專利名稱：一種Evi-1基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法
一種Evi-l基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用技術領域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關于一種Evi-l基因的原位雜交檢測試 劑盒及其檢測方法和應用。
背景技術：
根據(jù)國內(nèi)外權(quán)威機構(gòu)提供的資料，我國每年癌癥的新增人數(shù)170 萬，死亡人數(shù)近160萬，患者700多萬，全球每年新增癌癥患者800 萬，死亡人數(shù)接近800萬，患者約有8400多萬人，到2020年以上人 數(shù)將翻一番，這是一組可怕的數(shù)字。
2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等多家單位做 了一個年度報告，"認為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗"，也就是說癌癥死 亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個因素是l.腫瘤細 胞異質(zhì)性；2.腫瘤細胞耐藥性；3.抗癌藥物設計思路不完善等。同時， 該報告中亦提出應重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。
本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，導致癌癥死亡率不降的另兩個重要原因 是".不能做到真正的早期診斷；2，轉(zhuǎn)移的病理機制不清楚。依照傳統(tǒng)
的醫(yī)學影像及和其它生化(如蛋白標記物)指標來診斷癌癥，認為占 位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷(更小些有時無癥狀體 征)，這一概念值得認真討論。影像醫(yī)學的2公分以下癌塊屬早期這 一界定科學性是不夠嚴謹?shù)模瑥募毎麑W角度，l公分的腫塊約有一億 個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數(shù)遠不止2億個腫 瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病
理演變過程相當長，可能是一年或兩年、甚至三年以上，很難證實的 是在這個過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和單獨的病灶。臨床上已 證實 一旦形成腫塊的同時，其他癌細胞通過不同途徑遷移到其他部 位克隆生長； 一旦切除原發(fā)灶后，其他器官復發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后 形成或轉(zhuǎn)移。因此，在臨床上以2公分以下的腫塊大小來界定早期與 否，不夠嚴謹(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶時，同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶， 不在我們表述的內(nèi)容中)，這時己經(jīng)是晚期了，這是導致癌癥死亡率 不降的真正原因。
隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研 究的深入展開，至今，我們己有可能在基因水平上做更精確的早期診 斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆)時或腫瘤干細胞的存在及突 破血管壁早期轉(zhuǎn)移時，就能做到早期預測診斷。
近來日本研究人員發(fā)現(xiàn)了導致急性白血病復發(fā)的一個基因。研究 小組從患白血病的實驗鼠體內(nèi)取出白血病細胞，去除Evi-l基因后再
移植到10只健康實驗鼠體內(nèi)；給另IO只健康實驗鼠完整移植白血病
細胞(含Evi-l基因)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前一組實驗鼠比后一組實驗鼠平 均晚發(fā)病一個月；而在殺滅二組實驗鼠體內(nèi)的白血病細胞后，前一組 實驗鼠沒有復發(fā)記性白血病，后一組實驗鼠再次發(fā)生白血病。對照實 驗已經(jīng)說明，Evi-l基因?qū)τ浶园籽〉陌l(fā)生、復發(fā)有推動作用，而 這與它作用于白血病干細胞有直接關系。在臨床上大約有三分之二以 上急性白血病病人經(jīng)治療后都有復發(fā)。其原因是數(shù)量極少的白血病干 細胞反復分裂、增生，使白血病細胞大量增殖。抗白血病藥物雖然能 夠殺滅白血病細胞，但難以殺滅其中的白血病干細胞，造成急性白血
病瘺治瘺發(fā)。日本研究人員在研究中注意到急性白血病病人體內(nèi)的基
因Evi-l在造血干細胞中非常活躍，他們推測Evi-l基因可能同樣作 用于白血病干細胞，使其不斷分裂，導致白血病細胞大量增殖。白血 病干細胞和腫瘤干細胞一樣對多種化療都耐藥，這可能是為什么目前 大多數(shù)治療不能通過根除所有腫瘤細胞來根治腫瘤的主要原因。急性 白血病患者體內(nèi)的基因Evi-1在造血干細胞中表達非常高，將它作為 白血病復發(fā)的靶標有非常重要的臨床診斷意義，同時能開發(fā)出一種早 期急性白血病復發(fā)的基因診斷試劑盒，有非常重要的臨床意義。
目前對Evi-l基因的研究檢測技術、方法多用于科研方面，不適 應臨床應用，特別是個性化的應用技術在臨床上尚未發(fā)現(xiàn)。根據(jù)現(xiàn)有 的文獻資料Evi-l基因的檢測試劑盒及相關技術未見報道。
本發(fā)明人在對急性白血病復發(fā)患者，用原位雜交技術進行檢測， 結(jié)果表明以上急性白血病復發(fā)患者Evi-l基因都過度表達。Evi-l基 因可作為白血病干細胞的檢測、追蹤、篩選(白血病干細胞增生、復 發(fā))工具，可以做白血病干細胞殘存的早期基因診斷的重要標志物。
中國專利文獻CN1556221公開了 "IC53基因及其相關產(chǎn)物診斷和治療結(jié) 腸癌的用途及一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒"。中國專利文獻CN1769485公開了"梓 孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法及其試劑盒"。中國專利文 獻CN1556410公開了 "一種魚類病毒的檢測試劑盒及其檢測方法"。中國專利 文獻CN1680597公開了"一種用于定量檢測丙型肝炎病毒(HCV)的熒光定量PCR 試劑盒"。中國專利文獻CN2918435，公開了 "一種檢測肥胖相關基因SNP的寡 核苷酸芯片及試劑盒"。但是，關于Evi-1基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢 測技術未見報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種Evi-l基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢 測急性白血病復發(fā)疾病藥物中的應用。
本發(fā)明的再一的目的是，提供一種Evi-l基因的原位雜交檢測試劑盒。 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種Evi-l基因原位雜交檢測方法。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是 一種Evi-l基因的原位雜交 檢測試劑盒在制備檢測急性白血病復發(fā)疾病藥物中的應用，所述的試 劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1 所示，Evi-1基因的核苷酸序列長度是4873bp， CDS是114. . 3461bp， 位于染色體3q24-q28"上。
所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.l所示的RNA序列。 所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。 所述的放射性核素選自SH、 35S、 1251或"P中的一種。 所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶 或熒光素中的一種。
所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。
其中，所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是 一種Evi-l基因的原 位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其中，所述的雜交探針序 列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標 記物。
為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是 一種Evi-l基因原
位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟
a、 將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；
b、 檢測a步驟得到的雜交復合體。
所述a步驟中形成雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42'C;核酸雜 交的時間為16—24小時，所述的底物選用血液細胞標本或組織細胞標本。
本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術和組化免疫方法相結(jié) 合，以Evi-1基因為檢測對象，合成探針是Evi-l基因的DNA或RNA 序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的RNA'的表達 量。原位雜交技術的顯示方法能提供Evi-l基因的半定量或定量表達 程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達量，正常人 Evi-1基因表達低或不表達，即不顯色Evi-l基因在急性白血病病人 和正常人有顯著差異，該基因的表達量比正常人表達量都高。本發(fā)明 的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。 本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步 驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、 結(jié)果報告，其中雜交的具體步驟包括 儀器操作
1) :將待測標本放入反應槽中；
2) .儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3) .儀器自動棄去液體，自動后固定；
4) .儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5) .儀器自動棄去液體，自動清洗；
6) .儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7) .儀器自動棄去液體，自動清洗；8) .儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9) .儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10) .取出封片鏡檢。
本發(fā)明優(yōu)點在于
1、 本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。
2、 本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推
廣?？朔四壳皩vi-l基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而這些方法
多用于科研方面，不適應臨床應用的缺陷。
3、 本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測急性白血病復發(fā)的病理
演變過程，本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標志物， 以及影像醫(yī)學檢査有顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上(急性白血
病干細胞增殖、復發(fā)早期)檢測Evi-l基因異常表達，急性白血病生 化指標和細胞學檢測未產(chǎn)生異常之前，能及早做到以上基因表達異常 的信息采集，給臨床急性白血病病'患一個真正的早期復發(fā)診斷以及治 療后轉(zhuǎn)移復發(fā)及早預測。這樣才有可能實施的急性白血病早期診斷、 早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治急性白血病惡疾。
圖1是本發(fā)明實施例中癌癥病人Evi-l過量表達圖片。 圖2是本發(fā)明實施例中正常人Evi-l表達圖片。
具體實施方式
下面結(jié)合圖對本發(fā)明提供的一種Evi-l基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢 測方法和應用的具體實施方式
做詳細說明。
實施例1
一種Evi-1基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物、增 效劑，其中，所述的雜交探針序列如SEQ IDNO. 1所示。雜交探針用 地高辛標記。試劑盒中的其它液體和標本組成如下
消化液100y 1/管l管/盒無色透明液體
保護液100u 1/管l管/盒無色透明液體
預雜交液1300 u 1/管2管/盒無色透明液體
正義雜交液10lil/管l管/盒無色透明，體
反義雜交液10ti 1/管l管/盒無色透明液體
封閉液1000 u 1/管l管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體lul/管l管/盒無色透明液體
顯色劑A175u 1/管l管/盒黃色液體
顯色劑B320ul/管l管/盒無色透明液體
緩沖液I 10x90ml/瓶l瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液n iox80ml/瓶l瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液m iox20m/瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV 10x90ml/瓶l瓶/盒淺黃色或無色透明液體
固定液90ml/瓶l瓶/盒無色透明液體
陽性對照標本6片/盒
上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)
1、 消化液20mg/ml蛋白酶K, 100mg蛋白酶K，力n DEPC- H20 5ml;
2、 保護液0.2g的glycine加入lml的1X緩沖液I;
3、 預雜交液1X緩沖液II 7.5ml 50 XD 3ml
10mg/ml yest t-RNA 750ul llmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0. 04M EDTA 3ml 50% formamide 15ml
4、 封閉液0.03g的bloking (購買自羅氏公司)加入lml IX緩沖液
III;
5、 lOx緩沖液I: (PH7. 1-7. 4)
NaCl 80g
Na2HP04'12H20 3 60g KC1 2g KH2P04 2g
加三蒸水至ll,并高壓滅菌；
6、 lOx緩沖液II: (PH7.0) NaCl 175.3g
檸檬酸鈉88. 2g HC1幾滴
加三蒸水至ll,并高壓滅菌；
7、 緩沖液III: (PH7.9) Tris 121. lg
NaCl 87.66g HC160ml左右
加三蒸水至U，并高壓滅菌；
8、 緩沖液IV:
1M Tris-HCl(卿.5): Tirs 121. lg加HC1 3ml左右，加水900ml，調(diào)PH 至9.5，加水至ll，并高壓滅菌；
1M NaCl: NaCl 58. 44加水至11，并高壓滅菌；
0. 5MMgCl2: 101.65g MgCl2.6H20加水至11，并髙壓滅菌；
9、 固定液多聚甲醛40g加1X緩沖液I至ll，稍加熱(約50-60度)攪 拌至溶解；
10、 顯色劑A: NBT lg加70。/。DMF11.44ml;
11、 顯色劑B: BCIP lg加100%DMF30ml。 本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。 實施例2
一種Evi-l基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應用 一、標本處理
1、 用10ml的離心管，裝4. 5ml淋巴細胞分離液，再將3 ml抗凝血緩慢 加入含有淋巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液=1:1.5)的離心管 中，2000r/min離心10 min;
2、 吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的1X緩沖液 I，混勻，1500g/min離心10 min;
3、 棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I,混勻，1500g/min離心10 min;
4、 棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴 在玻片上推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機制片。)3 ml血，可以 做4張片子；
5、 用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1 X緩沖液I洗5min。 每缸可以放16片；
6、 標本可保存在-2(TC，或繼續(xù)做實驗。
二、 將試劑盒中試劑配制成使用濃度
1、 將10X緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成1X緩沖液I ;
2、 將20 X緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2 X緩沖液II;
按1:100稀釋成0. 2 X緩沖液II;按1:200稀釋成0. 1X緩沖液II;
3、 將IOX緩沖液III用三蒸水按1:10稀釋成1 X緩沖液III;
4、 IOX緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成X緩沖液IV (取ltt， 2#， 3#各 10ml,加水至100ml既可)。
三、 實驗步驟
1、 取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作復査用)及陽性對照標本兩張 (每次實驗做一對陽性對照)；
2、 在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1X緩沖液199. 9ml，即為使用濃 度)20 ml。 37。C水浴預熱10分鐘。放進16張玻片，37。C處理12 min，再用1 X緩沖液I洗5min;
3、 用0. 2%的保護液(保護液lml加1 X緩沖液199ml即為使用濃度)洗10min， 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然干燥；
4、 將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放 在42'C恒溫水浴箱中3h以上；
5、 取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%， 90%, 95%的乙醇各洗 2min ，自然干燥；
6、 將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標本兩張， 一張加正義雜交液20ul/片，
另一張加反義雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42t:恒溫水浴 箱中16-24h;
7、 取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42*€恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min 在42。C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min 在42-C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min;
8、 用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9、 將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0. 5%1封閉液(lml封閉液加5mllX緩沖液III) 100ul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min;
10、 取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；
11、 將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8mllX緩沖液 111)100ul/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min;
12、 取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;
13、 1X緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加 到30mllX緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；
14、 用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的1 X緩沖液I混勻)封片 鏡檢。
四、結(jié)果判斷
在光鏡下計數(shù)100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。 陽性對照標本加反義雜交液的應該80%以上染上紫色。 所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對照應無色。
癌癥病人Evi-l過量表達圖片見圖1。正常人Evi-1表達圖片見圖2。 地高辛標記的cDNA、 RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)
點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等
缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫 組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷 目的基因的表達量。
本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中 的Evi-l基因表達量，用來確定急性白血病是否復發(fā)。研究表明，Evi-l基 因是白血病干細胞增殖的相關基因，因為Evi-l基因在正常人中不表達，如 果Evi-l基因表達高，說明急性白血病已復發(fā)，從而獲得癌癥的診斷信息。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通 技術人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些 改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
SEQUENCE LISTING
〈110〉芮屈生物技術(上海)有限公司
〈120〉 一種Evi-l基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用
〈130〉 /
〈160〉 1
<170〉 Patervtln version 3. 1
<210> 1
〈211〉 4873
<212〉 DNA
<213〉 智人(Homo sapiens)
<400〉 1
caacatcgtg tgctgcttcg cgagaaagtc tcatagggct tcttgactaa agcccttgga tagacgaatt ttacaatgtg aagttctgca ggctcaagta cattagattc gctggctgtt taaatgatca gatattctat agagtagttg tgttcatgaa ga_gcgaagac tatccccatg ggc犯tatcg ctgcg犯gac tgtgaccagc accaaaagtt txcatgcagt actcctcact agoaaaaact cgaaagcgag aatgatctcc aatgtgacca agtttttcct gatttgcaaa aagagaggga atacaagtgt gatcagtgtc ttcgccacca gatgtcacat gacagtggaa ttttcacgga ccctagcaac cttcagcggc cccatgcatg cccggagtgt ggcaaaacgt agcacatcca cagcagtgtg aagcccttta
acattcggac cctttggcta gattgcttat 60
gcactgggtt tttcttgaag tatatgatct 120
tagatgccag tcaaccagat gttggaagct 180
atgatcagca caaccttgtt gcatgccaga 240
cagacattgc gccgggagag gagcttctgc 300
aaactatggc gccggatatc cacgaagaac 360
tctttgaatc taaggctgaa ctagcagatc 420
cagcattttc aatggttgaa gaggactttc 480
aagagataca cacgatccag gagtgtaagg 540
gcctggagaa acacatgctg tcacatactg 600
ccaaggcatt taactggaag tccaatttaa 660
agcactatga atgtgaaaac tgtgccaagg 720
acattcgctc tcagcatgtc ggtgcccggg 780
ttgccacttc gtcgggcctc aaacaacaca 840
tctgtgaggt ctgccataaa tcctatactc 900 16
agttttcaaa cctttgccgt cataagcgca tgcatgctga ttgcagaacc caaatcaagt %0
gcaaagactg tggacaaatg ttcagcacta cgtcttcctt aaataaacac aggaggtttt 1020
gtgagggcaa gaaccatttt gcggcaggtg gattttttgg ccaaggcatt tcacttcctg 謂O
gaaccccagc tatggataaa acgtccatgg ttaatatgag tcatgccaac ccgggccttg 1140
ctgactattt tggcgccaat aggcatcctg ctggtcttac ctttccaaca gctcctggat 1200
tttcttttag cttccctggt ctgtttcctt ccggcttgta ccacaggcct cctttgatac 1260
ctgctagttc tcctgttaaa ggactatcaa gtactgaaca gacaaacaaa agtcaaagtc 1320
ccctcatgac acatcctcag atactgccag ctacacagga tattttgaag gcactatcta 1380
犯cacccatc tgtaggggac aat犯gccag tggagctcca gcccgagagg tcctctg犯g 1440
agaggccctt tgagaaaatc agtgaccagt cagagagtag tgaccttgat gatgtcagta 1500
caccaagtgg cagtgacctg gaaacaacct cgggctctga tctggaaagt gacattgaaa 1560
gtg8t肌3ga g犯attt3aa gaaaal:ggtgi eia^tgttcaa agacaaagts agccctcttc 1620
agaatctggc ttcaataaat aataagaaag aatacagcaa tcattccatt ttctcaccat 1680
ctttagagga gcagactgcg gtgtcaggag ctgtgaatga ttctataaag gctattgctt 1740
ctattgctga aaaatacttt ggttcaacag gactggtggg gctgcaagac aaaaaagttg 1800
gagctttacc ttacccttcc atgtttcccc tcccattttt tccagcattc tctcaatcaa 1860
tgtacccatt tcctgataga gacttgagat cgttaccttt gaaaatggaa ccccaatcac 1920
caggtgaagt aaagaaactg cagaagggca gctctgagtc cccctttgat ctcaccacte 1980
agcgaaagga tgagaagccc ttgactccag tcccctccaa gcctccagtg acacctgcca 2040
caagccaaga ccagcccctg gatctaagta tgggcagtag gagtagagcc agtgggacaa 2100
agctgactga gcctcgaaaa aaccacgtgt ttgggggaaa aaaaggaEigc犯cgtcgaat 2160
caagacctgc ttcagatggt tccttgcagc atgcaagacc cactcctttc tttatggacc 2220
ctatttacag agtagagaaa ag犯犯ct犯ctgaccc^ct tgaagcttta aaagagaaat 2280
acttgaggcc ttctccagga ttcttgtttc acccacaatt ccaactgcct gatcagagaa 2340
cttggatgtc agctattgaa aacatggcag aaaagctaga gagcttcagt gccctgaaac 2400
ctgaggccag tgagctctta cagtcagtgc cctctatgtt caacttcagg gcgcctccca 2460
atgccctgcc agagaacctt ctgcggaagg gaaaggagcg ctatacctgc agatactgtg 2520
gcaagatttt tccaaggtct gcaaacctaa cacggcactt gagaacccac acaggagagc 2580
agccttacag atgcaaatac tgtgacagat catttagcat atcttctaac ttgcaaaggc 2640
atgttcgcaa catccacaat aaagagaagc catttaagtg tcacttatgt gataggtgtt 2700
ttggtcaaca aaccaattta gacagacacc taaagaaaca tgagaatggg aacatgtccg 2760
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ccagatttgt tttctttttg tttgtaatct 4740
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487權(quán)利要求
1. 一種Evi-1基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測急性白血病復發(fā)疾病藥物中的應用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述的雜交探針 序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序歹!j。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的標記 物選自放射性核素或非放射性標記物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述的放射性核 素選自3H、 35S、 1251或32P中的一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述的非放射性 標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于所述的非放射性 標記物優(yōu)選自地高辛。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8. —種Evi-l基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物， 其特征在于，所述的雜交探針序列如SEQ IDNO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。
9. 一種Evi-l基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包 括以下步驟a、 將權(quán)利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接 觸，形成雜交復合體；b、 檢測a步驟得到的雜交復合體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形 成雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間 為16 — 24小時，所述的底物選用血液細胞標本或組織細胞標本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種Evi-1基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種Evi-1基因原位雜交檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測急性白血病復發(fā)疾病藥物中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101386888SQ200810202080
公開日2009年3月18日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司