行基于聚合酶的測(cè)序，而沒(méi)有采用零模式波導(dǎo)(ZMW)技術(shù)或微細(xì)加工納米管道造成的 激發(fā)體積局限(注意這些技術(shù)能夠PM NTP濃度進(jìn)行DNA聚合酶操作，保證了聚合酶的持 續(xù)性而沒(méi)有來(lái)自高濃度游離NTPs的無(wú)法接受的高熒光背景)。無(wú)需ZMW進(jìn)行操作的能力極 大的簡(jiǎn)化了基底的制備，并且從成本考慮將更為理想。采用雙重標(biāo)記的RNAP的方法更為有力的方法是采用雙重?zé)晒鈭F(tuán)方法來(lái)確定堿基。雙重顏色方法(和原理上n 種_顏色方法)依賴于RNAP上兩種光譜上不同的熒光團(tuán)被一組4種淬滅劑修飾的NTPs的 區(qū)別性淬滅(圖4B)。這一方法規(guī)避了一個(gè)潛在的復(fù)雜化問(wèn)題，這些問(wèn)題能夠混淆基于單分 子熒光光譜法的單一分子DNA測(cè)序方法由于其光物理狀態(tài)和/或構(gòu)象狀態(tài)的變化，單一熒 光團(tuán)的熒光強(qiáng)度的波動(dòng)。在單一分子領(lǐng)域廣泛接受的是熒光團(tuán)進(jìn)入“暗”狀態(tài)期間它們不 發(fā)射熒光或吸收光子；這些狀態(tài)可以持續(xù)數(shù)個(gè)微秒(例如三線態(tài))到數(shù)秒；此外，熒光團(tuán)可 以經(jīng)歷降低或提高它們熒光強(qiáng)度的譜移。這些光物理現(xiàn)象可以對(duì)所有基于聚合酶的方法造 成兩個(gè)主要問(wèn)題。第一，缺乏來(lái)自單一供體熒光團(tuán)(對(duì)于暗-淬滅劑方法)或單一受體熒 光團(tuán)(對(duì)于亮-受體方法)的熒光發(fā)射將造成在讀取幾個(gè)堿基對(duì)期間的信息損失，產(chǎn)生在 要讀取序列中的缺口。第二，毫秒時(shí)間規(guī)模的波動(dòng)將造成時(shí)間平均的熒光強(qiáng)度，這可以造成
12堿基的不正確確定，因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度的變化將不僅反映特殊淬滅劑的存在，而且反映與無(wú)關(guān) 于NTP的熒光強(qiáng)度干擾的發(fā)生。圖4B、圖5和圖6說(shuō)明了雙重顏色分析的原理。對(duì)轉(zhuǎn)錄測(cè)序而言，用兩個(gè)熒光團(tuán) (圖5中的D1和D2)標(biāo)記RNAP，這兩個(gè)熒光團(tuán)具有最大間隔為 lOOnm的發(fā)射光譜。以大 距離(> 8nm)分開(kāi)的熒光團(tuán)保證了熒光團(tuán)D1和D2之間的FRET是可以忽略的(FRET效率 低于10%)。我們注意到鑒于熒光團(tuán)在顯著FRET的范圍內(nèi)，F(xiàn)RET的存在不妨礙依據(jù)暗淬 滅劑NTP的結(jié)合確定堿基，因?yàn)槠淙詫a(chǎn)生在聚合酶上的熒光團(tuán)與不同強(qiáng)度水平的相關(guān)淬 滅，這些強(qiáng)度水平能夠進(jìn)行堿基確定和將這些信號(hào)變化從由于供體或受體光物理狀態(tài)變化 所產(chǎn)生的變化中區(qū)分出來(lái)。一但淬滅劑標(biāo)記的ATP結(jié)合(已被選擇以引起兩種熒光團(tuán)的區(qū) 分性淬滅)，熒光團(tuán)D1被60%淬滅，而熒光團(tuán)D2被30%淬滅。這種標(biāo)記方式具有兩個(gè)主要優(yōu)勢(shì)。第一，ATP結(jié)合引發(fā)D1和D2熒光團(tuán)的同時(shí)淬 滅，而淬滅劑結(jié)合的焦磷酸的釋放造成D1和D2熒光同時(shí)去淬滅；這樣的兩種熒光團(tuán)的信號(hào) 相關(guān)變化清楚地將在淬滅狀態(tài)中基于NTP的停留時(shí)間從兩種熒光團(tuán)的光物理變化中區(qū)分 出來(lái)，因?yàn)楹笠蛔兓瘜⒉槐幌嚓P(guān)(在熒光團(tuán)D1和D2之間不存在FRET情況下)。第二，每種NTP不是與淬滅效率的一個(gè)水平相聯(lián)系，而是與兩個(gè)水平相聯(lián)系，提高 了分析的準(zhǔn)確性，并因此提高了讀取DNA序列的準(zhǔn)確性。為了提高分析的準(zhǔn)確性，可以選擇 特異性針對(duì)其余核苷酸的淬滅劑，從而將4種核苷酸間的淬滅水平之間的差異最大化。例 如，一旦淬滅劑標(biāo)記的GTP(已被選擇從而引起兩種熒光團(tuán)的區(qū)分性淬滅，但是其程度基本 不同于ATP)結(jié)合，熒光團(tuán)D1被40%淬滅，而熒光團(tuán)D2被60%淬滅。核苷酸之間淬滅水平 的區(qū)別可以以被稱為相關(guān)探針化學(xué)計(jì)量法(relative probestoichiometry)的比值表達(dá)式 來(lái)概括，S 其中FD1和FD2為熒光團(tuán)D1和D2分別在淬滅存在或不存在時(shí)的熒光強(qiáng)度。這一簡(jiǎn) 單比率本質(zhì)上就熒光團(tuán)D1相比熒光團(tuán)D2被淬滅劑標(biāo)記的NTP淬滅得更多還是淬滅得更少 給予報(bào)告。不存在淬滅時(shí)，調(diào)節(jié)激光激發(fā)功率以獲得在不存在淬滅時(shí)的S 0. 5。此外，兩種熒光團(tuán)的淬滅程度也被用于在暗淬滅劑之間(以及因此在堿基之間) 進(jìn)行區(qū)分。淬滅的程度可以以以下簡(jiǎn)單的比值表達(dá)式概括 其中FD1和FD2是熒光團(tuán)D1和D2分別在不存在淬滅時(shí)的熒光強(qiáng)度，而FD1Q和FD2Q是 熒光團(tuán)D1和D2分別在存在淬滅時(shí)的熒光強(qiáng)度。這些表達(dá)式，與比率S相結(jié)合，將能夠正確 確定堿基。圖7顯示了對(duì)于同一 DNA分子上的兩種熒光團(tuán)-暗淬滅劑對(duì)來(lái)說(shuō)，根據(jù)不同F(xiàn)RET效率得到的不同化學(xué)計(jì)量值的例子。這些結(jié)果通過(guò)觀察擴(kuò)散的單一 DNA分子獲得。FRET 效率通過(guò)暗淬滅劑(QSY7)的加入位點(diǎn)從接近紅綠色熒光團(tuán)(ATT0647N)的雙鏈DNA末端移 動(dòng)到接近綠色熒光團(tuán)(Cy3)的DNA末端而發(fā)生改變。隨著熒光團(tuán)從接近紅色熒光團(tuán)(如在 DNAl中)的位點(diǎn)移動(dòng)到接近綠色熒光團(tuán)(如在DNA6中)的位點(diǎn)，在中間位置以若干個(gè)不同 水平進(jìn)行取樣，化學(xué)計(jì)量比率S從 0. 7的高值降低到 0. 15的低值。S的取樣水平表明 在0. 15-0. 7范圍內(nèi)產(chǎn)生化學(xué)計(jì)量的多個(gè)水平的可行性。標(biāo)記位點(diǎn)的認(rèn)真選擇和暗淬滅劑 組的認(rèn)真選擇應(yīng)該能夠針對(duì)用Cy3/ATT0647N的熒光團(tuán)組合標(biāo)記的單一分子，產(chǎn)生4種不同 的化學(xué)計(jì)量水平(0. 15、 0. 3、 0. 5和0. 7)。對(duì)于優(yōu)選熒光團(tuán)組合Cy3B/ATT0647N，期望 額外的敏感性(由于Cy3B的光子計(jì)數(shù)高于CyB)。未淬滅狀態(tài)不僅在S的基礎(chǔ)上被區(qū)分，還 主要在淬滅效率的基礎(chǔ)上被區(qū)分。采用T7RNAP作為測(cè)序聚合酶的應(yīng)用的實(shí)施例
以下描述了使用T7RNAP的應(yīng)用實(shí)施例。該實(shí)驗(yàn)性設(shè)計(jì)建立在Cy3B和ATT0647N 的優(yōu)選應(yīng)用上，它們作為使用雙重標(biāo)記的RNAP的方法中的兩種熒光團(tuán)。它們的選擇基于這 一事實(shí)，即Cy3B和ATT0647N都是亮的、光穩(wěn)定的且是被清楚表征的熒光團(tuán)，可以被高功率、 穩(wěn)定的固體激光器激發(fā)。在這一基礎(chǔ)上，我們計(jì)算了幾種熒光團(tuán)_暗淬滅劑FRET對(duì)的Rtl值；結(jié)果概括于 圖8A中。考慮到產(chǎn)生4組不同的化學(xué)計(jì)量和淬滅效率的需要，我們選擇了 4種暗淬滅劑 (BHQ1、BHQ2、QSY21、ATT0612Q)以用于我們所選擇的熒光團(tuán)。Rtl值和熒光團(tuán)和暗淬滅劑的 光譜分別表示于圖8A和8B中。基于Rtl值，最好將ATT0647放在距離γ -磷酸 45人處，將Cy3B放在距離γ -磷 酸 55人處，并且以一種將Cy3B到MT0647的FRET最小化的方式放置。這種染料放置使得 可以基于淬滅效率區(qū)分暗淬滅劑的種類，同時(shí)將熒光團(tuán)之間的FRET最小化，因?yàn)闊晒鈭F(tuán)之 間存在大的FRET可能使數(shù)據(jù)分析復(fù)雜化。在T7RNAP延長(zhǎng)復(fù)合物上存在幾個(gè)位點(diǎn)(如在加 入的核苷酸IsOv存在時(shí)，該復(fù)合物的結(jié)構(gòu)所顯示的)滿足標(biāo)準(zhǔn)，只提供熒光團(tuán)之間 10% 的FRET。例如，熒光團(tuán)Dl可以被加入到N端域上多個(gè)位點(diǎn)中的每個(gè)位點(diǎn)，而熒光團(tuán)D2可以 被加入到thumb域的多個(gè)位點(diǎn)的每個(gè)位點(diǎn)。Dl到D2的低FRET效率的存在可以在時(shí)間追蹤 的分析中加以考慮，并且在期望的化學(xué)計(jì)量和淬滅比率中成為一個(gè)因素。重要的是，無(wú)論是 供體的閃爍還是受體的閃爍都不會(huì)被誤認(rèn)為是核苷酸結(jié)合和加入。所有FRET效率的確切 值將取決于發(fā)色團(tuán)之間的實(shí)際距離(其取決于發(fā)色團(tuán)連接部分的長(zhǎng)度和構(gòu)象)、蛋白質(zhì)環(huán) 境下發(fā)色團(tuán)的光譜性質(zhì)(其將被局部環(huán)境所影響)和發(fā)色團(tuán)的轉(zhuǎn)動(dòng)自由度(其將影響定向 因子κ 2，相應(yīng)地影響Rtl值)?；谥翱紤]了 Dl到Q和D2到Q的距離和Rtl值，很容易計(jì)算Dl和D2由于淬滅 而預(yù)期的熒光強(qiáng)度，以及化學(xué)計(jì)量值和淬滅比率(圖8A、8C-D)。如通過(guò)圖8C和D計(jì)算的時(shí) 間記錄可以看到的，兩個(gè)熒光比率的組合應(yīng)該清楚區(qū)分4種不同的淬滅劑，并因此區(qū)分它 們所代表的不同堿基?；诎荡銣鐒┑姆治龅牧硪粋€(gè)實(shí)施例利用了在單一核苷酸加入循環(huán)中發(fā)生的構(gòu) 象變化；這個(gè)實(shí)施例將在DNAP的情況下加以討論，因?yàn)镈NAP的構(gòu)象變化表征地更好；這種 構(gòu)象變化也可能在T7RNAP中發(fā)生，其具有和DNA聚合酶很多相同的特征。一經(jīng)加入正確的 dNTP,DNAP I家族(例如Klenow片段和Klentaq)中多個(gè)成員的指樣結(jié)構(gòu)域通過(guò)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)獲得了封閉的構(gòu)象，保證了正確dNTP與模板DNA的最佳接觸和與該DNAP上NTP結(jié)合位點(diǎn)的 最佳接觸。因此，如果D2置于指樣結(jié)構(gòu)域上(圖9)，并且D1沿著運(yùn)動(dòng)的方向設(shè)置在具有D1 到D2的顯著FRET的距離處，該體系將能夠監(jiān)測(cè)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。同時(shí)，D1到Q和D2到Q的FRET 效率也是顯著的，并且對(duì)于不同的暗淬滅劑對(duì)是不同的。因此，具有引物-模板DNA(假定 在開(kāi)放狀態(tài))的DNAP復(fù)合物將通過(guò)一組S和QdaA值進(jìn)行表征；正確dNTP體系的結(jié)合和加 入將產(chǎn)生第二組S和QdaA值。因此，只要有足夠分辨兩種構(gòu)象狀態(tài)的瞬時(shí)分辨度，每種暗淬 滅劑(和基于此的每種dNTP)都通過(guò)一組4個(gè)比率進(jìn)行表征，這是提高分析準(zhǔn)確性的一個(gè) 事實(shí)。對(duì)于本發(fā)明如何與最相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行對(duì)比的討論，請(qǐng)見(jiàn)“發(fā)明背景”部分。在本申請(qǐng)文件的說(shuō)明書和權(quán)利要求中，詞語(yǔ)“包括(comprise) ”和“含有 (contain)，，以及這些詞語(yǔ)的變化形式，例如“包括(comprising) ”和“包括(conprises)，， 意為“包括但不限于”，且并不意欲(且并不)排除其它部分、添加物、組分、整數(shù)或步驟。在本申請(qǐng)文件的說(shuō)明書和權(quán)利要求中，單數(shù)包括多數(shù)，除非上下文另有要求。特別 地，在使用不定冠詞時(shí)，申請(qǐng)文件要理解為涵蓋了多數(shù)以及單數(shù)，除非上下文另有要求。與本發(fā)明的具體方面、實(shí)施方式或?qū)嵤├黄鹈枋龅奶匦浴⒄麛?shù)、特征、化合物、化 學(xué)部分或基團(tuán)要被理解為可應(yīng)用于本文所述的任何其它方面、實(shí)施方式或?qū)嵤├?，除非?該處不相容。本發(fā)明將僅通過(guò)實(shí)施例的方式并參考所附的附圖進(jìn)行說(shuō)明圖 1熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基本原理，該熒光共振能量轉(zhuǎn)移可以作為用作納米量度距離 的分子標(biāo)準(zhǔn)。圖 2A.用于基于雙重顏色棱鏡的全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的儀器。這個(gè)例子采用了主要 激發(fā)RNAP上一種熒光團(tuán)的532nm激光器和主要激發(fā)RNAP上第二種光譜上不同的熒光團(tuán)的 638nm激光器。光線被結(jié)合并引入樣品中，在那里采用棱鏡通過(guò)全內(nèi)反射(TIR)在石英玻片 的底部產(chǎn)生一個(gè)衰減波；這激發(fā)了附著在聚合酶上的熒光團(tuán)。熒光光子通過(guò)物鏡收集、在光 譜上分開(kāi)并在超靈敏(XD照相機(jī)的芯片上依次成像。MR 反射鏡；DM1、DM2和DM3 分色鏡； CS 蓋玻片；0BJ 物鏡；FM 轉(zhuǎn)換鏡；FUF2 濾光片。B.在兩個(gè)不同光譜區(qū)域發(fā)射的固定化分子的成像(左圖上的為綠色；右圖上的為 紅色)。點(diǎn)1和1’分別對(duì)應(yīng)于綠色和紅色發(fā)射，從固定化的單一 RNA聚合酶-DNA復(fù)合物產(chǎn) 生。點(diǎn)2-4和2’-4’代表另外3個(gè)復(fù)合物。其點(diǎn)的強(qiáng)度代表從每個(gè)熒光團(tuán)發(fā)射的熒光的強(qiáng)度。C.經(jīng)淬滅劑修飾的NTPs的結(jié)合和水解，兩個(gè)熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度是如何被預(yù)計(jì)隨 時(shí)間變化的示意圖。圖 3采用4種不同淬滅劑以產(chǎn)生4個(gè)不同水平的熒光淬滅的原理，該原理基于在4種 不同熒光團(tuán)_淬滅劑FRET對(duì)之間Foster半徑的差異(采用單一標(biāo)記的聚合酶的方法)。圖 4A.采用單一標(biāo)記的聚合酶和4種不同淬滅劑，基于熒光團(tuán)D1淬滅的淬滅水平監(jiān)測(cè)核酸序列的策略的實(shí)施例。B.采用雙重標(biāo)記的聚合酶和4種不同淬滅劑，基于熒光團(tuán)Dl和熒光團(tuán)2的淬滅水 平監(jiān)測(cè)核酸序列的策略的實(shí)施例。圖 5 將在聚合酶上使用淬滅劑和使用兩種熒光團(tuán)相結(jié)合，以通過(guò)各淬滅劑對(duì)熒光團(tuán)進(jìn) 行區(qū)分性淬滅來(lái)提高堿基確定的可信度的實(shí)施例。圖 6由于光物理變化(上)和淬滅劑-NTP結(jié)合到雙重標(biāo)記的聚合酶(下)所產(chǎn)生時(shí) 間追蹤的示意圖。圖 7由針對(duì)單一 DNA分子上兩種熒光團(tuán)_暗淬滅劑對(duì)的不同F(xiàn)RET效率所產(chǎn)生的不同 化學(xué)計(jì)量值的實(shí)施例。左圖沿著DNA在6個(gè)不同位置標(biāo)記了綠色熒光團(tuán)(Cy3)、紅色熒光 團(tuán)(ATT0647N)和暗淬滅劑(QSY7)的雙鏈DNA分子。右圖隨著QSY7移動(dòng)到DNA上的不同 位置，針對(duì)Cy3到QSY7能量轉(zhuǎn)移和ATT0647N到QSY7的FRET效率變化，造成了對(duì)與大量單 一的擴(kuò)散DNA分子的化學(xué)計(jì)量的大變化。采用單分子FRET顯微術(shù)結(jié)合改變激光器激發(fā)對(duì) 樣品進(jìn)行研究。藍(lán)色短劃線4個(gè)可區(qū)分的化學(xué)計(jì)量水平可以采用熒光團(tuán)和一組暗淬滅劑 的組合產(chǎn)生。圖 8A.四種優(yōu)選的暗淬滅劑和它們針對(duì)兩種在T7RNAP延伸復(fù)合物上策略性放置的熒 光團(tuán)Dl和D2的FRET效率。B.熒光團(tuán)Dl和D2的發(fā)射光譜，以及四種暗淬滅劑的吸收光譜。C.作為圖A和B中4種暗淬滅劑中每一種的結(jié)合和切除的函數(shù)的Dl和D2熒光強(qiáng) 度的模擬時(shí)間追蹤。D.作為圖A和B中4種暗淬滅劑中每一種的結(jié)合和切除的函數(shù)的化學(xué)計(jì)量比率S 和淬滅效率Q_暗的模擬時(shí)間追蹤。圖9在加入核苷酸(dTTP，如在模板上的互補(bǔ)堿基所確定的)中，在開(kāi)放和復(fù)合狀 態(tài)中的DNAP-DNA-dNTP復(fù)合物以及兩種熒光團(tuán)(Dl和D2)和暗淬滅劑的示意圖。每個(gè)狀態(tài) 與一組三個(gè)顯著FRET過(guò)程(橙色箭頭)相聯(lián)系，測(cè)定其將提高分析的準(zhǔn)確性。
權(quán)利要求
用于確定核酸樣品中堿基序列的分析方法，該分析方法包括采用聚合酶對(duì)所述序列中的單一堿基的檢測(cè)，所述聚合酶被修飾成包括至少一種熒光團(tuán)和一種淬滅劑基團(tuán)；檢測(cè)和推斷能量轉(zhuǎn)移的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析，其中所述聚合酶被修飾成包括第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中所述第一和第二熒光團(tuán)在所述暗淬滅劑加入 之前相互反應(yīng)以形成第一熒光發(fā)射狀況和在所述暗淬滅劑加入之后形成第二發(fā)射狀況。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中所述熒光團(tuán)被可見(jiàn)范圍(400-700nm)的激發(fā) 源激發(fā)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中所述熒光團(tuán)被紅外范圍(700ηπι-350μπι)的激發(fā)源激發(fā)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中所述熒光團(tuán)選自5-羧基熒光素(FAM)、四甲 基羅丹明(TMR)、Alexa-Fluor熒光團(tuán)、BODIPY染料、ATTO染料、花青染料和量子點(diǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的分析方法，其中所述第一和第二熒光團(tuán)由Cy3B和 ATT0647n 組成。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分析，其中所述淬滅劑基團(tuán)為暗淬滅劑基團(tuán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分析方法，其中所述暗淬滅劑基團(tuán)是被修飾的三磷酸核苷 (NTP)或 dNTP。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分析方法，其中所述暗淬滅劑部分共價(jià)地連接到所述NTP的 Y或β-磷酸基團(tuán)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分析方法，其中所述暗淬滅劑選自DABCYL、BHQ1、BHQ2、 QSY7、QSY9、QSY21、QSY35、ATT0540Q、ATT0580Q、ATT0612Q、DYQ660 和 DYQ661。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中所述分析包括至少四種淬滅劑基團(tuán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分析方法，其中所述分析包括至少四種暗淬滅劑基團(tuán)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的分析方法，其中所述至少四種淬滅劑基團(tuán)的每一個(gè)都 是不同的。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述淬滅劑基團(tuán)中的每一種 包括淬滅劑部分和核苷酸，該淬滅劑部分和核苷酸不同于其它淬滅劑基團(tuán)的淬滅劑部分和 核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分析方法，其中所述NTP選自三磷酸腺苷、三磷酸胞苷、三磷 酸鳥(niǎo)苷、三磷酸尿苷、三磷酸脫氧腺苷、三磷酸脫氧胞苷、三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷和三磷酸脫氧胸 苷、被修飾的DNA、被修飾的RNA或包含DNA或RNA的核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中所述聚合酶選自DNA聚合酶、RNA聚合酶和 反轉(zhuǎn)錄酶。
18.被修飾的聚合酶，該聚合酶包括已被修飾成包括熒光團(tuán)對(duì)的聚合酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的被修飾的聚合酶，其中所述聚合酶為RNA聚合酶。
20.包含根據(jù)權(quán)利要求18所述的聚合酶和至少一種淬滅劑基團(tuán)的試劑盒。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，所述試劑盒包含至少四種淬滅劑基團(tuán)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的試劑盒，其中所述淬滅劑基團(tuán)或每個(gè)淬滅劑基團(tuán)為暗淬滅劑基團(tuán)。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的試劑盒，其中所述至少四種淬滅劑基團(tuán)的每一種都是 不同的。
24.根據(jù)權(quán)利要求21、22或23所述的試劑盒，其中所述淬滅劑基團(tuán)中的每一種包含 淬滅劑部分和核苷酸，該淬滅劑部分和核苷酸不同于其它淬滅劑基團(tuán)的淬滅劑部分和核苷酸。
25.參考所附實(shí)施例基本上如前描述的分析或試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于確定核酸樣品中的堿基序列的分析方法，所述分析方法包括采用聚合酶對(duì)所述序列中的單一堿基的檢測(cè)，所述聚合酶被修飾成包含至少一種熒光團(tuán)和一種暗淬滅劑基團(tuán)；檢測(cè)和推斷能量轉(zhuǎn)移的量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101878312SQ200880113725
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者A·卡帕尼蒂斯 申請(qǐng)人:埃西斯創(chuàng)新有限公司