專(zhuān)利名稱(chēng)：慢病毒-胸苷激酶基因構(gòu)型及其獲得方法和臨床應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因新構(gòu)型，具體涉及一種慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型及其獲得方法和臨床應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅人類(lèi)健康的首要疾病，僅在我國(guó)每年因腫瘤死亡人數(shù)就達(dá)150萬(wàn)，根據(jù)目前癌癥發(fā)病趨勢(shì)，到2020年全球每年新增癌癥患者人數(shù)將達(dá)到1500萬(wàn)。WHO預(yù)測(cè)21世紀(jì)癌癥將成為人類(lèi)的"頭號(hào)殺手"。因此探索腫瘤治療的新技術(shù)新方法具有十分重要的意義。基因治療正以巨大的治療潛力展現(xiàn)在人們面前，其發(fā)展代表了根治腫瘤的方向。
HSV1-TK基因結(jié)合GCV是最常用于臨床基因治療的自殺基因系統(tǒng)之一。1980年Steven L. Mc Knight測(cè)定了單純皰疹病毒I型胸苷激酶基因全序列并確定了其丌放讀碼框(Steven L. McKnight， Nucleic Acids Research, 1980，8(24) :5949-5964. )， 1986年Moolten博士偶然發(fā)現(xiàn)TK基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞可使其對(duì)化療敏感性增加(Moolten， Cancer Res, 1986,46:5276—5281)，隨后人們對(duì)TK基因的抗癌作用進(jìn)行了研究，其治療腫瘤的基本原理是，當(dāng)TK被轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞后，其編碼的胸苷激酶可將無(wú)毒的前藥GCV磷酸化為細(xì)胞毒性產(chǎn)物，阻止細(xì)胞DNA合成，從而使靶細(xì)胞走向死亡(Tomicic MT, MutatRes， 2002, 505:1-11)。
顯然，如何獲得胸苷激酶基因構(gòu)型以及在臨床應(yīng)用具有高轉(zhuǎn)染效率、高效穩(wěn)定表達(dá)，是醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究者們最為關(guān)心的課題
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的，是為了提供一種在臨床應(yīng)用具有高轉(zhuǎn)染效率、高效穩(wěn)定表達(dá)的新型病毒載體基因構(gòu)型，即慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型。
本發(fā)明的第二個(gè)目的，是為了提f 一種慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型的制備方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的，是為了提供一種慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型的臨床應(yīng)用。
本發(fā)明的第一個(gè)目的可以采取如下技術(shù)方案達(dá)到
慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型，其特征是包括慢病毒載體LV、胸苷激酶片斷和CMV啟動(dòng)子，全構(gòu)件核苷酸長(zhǎng)8. 1Kb，胸苷激酶長(zhǎng)l.lKb、啟始片斷為18bp;全構(gòu)件的DAN序列如序列表SEQ IDNe: 1所示啟始片斷的序列為ATGGCTTCGTACCCCGGC。
本發(fā)明所述慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型如圖1所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的可以采取如下技術(shù)方案達(dá)到
慢病毒—胸苷激酶基因構(gòu)型的獲得方法，其特征在于包括如下步驟-
1)在序列為ATGGCTTCGTACCCCGGC啟始片斷的誘導(dǎo)下，將慢病毒載體LV與TK基因cDNA，經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化使胸苷激酶片斷插入慢病毒載體中，構(gòu)成初級(jí)構(gòu)件；
2)將1)中的初級(jí)構(gòu)件與輔助質(zhì)粒pLPl、pLP2、pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，提取培養(yǎng)上清液，80， OOOOg超速離心分離得到用于治療的慢病毒一胸苷激酶基因產(chǎn)品。
所述TK基因cDNA可以如序列表SEQ IDNs: 2所示；其中，紅色部分為T(mén)K基因序列，起始密碼子ATG，終止密碼子TGA， GAATTC為的酶切位點(diǎn)，CCGCGG為fecll的酶切位點(diǎn)，CCCGGG為fe邁I的酶切位點(diǎn)。
為T(mén)K基因PCR擴(kuò)增而設(shè)計(jì)的引物可以如序列表SEQ IDN2: 3所示。
用于DNA連接及載體構(gòu)建過(guò)程可以如圖2所示。
本發(fā)明的第三個(gè)目的可以采取如下技術(shù)方案達(dá)到-
慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型的臨床應(yīng)用，其特征是可以利用本發(fā)明所述的慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)件擴(kuò)增后的上清液制取基因產(chǎn)品，該產(chǎn)品可以制成治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等實(shí)體腫瘤的制劑。
本發(fā)明具有以下突出的有益效果
1、 本發(fā)明可利用慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)件擴(kuò)增后的上清液制取基因樣品，根據(jù)本慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)建系統(tǒng)在初步臨床前預(yù)實(shí)驗(yàn)中表明，無(wú)論在體外腫瘤細(xì)胞系或動(dòng)物模型中，該基因產(chǎn)品具有明確、高效、穩(wěn)定抗腫瘤效應(yīng)，安全性好，應(yīng)用方便，其中對(duì)腦膠質(zhì)瘤的臨床前期應(yīng)用中，有效率超過(guò)90%。應(yīng)用本載體系統(tǒng)可克服常用的腺病毒載體表達(dá)時(shí)間短暫、腺病毒本身抗原表達(dá)可引起人體免疫反應(yīng)的缺點(diǎn)，因此對(duì)手術(shù)不能完全切除、放化療效果不佳的惡性實(shí)體腫瘤有很好的應(yīng)用前景。
2、 本發(fā)明可高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染多種人體實(shí)體腫瘤，例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等，具有高抗癌作用，對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤臨床前期應(yīng)用中，有效率超過(guò)90%。


圖1是慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型圖。 圖2是DNA連接及載體構(gòu)建示意圖。 圖3是重組慢病毒質(zhì)粒pLenti6/5V-TK的測(cè)序結(jié)果。 具體實(shí)施例
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩說(shuō)明 實(shí)施例1:
慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型，其特征是包括慢病毒載體LV、胸苷激酶
片斷和CMV啟動(dòng)子，全構(gòu)件核苷酸長(zhǎng)8. 1Kb，胸苷激酶長(zhǎng)l.lKb、啟始片斷為 18bp;全構(gòu)件的DAN序列如序列表SEQ ID他1所示；啟始片斷的序列為 ATGGCTTCGTACCCCGGC。慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型如圖1所示。
本實(shí)施例所述慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型的制備方法包括如下歩驟
1、 LV慢病毒載體的獲得
理想的病毒載體能同時(shí)提供高效的基因轉(zhuǎn)移、長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因表達(dá)及生物 安全性。研究表明，以HIV-1為基礎(chǔ)構(gòu)建的這類(lèi)慢病毒載體具有可感染非分 裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長(zhǎng)期表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，適于 體內(nèi)基因治療，是目前較為理想的基因轉(zhuǎn)移載體(Naldini L， Science, 1996,272:263-267; Delenda C' J Gene Med，2004, 6:S125-138; Sinn PL， Gene Therapy, 2005， 12:1089-1098)。我們利用的pLenti6/5V-D-TOPO屬第三代慢 病毒載體質(zhì)粒，以ViraPower'*1 Lentiviral Expression Systems建立TK基 因表達(dá)的慢病毒包裝系統(tǒng)。所應(yīng)用的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)ViraPower'^Lentiviral Expression Systems為載體質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、rev質(zhì)粒和包膜蛋白質(zhì)粒4質(zhì) 粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞生產(chǎn)假病毒顆粒。該包裝系統(tǒng)中①去掉了 HIV的大部分的 蛋白編碼基因，不存在產(chǎn)生復(fù)制型H工V的可能性；②慢病毒載體的包裝質(zhì)粒 中缺失掉了 LTRs，因而載體基因組只能在生產(chǎn)細(xì)胞中表達(dá)，而不可能被整合 入病毒粒子中；③假型慢病毒載體無(wú)復(fù)制性，只攜帶外源基因，相當(dāng)均一， 無(wú)類(lèi)似于復(fù)制型月泉病毒 (replication competent adenoviruses, RCA)之類(lèi) 的成分；④載體基因組有自滅活機(jī)制，整合于宿主基因組后，不可能再被拯 救而產(chǎn)生可被包裝的病毒基因組。因,而其生物安全性極高。
2、 TK基因全長(zhǎng)cDNA編碼片斷
所述TK基因cDNA可以如序列表SEQ ID他2所示；其中，紅色部分為 TK基因序列，起始密碼子ATG，終止密碼子TGA， GAATTC為EcoR I的酶切位 點(diǎn)，CCGCGG為Sac II的酶切位點(diǎn)，CCCGGG為Sam I的酶切位點(diǎn)。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。
3、 DNA連接及載體構(gòu)建
DNA連接及載體構(gòu)建過(guò)程如圖2所示，具體包括如下過(guò)程
(1) 目的基因HSV-TK片段的獲取、純化及回收以AcMl和feJI雙酶 切質(zhì)粒pSNAV2. 0-TK(2. Omg/ml)，回收約1. 2 kb左右片段，獲取目的基因TK 片段；20ul酶切產(chǎn)物以含溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外 燈下觀(guān)察，切割目標(biāo)凝膠條帶，再用U-gene HQ&Q凝膠回收試劑盒II回收純 化，獲得可以用于構(gòu)建的HSV-TK基因片段。
(2) pLenti6/5V載體片段的獲取、純化及回收f(shuō)co/ I和i7 o I雙酶切質(zhì) 粒pLenti6/5V-EGFP (6. 7mg/ml)，回收7.0kb左右片段，獲取線(xiàn)性化的載體 片段；20iil酶切產(chǎn)物以含溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外 燈下觀(guān)察，切割目標(biāo)凝膠條帶，再用U-gene HQ&Q凝膠回收試劑盒II回收純 化，獲得可以用于構(gòu)建的pLenti6/5V載體片段。
(3) 目的基因HSV-TK片段與pL^nti6/5V載體片段的連接利用5"s7 I與 為同尾酶的關(guān)系，在LDNA連接酶促反應(yīng)下，目的基因HSV-TK片段以
粘端連接方式與pLenti6/5V載體片段連接。
(4) 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及菌液的篩選鑒定采用熱休克方法轉(zhuǎn)化 DH-5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，鋪氨卞的LB平板培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆菌斑接種 培養(yǎng)管搖菌擴(kuò)增，取菌液小提質(zhì)粒，各小提質(zhì)粒采用化o/ I和5"acII雙酶切
鑒定篩選。
(5) 重組質(zhì)粒pLenti6/5V-TK的提取及質(zhì)粒PCR、酶切和測(cè)序鑒定小提 質(zhì)粒經(jīng)化o/Pl和6^:n雙酶切篩選鑒定正確的菌液，再次搖菌，大量擴(kuò)增， 采用堿裂解法大量提取質(zhì)粒；以重組的pLenti6/5V-TK質(zhì)粒為模板，以合成 的HSV-TK基因上、下游引物進(jìn)行TK基因的PCR擴(kuò)增，TK基因5'端引物 5' -GCC AGA ATT CAT GGC TTC GTA CCC CGG C_3， ， 3'端引物5， -CTG CGA ATT CTC AGT TAG CCT CCC CCA'T-3'; 重組質(zhì)粒pLenti6/5V-TK分別 用S柳I單酶切、十J力oI雙酶切鑒定；小提的重組質(zhì)粒pLenti6/5V-TK 送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
(6) 表達(dá)TK基因的慢病毒包裝系統(tǒng)的建立利用ViraPower Lentiviral Expression Systems與我們構(gòu)建的重組慢病毒載體質(zhì)粒pLenti6/5V_TK,共 同建立TK基因表達(dá)的慢病毒包裝系統(tǒng)。其中包括表達(dá)載體質(zhì)粒 pLenti6/5V-TK、包裝質(zhì)粒(pLPl) 、 rev質(zhì)粒(pLP2)和包膜蛋白質(zhì)粒(pLP/VSVG) 4質(zhì)粒，包裝細(xì)胞293T細(xì)胞，以及用于慢病毒感染細(xì)胞篩選的抗生素一鹽酸 抗稻瘟菌素S (Blasticidin SHCl， BSD) 。 4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，使其大量擴(kuò)增，提取培養(yǎng)上清液，80，000g超速離心分離出可用于治療的慢病毒一胸 苷激酶產(chǎn)品。
(7)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行氯化銫(CsCL)純化，應(yīng)用空斑試驗(yàn)測(cè)出PFU效價(jià)，_70°。保存。
本發(fā)明應(yīng)用機(jī)理將TK基因通過(guò)慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞中使之表 達(dá)，繼之以一定途徑使用GCV，在其參與下胸苷激酶轉(zhuǎn)化單磷酸核苷為三磷酸 核苷，并與腫瘤新生DNA鏈結(jié)合，干擾DNA的合成而殺死腫瘤細(xì)胞，而且TK 基因抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)還能通過(guò)該系統(tǒng)獨(dú)特強(qiáng)大的"旁觀(guān)者效應(yīng)"，即攜帶TK 基因陽(yáng)性細(xì)胞的死亡，可以導(dǎo)致周?chē)鶷K基因陰性的細(xì)胞死亡，使其抗腫瘤效 應(yīng)放大。
7序列表
<110〉廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院
<120>慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型及其獲得方法和應(yīng)用 <160〉 1
<170> Patentln Version 3,3
<210> 1
<211〉 8094
<212>艦
<213〉人工序列
<220〉
<223>全構(gòu)件包括慢病毒載體LV、胸苷激酶片斷和CMV啟動(dòng)子，可以制成治療神經(jīng)膠質(zhì) 瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等實(shí)體腫瘤的制劑。
〈400〉 1
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<210〉 2
<211> 1608
<212〉畫(huà)
<213>人f序列
<220>
<223〉 TK基閃全長(zhǎng)cDNA編碼片斷序列。
<400〉 2
GCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACC60
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HXAreCACG TCTTTATCCT GGATTACGAC CAATCGCCC(; CCGGCTGCCG 1140 CTGCAACITA C(:T(XGGGAI GCTCCAGAC(: ('ACGTCACCA CCCCCGGCIC 1200 ATATGCGACC TGGCGCGCAC GTTTGCCCGG GAGATGGG(;G AGGCTAACTC 1260 AGAGGGC^^^TTCGAAG GTAAGCCTAT CCCTAACCCT CTCCTCGGTC 1320 GCGTACCGGT TAGTAATGAG TTTGGAATTA ATTCTGTGGA ATGTGTGTCA 1380 GGMAGTCCC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT 1440 GCAACCAGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA GAAGTATGCA 1500 CTCAATTAGT CAGCAACCAT AGTCCCGCCC CTAACTCCGC CCATCCCGCC 1560 CCCAGTTCCG CCCATTCTCC GCCCATGGCT GACTAATT 1608
210>3 <2]1> <212>DNA <213>人I序列 <220>
<223〉為了合成HSV-TK基閃而設(shè)計(jì)的引物，用作TK基因PCR擴(kuò)增。 <400>3
TK基閃5'端引物5' -GCC AGA ATT CAT GGC TTC GTA CCC CGG C-3'; TK基囚3'端引物5' -CTG CGA ATT CTC AGT TAG CCT CCC CCA T-3'
權(quán)利要求
1、慢病毒—胸苷激酶基因構(gòu)型，其特征是包括慢病毒載體LV、胸苷激酶片斷和CMV啟動(dòng)子，全構(gòu)件核苷酸長(zhǎng)8.1Kb，胸苷激酶長(zhǎng)1.1Kb、啟始片斷為18bp；全構(gòu)件的DAN序列如序列表SEQ ID№1所示；啟始片斷的序列為ATGGCTTCGTACCCCGGC。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型，其特征是所述慢病毒—胸苷激 酶基因構(gòu)型如圖1所示。
3、 慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型的獲得方法，其特征在于包括如下歩驟1)在序列為ATGGCTTCGTACCCCGGC啟始片斷的誘導(dǎo)下，將慢病毒載體LV與TK基 因cDNA，經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化使胸苷激酶片斷插入慢病毒載體中，構(gòu)成初級(jí)構(gòu)件；2)將l)中的初級(jí)構(gòu)件與輔助質(zhì)粒pLPl、 pLP2、 pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò) 增，提取培養(yǎng)上清液，80， OOOOg超速離心分離得到用于治療的慢病毒一胸苷激酶基因產(chǎn)品。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型的獲得方法，其特征在于所述 TK基因cDNA如序列表SEQ ID他2所示；其中，紅色部分為T(mén)K基因序列，起始密碼 子ATG，終止密碼子TGA， GAATTC為五09i I的酶切位點(diǎn)，CCGCGG為的酶切位點(diǎn)， CCCGGG為&w I的酶切位點(diǎn)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型的獲得方法，其特征在于為T(mén)K 基因PCR擴(kuò)增而設(shè)計(jì)的引物如序列表SEQ IDN2: 3所示。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的慢病毒一.胸苷激酶基因構(gòu)型的獲得方法，其特征在于用于 DNA連接及載體構(gòu)建過(guò)程如圖2所示。
7、 慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型的臨床應(yīng)用，其特征是利用本發(fā)明所述的慢病毒一胸苷 激酶基因構(gòu)件擴(kuò)增后的上清液制取基因產(chǎn)品，該產(chǎn)品可以制成治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、 黑色素瘤、肝癌、肺癌等實(shí)體腫瘤的制劑。
8、 如權(quán)利要求7所述的慢病毒一胸苷激酶基因構(gòu)型的臨床應(yīng)用，其特征是利用慢病毒 一胸苷激酶基因構(gòu)件擴(kuò)增后的上清液制取基因產(chǎn)品，該產(chǎn)品可以制成治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列 腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等實(shí)體腫瘤的制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種慢病毒-胸苷激酶基因構(gòu)型及其獲得方法和臨床應(yīng)用，其特征是所述基因包括慢病毒載體LV、胸苷激酶片斷和CMV啟動(dòng)子，全構(gòu)件核苷酸長(zhǎng)8.1Kb，胸苷激酶長(zhǎng)1.1Kb、啟始片斷為18bp；全構(gòu)件的DAN序列如序列表SEQ ID №1所示；啟始片斷的序列為ATGGCTTCGTACCCCGGC?？梢岳帽景l(fā)明所述的慢病毒-胸苷激酶基因構(gòu)件擴(kuò)增后的上清液制取基因產(chǎn)品，該產(chǎn)品可以制成治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等實(shí)體腫瘤的制劑。
文檔編號(hào)C12N15/867GK101481708SQ20081019875
公開(kāi)日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者戴學(xué)軍, 健 林, 王偉民 申請(qǐng)人:廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院