專利名稱：分子印章測序裝置和測序方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于焦磷酸測序原理的分子印章測序裝置和測序方法，尤其涉及一種低成本、高通量的微陣列分子印章測序裝置和測序方法。
背景技術：
人類基因組計劃的完成，很大程度上歸因于測序技術的發(fā)展和測序成本的降低。DNA測序成本已由十多年前的每個堿基約十美元降至現(xiàn)在每個堿基約十美分。但是，隨著對人類基因組研究的深入，人們越來越清楚地認識到人們要真正要研究基因的功能，破解基因組這一自然進化產(chǎn)生的分子程序，進而在基因水平上進行臨床診斷、疾病預防和易感性評估，只有對于大量的個人全基因組信息進行檢測，通過比較不同表型人類的基因組差異，讀懂這一分子程序語言。也就是說，借助大量個人全基因組信息的檢測來認識不同人種、人群和個體之間DNA序列的差異，進而準確推斷這些差異對疾病發(fā)生、發(fā)展規(guī)律的影響。這就需要進一步大幅度降低人類全基因組測序的成本。有專家提出了1000美元全基因組測序的目標，也就是說，DNA測序的成本將要進一步下降100萬倍。因此，這對于人類是一個巨大的挑戰(zhàn)，人類急需發(fā)展一種全新的超低成本的高通量DNA測序技術以來迎接個人醫(yī)學和藥學時代的挑戰(zhàn)。
目前，比較普遍使用的測序方法是1977年Sanger發(fā)明的雙脫氧測序法，雖然該方法已經(jīng)過29年的發(fā)展與改進，在讀取DNA序列長度方面已有極大的提高，但是它仍然具有通量低、速度慢和需要電泳或進行標記檢測等弱點。而早期的Maxam和Gilbert化學裂解測序法，雖然也有較強測序能力，但由于該測序過程中要使用有毒的化學物質(zhì)，而沒有得到實際應用。雜交測序法由于其嚴重的非特異性雜交信號而影響測序的準確性，也很少被應用。此外，還有多種其它測序方法，大多只是在實驗室研究階段，離應用尚待時日。
焦磷酸測序技術是新一代DNA序列分析技術，該方法是在同一反應體系中四種酶(即DNA聚合酶、硫酸化酶、熒光素酶和腺苷三磷酸雙磷酸酶)的級聯(lián)催化作用下，待測ssDNA上結合的引物每發(fā)生一個堿基延伸，則會有一定強度的熒光信號被釋放。這樣在每一輪測序反應中，依次加入四種dNTP(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP)之一，通過檢測每次熒光釋放的有無和強度，就能夠達到實時測定DNA序列的目的。該技術對DNA的序列分析無須電泳，DNA片段也無須標記，因此，具有自動化高，重復性好等優(yōu)點。焦磷酸測序技術已經(jīng)在單核苷酸多態(tài)性的研究、病因?qū)W分析、病原微生物的快速鑒定、法醫(yī)鑒定等方面得到廣泛的應用。目前，國內(nèi)外運用該技術進行測序主要有兩種方法。一種是普遍采用單管反應的焦磷酸測序方法，即每次進行一個樣品的序列測定，這種情況下無疑使高通量檢測受到限制。另一種是國外基于96孔板的并行焦磷酸測序方法，它是將96個不同的樣本分別置于96個孔中，然后對這些樣品進行測序，雖然這種方法的分析通量有所提高，但樣品的制備比較麻煩且消耗藥品較大。以上兩種焦磷酸測序裝置雖能實現(xiàn)對目的DNA序列的測定，但由于它們的反應體系均龐大且樣品制備較麻煩，導致測序成本的極大提高。更為重要的是，由于焦磷酸測序反應體系為液相體系，每個測序反應均需要一個獨立的反應腔，這就大大地限制了DNA測序的通量。為此，我們基于焦磷酸測序原理，提出了應用分子印章方法，發(fā)展了一種成本低、試劑消耗小且樣品制備簡單的高通量DNA測序方法，該方法將極大地降低DNA測序的成本，能夠用于人類個體基因組的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
技術問題本發(fā)明提供一種新型分子印章測序裝置和測序方法，它可以在生物芯片上對DNA目的片段進行低成本、高通量、高靈敏度的分析。
技術方案本發(fā)明的生物芯片測序裝置由DNA延伸基底、化學發(fā)光透明基片和機械連接臂三部分構成；其中，DNA延伸基底、化學發(fā)光透明基片分別固定在機械連接臂上；DNA延伸基底為一固體材料基底，在DNA延伸基底上與化學發(fā)光透明基片相對的一面為放置DNA及聚合酶的DNA延伸基底面，在化學發(fā)光透明基片上與DNA延伸基底相對的一面為放置發(fā)光相關酶和發(fā)光輔助物的發(fā)光透明基片面，在化學發(fā)光透明基片的另一面的外部設有發(fā)光檢測器，發(fā)光檢測器的輸出端接信號分析裝置。
DNA延伸基底的材料為玻璃、石英、金屬、塑料、陶瓷、橡膠、凝膠、紙材、尼龍之一，或由它們中的二種或多種組成的復合物，且DNA延伸基底與化學發(fā)光透明基片相對的一面為一水平面；在DNA延伸基底上不與化學發(fā)光透明基片相對的一面，放置溫度調(diào)控裝置，如加熱電極、半導體溫控器件、光學加熱、氣流控溫。放置發(fā)光相關酶和發(fā)光輔助物的基片面的材料為玻片、橡膠、石英、凝膠等材料之一，或由它們中的二種或多種組成的復合物。發(fā)光檢測器為光電耦合器件CCD、光電倍增管PMT和互補性氧化金屬半導體CMOS中的一種。機械連接臂上有兩個卡，它們分別用來固定DNA延伸基底、化學發(fā)光透明基片；這兩個卡可以是其中一個卡固定在機械連接臂上，另一個卡沿機械連接臂上下滑動。
本發(fā)明的生物芯片測序裝置的測序方法為，待測DNA模板和DNA聚合酶放置在DNA延伸基底面上，發(fā)光相關的生物酶和發(fā)光輔助物則放置在發(fā)光透明基片面上；在DNA延伸基底面上加入dNTP后，將上述兩部分面對面進行接觸壓印，延伸反應所產(chǎn)生的焦磷酸從DNA延伸基底面轉移到發(fā)光透明基片面上，并在該發(fā)光透明基片面上與發(fā)光相關生物酶和發(fā)光輔助物作用，放出有一定強度的光信號；該光信號由上述發(fā)光檢測器檢測。
該方法中DNA延伸基底面上放置的待測DNA模板是PCR擴增產(chǎn)物，或是滾環(huán)擴增產(chǎn)物，或其它任何形式的待測序列DNA；該待測DNA模板，可以直接把雙鏈DNA固定在基底的面上，再經(jīng)處理獲得單鏈DNA，然后每一單鏈DNA再與相應的測序引物雜交；也可以是將雙鏈DNA先處理成單鏈DNA后，再將其固定于延伸部分基底面上，每一單鏈DNA再與相應的測序引物雜交。DNA延伸反應所需要dNTP的加入方法為通過微量噴霧的方法進行加樣，或分別從四個不同的印章上轉印加樣。發(fā)光透明基片面上的發(fā)光生物酶為熒光素酶，同時可以包括ATP硫酸化酶和腺苷三磷酸雙磷酸降解酶中的一種或二種組成；發(fā)光輔助物為腺苷磷酰硫酸和熒光素。接觸壓印是將DNA延伸基底固定，用機械操作裝置將化學發(fā)光透明基片面壓印于DNA延伸基底面上；或反之將化學發(fā)光透明基片固定，用機械操作裝置將DNA延伸基底面壓印于化學發(fā)光透明基片面上。
有益效果本發(fā)明提出了一種新穎的分子印章測序方法，該方法是基于焦磷酸測序技術原理，將待測單鏈DNA序列與測序引物相結合，引物上每次堿基延伸都同一次化學發(fā)光信號相偶聯(lián)，根據(jù)發(fā)光檢測裝置獲得的所釋放光信號的有無及強弱，可確定待測DNA序列。本發(fā)明與現(xiàn)有測序技術相比具有以下優(yōu)點a.高通量。成千上萬個待測DNA序列片段固定在基片上形成微陣列延伸DNA基片，因此，該法可實現(xiàn)對大量待測DNA序列的高通量和并行性測定。b.低成本。本方法無需耗用體積較多的反應液，而是將DNA聚合酶和三種發(fā)光相關酶及輔助物直接加到基片，且能夠得到重復，從而減小了反應酶的用量、降低測序成本；核酸單體用微噴或壓印的方法，也減少了原料的消耗。另外，待測DNA可以通過價格低廉的丙烯酰胺膠直接固定在延伸基片上。c.操作簡便。該裝置容易實現(xiàn)自動化，待測DNA無須標記也無須電泳，從而避免了繁瑣的制膠、跑膠和掃描等過程。


圖1是本發(fā)明提出的基于分子印章的焦磷酸測序裝置示意圖。
圖2是本發(fā)明中DNA延伸基底面(11)正面示意圖。
圖3是加入一次dNTP各陣點DNA發(fā)生堿基延伸示意圖。
以上的圖中有DNA延伸基底1、DNA延伸基底面11、化學發(fā)光透明基片2、發(fā)光透明基片面21、機械連接臂3、發(fā)光檢測器4、信號分析裝置5、待測DNA模板6、DNA聚合酶7、DNA微陣點編號8、DNA堿基延伸個數(shù)9。
具體實施例方式
本發(fā)明基于焦磷酸測序原理，提出了一種基于生物芯片的分子印章測序裝置和方法。首先，將化學修飾的擴增產(chǎn)物制備成單鏈DNA并與相應的測序引物雜交后，通過一定媒介固定于固體基底材料(如玻片、石英、金屬、塑料、陶瓷、橡膠、凝膠、紙材、尼龍等之一，或由它們中的二種或多種組成的復合物)的表面上，(或?qū)⒒瘜W修飾的擴增產(chǎn)物先固定于基片后再制備成單鏈DNA，并與相應的測序引物雜交)，再將DNA聚合酶放置于該基底上，構成含有待測序DNA模板微陣列DNA延伸基底；再通過微量噴霧或壓印方法將四種dNTP核苷酸之一均勻噴灑或壓印于DNA延伸基底表面，在DNA聚合酶的作用下，延伸基底上的測序引物若發(fā)生堿基的延伸，在基底的延伸位置產(chǎn)生焦磷酸基團。然后將化學發(fā)光所需的酶及輔助物加到另一個反應基片上(或中)；當延伸基底與加有發(fā)光酶的基片通過接觸壓印后，焦磷酸基團轉移進入加有發(fā)光酶的基片，就會在相應的位置上有一定強度的化學發(fā)光信號釋放，通過發(fā)光檢測裝置就可以實時檢測到該信號的有無及強弱。當四種dNTP依次循環(huán)加入該系統(tǒng)中，就可以達到對延伸基底上每一陣點的DNA序列進行準確全面分析目的。
本發(fā)命中生物芯片測序裝置的測序方法，其特征在于待測DNA模板和DNA聚合酶放置在DNA延伸基底面11上，發(fā)光相關的生物酶和發(fā)光輔助物則放置在發(fā)光透明基片面21上；在DNA延伸基底面11上加入dNTP后，將上述兩部分面對面進行接觸壓印，延伸反應所產(chǎn)生的焦磷酸從DNA延伸基底面11轉移到含有發(fā)光相關酶和發(fā)光輔助物的發(fā)光透明基片面21上，并在發(fā)光相關酶和發(fā)光輔助物的基片面21與發(fā)光相關酶和發(fā)光輔助物作用，放出有一定強度的光信號；該光信號由上述發(fā)光檢測器4檢測。
DNA延伸基底面11上待測DNA模板6可以是PCR擴增產(chǎn)物，也可以是滾環(huán)擴增產(chǎn)物，或其它任何形式的待測序列DNA。待測DNA的固定方式，可以是直接把擴增DNA產(chǎn)物固定在基底面，再經(jīng)一定處理獲得單鏈DNA，然后每一單鏈DNA再與相應的測序引物雜交；也可以是將擴增DNA產(chǎn)物先在基底外處理成單鏈DNA后，再將其固定于基片上，然后單鏈DNA再與測序引物雜交。單鏈DNA的制備方法可以是通過丙烯酰胺凝膠固定丙烯酰胺修飾的擴增產(chǎn)物后，經(jīng)堿變性在去除非固定的單鏈DNA獲得；也可以是鏈霉親和素修飾的磁珠固定有生物素修飾的擴增產(chǎn)物后；也可以是通過鏈霉親和素修飾的葡聚糖微珠固定有生物素修飾的擴增產(chǎn)物后，經(jīng)堿變性在去除非固定的單鏈。該部分所述的DNA聚合酶可以是Klenow Fragmentpolymerase(exo-)，也可以是經(jīng)點突變的測序酶Sequenase。
DNA延伸反應所需要dNTP(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)的加入方法為通過微量噴霧的方法進行加樣，或分別從四個不同的印章上轉印加樣。
化學發(fā)光基片面21上放置有發(fā)光相關的生物酶和發(fā)光相關的輔助物。例如，在化學發(fā)光透明基片面上放置有ATP硫酸化酶和腺苷磷酰硫酸、熒光素酶和熒光素、以及腺苷三磷酸雙磷酸降解酶等三種發(fā)光相關的酶和發(fā)光相關的輔助物的組合，或在化學發(fā)光透明基片面上放置有ATP硫酸化酶和腺苷磷酰硫酸、熒光素酶和熒光素等二種發(fā)光相關的生物酶和發(fā)光相關的輔助物的組合，或由熒光素酶與和熒光素組成。其中ATP硫酸化酶、熒光素酶以及腺苷三磷酸雙磷酸降解酶等為發(fā)光相關的生物酶。腺苷磷酰硫酸和熒光素為發(fā)光相關的輔助物。
上述DNA延伸基底面11和化學發(fā)光基片面21的接觸壓印就是將DNA延伸基底1固定，用機械操作裝置將化學發(fā)光透明基片面21壓印于DNA延伸基底面11上；或反之將化學發(fā)光透明基片2固定，用機械操作裝置將DNA延伸基底面11壓印于化學發(fā)光透明基片面21上。
例1.用滾環(huán)擴增產(chǎn)物對50個DNA片段進行序列測定。
1.針對50個DNA片段分別用相應的限制性內(nèi)切酶進行酶切，并將酶切片段中的一條鏈在靶DNA的作用下與一通用適配器(含有36堿基的DNA序列)連接成環(huán)狀DNA。
2.用一個18堿基的通用擴增反向引物(5’端有丙烯酰胺修飾且與適配器3’端18堿基互補)和另一18堿基的通用擴增正向引物(與適配器5’端18bps互補)分別對上述環(huán)狀DNA進行雙引物滾環(huán)擴增；然后將滾環(huán)擴增產(chǎn)物與丙烯酰胺凝膠溶液混合，并用芯片點樣儀將50個處理過的樣品點在玻璃片上，并聚合成凝膠點陣，制備成測序用的微陣列芯片，見圖2所示；再通過堿變性、電泳和沖洗，將非固定的DNA，引物，單鏈環(huán)及其它雜質(zhì)去除，便得到DNA延伸微陣列；3.用通用測序引物(與擴增正向引物序列相同)與上述延伸基底面上的待測單鏈DNA序列雜交，并電泳洗除DNA模板上多余的測序引物。
4.將DNA聚合酶均勻放置于延伸基底的DNA微陣列上，同時將發(fā)光相關酶(ATP硫酸化酶、熒光素酶以及腺苷三磷酸雙磷酸酶)和發(fā)光輔助物(腺苷磷酰硫酸)固定于另一透明的玻璃發(fā)光基片上。
5.將適量dNTP之一的脫氧核糖核苷酸反應液通過微量噴霧分散在延伸基底面的DNA微陣列上。若該次加入的dNTP與模板上相應位置DNA序列的最靠近測序引物的堿基互補，此時該堿基與待測DNA結合的測序引物在DNA聚合酶的作用下發(fā)生聚合延伸反應，同時產(chǎn)生等摩爾的焦磷酸鹽。
6.迅速將DNA延伸基底面壓印于另一發(fā)光透明基片上，使焦磷酸鹽轉移到發(fā)光透明基片面上。在ATP硫酸化酶和熒光素酶等的協(xié)同作用下，則會產(chǎn)生相應強度的熒光信號釋放。通過在發(fā)光透明基片另一面的CCD成像，對每個陣點熒光的有無和強度的檢測，就可以確定該dNTP在某個陣點是否發(fā)生聚合以及引物延伸堿基的個數(shù)。圖3是在加入一次dNTP后，分子印章芯片每個陣點上的引物發(fā)生堿基延伸反應的示意圖。圖中橫坐標表示該陣點序號，縱坐標表示堿基延伸個數(shù)。該圖表示，在該次加入dNTP反應液后，陣點1、4、6、7、9、12……等發(fā)生了一個堿基的延伸；陣點3、11……等發(fā)生了二個堿基的延伸；陣點8……等發(fā)生了三個堿基的延伸；陣點2、5、10、13……等則沒有發(fā)生堿基的延伸。
7.將DNA延伸基片上多余的dNTP去除。
8.重復步驟5至7，將四種不同的dNTP依次循環(huán)加入延伸基片，并記錄每次NTP發(fā)生聚合所釋放光信號。當四種單體dATP、dGTP、dCTP和dTTP反應液體依次循環(huán)加入微陣列芯片后，則可以同時對微陣列上每個DNA片段進行序列測定。例如，第一個陣點在dATP、dGTP、dCTP和dTTP第一次循環(huán)中依次通過后，分別發(fā)生了兩個堿基的聚合、零個堿基的聚合、一個堿基的聚合和四個堿基的聚合。由此，得到測序引物上發(fā)生延伸的七個堿基為5′-AACTTTT-3′，從而確定該陣點DNA堿基組成為5′-AAAAGTT-3′，最終經(jīng)過若干次循環(huán)后就可以得到第一個陣點上待測DNA全部序列。同理可以獲得到其它各陣點DNA序列。最后綜合反應芯片每個陣點上若干次反應結果，便可以得到延伸基片上每個陣點DNA序列組成，從而實現(xiàn)了50個DNA；片段的并行高通量測序。
例2.利用PCR產(chǎn)物對100個SNP基因型進行檢測。
1.首先，提取人的基因組DNA，并通過PCR技術，獲得100個分別含有不同SNP位點的PCR擴增產(chǎn)物片段。在上述PCR產(chǎn)物的反向引物的5’端用生物素修飾，且使該反向引物的前18個堿基序列相同，余下的堿基為每個待擴增片段的特異序列部分。
2.該100個PCR產(chǎn)物分別用鏈霉親和素修飾的磁珠進行固定，再用NaOH進行變性處理，緩沖液沖洗，獲得單鏈DNA。
3.用帶有磁性的DNA延伸基底面將上述單鏈DNA固定成10×10陣列。
4.用通用測序引物與該延伸基底上的微陣列DNA進行雜交，并將多余引物沖洗干凈。
5.將DNA聚合酶均勻涂抹于DNA延伸基底的微陣列延伸基底上，同時將發(fā)光相關酶和發(fā)光輔助物置于另一發(fā)光透明基片上。
6.將適量dNTP用壓印方法轉移到延伸DNA微陣列基片上，并將DNA延伸基底面與另一發(fā)光透明基片進行接觸壓印。
7.將上述微陣列DNA延伸基底上每一陣點DNA產(chǎn)生光信號的有無及強弱用發(fā)光檢測裝置進行檢測并記錄，同時通過軟件進行分析給出每個陣點所延伸堿基的個數(shù)。
8.再分別將dTTP，dATP和dGTP重復步驟6和7的操作。
9.這樣將四種dNTP依次循環(huán)次壓印于延伸基底面的DNA上，并記錄每次每個陣點所釋放光信號的強弱，再通過軟件的綜合分析給出每個陣點DNA的序列。
10.最后對100個SNP位點的突變類型進行判斷。
例3.用滾環(huán)擴增產(chǎn)物進行大腸桿菌全基因組DNA序列的再測定。
1.提取大腸桿菌的基因組DNA，并通過超聲方法片段化。通過將DNA片段中的一端在靶DNA的作用下與一通用5’端磷酸的適配器(含有36堿基的DNA序列)結合，使DNA片段中的一條鏈連接成環(huán)狀DNA，并進行適當?shù)南♂?，形成單一環(huán)狀DNA的大腸桿菌的全基因組測序模板溶液。
2.用一個18堿基的通用擴增反向引物(5’端有丙烯酰胺修飾且與適配器3’端18堿基互補)分別對上述環(huán)狀DNA進行雙引物滾環(huán)擴增；然后將滾環(huán)擴增產(chǎn)物與丙烯酰胺凝膠溶液混合，均勻地鋪展在玻璃片上，并聚合成超薄的凝膠層，制備成含有大量單分子多拷貝的滾環(huán)產(chǎn)物微陣列芯片。
3.將通用測序引物與微陣列芯片上的單分子DNA模板雜交，并電泳洗除DNA模板上多余的測序引物，便得到DNA延伸微陣列。
4.將DNA聚合酶均勻放置于延伸基底的DNA微陣列上，同時將發(fā)光相關酶(ATP硫酸化酶、熒光素酶以及腺苷三磷酸雙磷酸酶)和發(fā)光輔助物(腺苷磷酰硫酸)固定于另一透明的玻璃發(fā)光基片上。
5.將適量dNTP之一的脫氧核糖核苷酸反應液通過微量噴霧分散在DNA微陣列延伸基底面上。若該次加入的dNTP與模板上相應位置DNA序列的最靠近測序引物的堿基互補，此時該堿基與待測DNA結合的測序引物在DNA聚合酶的作用下發(fā)生聚合延伸反應，同時產(chǎn)生等摩爾的焦磷酸鹽。
6.迅速將延伸基底面壓印于另一發(fā)光透明基片上，使焦磷酸鹽轉移到發(fā)光透明基片面上，在ATP硫酸化酶和熒光素酶等的協(xié)同作用下，則會產(chǎn)生相應強度的熒光信號釋放。通過在發(fā)光透明基片另一面的CCD成像，對每個陣點熒光的有無和強度的檢測，就可以確定該dNTP在某個陣點是否發(fā)生聚合以及引物延伸堿基的個數(shù)。
7.將DNA延伸基底面上多余的dNTP去除。
8.重復步驟5至7，將四種不同的dNTP依次循環(huán)加入延伸基面，并記錄每次dNTP發(fā)生聚合所釋放光信號。當四種單體dATP、dGTP、dCTP和dTTP反應液體依次循環(huán)加入微陣列芯片后，則可以同時對微陣列上每個DNA片段進行序列測定。最后綜合反應芯片每個陣點上若干次反應結果，便可以得到延伸基底上每個單分子DNA序列組成，從而實現(xiàn)了全基因組DNA片段的高通量并行測序。通過參考已知的大腸桿菌的基因組序列，進行被測序DNA片段的組裝，實現(xiàn)大腸桿菌的全基因組再測序。
權利要求
1.一種生物芯片測序裝置，其特征在于該裝置由DNA延伸基底(1)、化學發(fā)光透明基片(2)和機械連接臂(3)三部分構成；其中，DNA延伸基底(1)、化學發(fā)光透明基片(2)分別固定在機械連接臂(3)上；DNA延伸基底(1)為一固體材料基底，在DNA延伸基底(1)上與化學發(fā)光透明基片(2)相對的一面為放置DNA及聚合酶的DNA延伸基底面(11)，在化學發(fā)光透明基片(2)上與DNA延伸基底(1)相對的一面為放置發(fā)光相關酶和發(fā)光輔助物的發(fā)光透明基片面(21)，在化學發(fā)光透明基片(2)的另一面的外部設有發(fā)光檢測器(4)，發(fā)光檢測器(4)的輸出端接信號分析裝置(5)。
2.根據(jù)權利要求1所述的生物芯片測序裝置，其特征在于DNA延伸基底(1)的材料為玻璃、石英、金屬、塑料、陶瓷、橡膠、凝膠、紙材、尼龍之一，或由它們中的二種或多種組成的復合物，且DNA延伸基底(1)與化學發(fā)光透明基片(2)相對的一面為一水平面；在DNA延伸基底(1)上不與化學發(fā)光透明基片(2)相對的一面，放置溫度調(diào)控裝置，如加熱電極、半導體溫控器件、光學加熱、氣流控溫。
3.根據(jù)權利要1求所述的生物芯片測序裝置，其特征在于放置發(fā)光相關酶和發(fā)光輔助物的基片面(21)的材料為玻片、橡膠、石英、凝膠等材料之一，或由它們中的二種或多種組成的復合物。
4.根據(jù)權利要求1所述的生物芯片測序裝置，其特征在于發(fā)光檢測器(4)為光電耦合器件CCD、光電倍增管PMT和互補性氧化金屬半導體CMOS中的一種。
5.根據(jù)權利要求1所述的生物芯片測序裝置，其特征在于機械連接臂(3)上有兩個卡(31)，它們分別用來固定DNA延伸基底(1)、化學發(fā)光透明基片(2)；這兩個卡可以是其中一個卡固定在機械連接臂(3)上，另一個卡沿機械連接臂(3)上下滑動。
6.一種如權利要求1所述的生物芯片測序裝置的測序方法，其特征在于待測DNA模板和DNA聚合酶放置在DNA延伸基底面(11)上，發(fā)光相關的生物酶和發(fā)光輔助物則放置在發(fā)光透明基片面(21)上；在DNA延伸基底面(11)上加入dNTP后，將上述兩部分面對面進行接觸壓印，延伸反應所產(chǎn)生的焦磷酸從DNA延伸基底面(11)轉移到發(fā)光透明基片面(21)上，并在該發(fā)光透明基片面(21)上與發(fā)光相關生物酶和發(fā)光輔助物作用，放出有一定強度的光信號；該光信號由上述發(fā)光檢測器(4)檢測。
7.根權利要求6所述的生物芯片測序裝置的測序方法，其特征在于該方法中DNA延伸基底面(11)上放置的待測DNA模板(6)是PCR擴增產(chǎn)物，或是滾環(huán)擴增產(chǎn)物，或其它任何形式的待測序列DNA；該待測DNA模板，可以直接把雙鏈DNA固定在基底的面上，再經(jīng)處理獲得單鏈DNA，然后每一單鏈DNA再與相應的測序引物雜交；也可以是將雙鏈DNA先處理成單鏈DNA后，再將其固定于延伸部分基底面上，每一單鏈DNA再與相應的測序引物雜交。
8.根據(jù)權利要求6所述的生物芯片測序裝置的測序方法，其特征在于DNA延伸反應所需要dNTP的加入方法為通過微量噴霧的方法進行加樣，或分別從四個不同的印章上轉印加樣。
9.根據(jù)權利要求6所述的生物芯片測序裝置的測序方法，其特征在于發(fā)光透明基片面(21)上的發(fā)光生物酶為熒光素酶，同時可以包括ATP硫酸化酶和腺苷三磷酸雙磷酸降解酶中的一種或二種組成；發(fā)光輔助物為腺苷磷酰硫酸和熒光素。
10.根據(jù)權利要求6所述的生物芯片測序裝置的測序方法，其特征在于接觸壓印是將DNA延伸基底(1)固定，用機械操作裝置將化學發(fā)光透明基片面(21)壓印于DNA延伸基底面(11)上；或反之將化學發(fā)光透明基片(2)固定，用機械操作裝置將DNA延伸基底面(11)壓印于化學發(fā)光透明基片面(21)上。
全文摘要
分子印章測序裝置和測序方法涉及一種基于焦磷酸測序原理的方法，該裝置是包括DNA延伸部分、化學發(fā)光部分和機械連接三部分。該分子印章測序方法是將滾環(huán)擴增單鏈DNA模板或PCR擴增的單鏈模板和DNA聚合酶固定在的DNA延伸基底的一面；而化學發(fā)光相關酶、化學發(fā)光輔助物則固定于發(fā)光透明基片的一面；光信號檢測裝置則置于發(fā)光透明基片的另一面。當延伸基底面與加有發(fā)光酶的透明發(fā)光基片接觸壓印后，焦磷酸基團轉移進入加有發(fā)光酶的發(fā)光透明基片，就會在該基片的相應位置上釋放一定強度的化學反應光信號，通過發(fā)光檢測裝置就可以實時檢測到該信號的有無及強弱。當四種dNTP單核苷酸依次循環(huán)加入該系統(tǒng)中，就可以達到對DNA延伸基底面上每一DNA序列進行分析測序。
文檔編號C12Q1/68GK1944674SQ200610096538
公開日2007年4月11日 申請日期2006年9月30日 優(yōu)先權日2006年9月30日
發(fā)明者陸祖宏, 潘志強, 肖鵬峰 申請人:東南大學