一種d1型細(xì)胞質(zhì)不育強(qiáng)恢復(fù)系的選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及雜交水稻應(yīng)用領(lǐng)域，具體而言，涉及一種D1型細(xì)胞質(zhì)不育強(qiáng)恢復(fù)系的 選育方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 70年代我國(guó)應(yīng)用三系法培育雜交水稻獲得成功，并在生產(chǎn)上大面積推廣種植，實(shí) 現(xiàn)了我國(guó)水稻單產(chǎn)的第二次飛躍。1976-2005年，我國(guó)雜交水稻累計(jì)種植面積52. 5億畝， 增收稻谷約6. 5億噸，因此雜交水稻的發(fā)展是提高糧食產(chǎn)量、解決糧食安全問(wèn)題的重要途 徑（袁隆平，2008)。三系雜交水稻利用的基礎(chǔ)是細(xì)胞質(zhì)雄性不育，自從野敗型細(xì)胞質(zhì)雄性 不育系被發(fā)現(xiàn)與大面積推廣應(yīng)用以來(lái)，上世紀(jì)70年代到80年代中期，育種家培育出多達(dá)60 多種細(xì)胞質(zhì)源來(lái)源于野敗型、云南滇型〇)ian I和Dian II )、紅蓮型、岡型、K型和馬協(xié)型 等，盡管細(xì)胞質(zhì)源和敗育特點(diǎn)有較大差異，可分為孢子體不育和配子體不育兩種類型（朱 英國(guó)，2000)。其中，云南滇型、包臺(tái)型和紅蓮型為配子體不育系，野敗型、Dian型、K型和岡 型等為孢子體敗育類型，大部分的配子體敗育恢保關(guān)系一致，而大部分孢子體敗育類型的 恢保關(guān)系一致，配子體敗育和孢子體敗育類型的恢保關(guān)系相反。
[0003] 目前，國(guó)際公認(rèn)細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型主要為野敗、紅蓮、包臺(tái)三種類型，其中前面 兩種不育細(xì)胞質(zhì)都來(lái)源于普通野生稻。20世紀(jì)70年代，國(guó)內(nèi)外育種家還利用普通野生稻為 細(xì)胞質(zhì)供體培育了其他13種細(xì)胞質(zhì)類型，如崖城野生稻細(xì)胞質(zhì)、田東野生稻細(xì)胞質(zhì)等（朱 英國(guó)，2000)，因此，從野生稻中挖掘細(xì)胞質(zhì)是培育新型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的一個(gè)重要途徑。 東鄉(xiāng)野生稻為多年生野生稻，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的世界上分布最北的野生稻，被國(guó)內(nèi)外譽(yù)為 "野生植物大熊貓"（黃依南等，2012)。
[0004] 上世紀(jì)80年代，江西省農(nóng)科院水稻所利用東鄉(xiāng)野生稻作為細(xì)胞質(zhì)供體培育出雄 性不育系國(guó)際油粘A，但一直沒(méi)有找到對(duì)該新型不育系育性恢復(fù)良好的恢復(fù)源，因此，沒(méi)有 得到推廣和利用。近年來(lái)，江西省超級(jí)水稻研宄發(fā)展中心與宜春農(nóng)科所合作，以東鄉(xiāng)野生稻 為細(xì)胞質(zhì)供體培育了新型東野不育系D1A，并以D1A為細(xì)胞質(zhì)來(lái)源，分別與培矮64、天豐B、 K17B、協(xié)青早8、11-328、24548、岳48、9311等回交，獲得一批新東野不育系。新型東野不育 系D1A以及與新型東野不育系D1A雜交得到的新東野不育系，統(tǒng)稱為新型東野D1型細(xì)胞質(zhì) 不育系。新型東野D1型細(xì)胞質(zhì)不育系為孢子體不育系，分子標(biāo)記鑒定該不育系不含有已克 隆的孢子體不育基因WA352?；ǚ蹟∮愋蜑闊o(wú)花粉敗育，表現(xiàn)為花藥瘦小、白色、部分畸形 呈鉤狀，染色鏡檢，幾乎連典敗的花粉粒都檢測(cè)不到，敗育非常徹底，育性極易穩(wěn)定，且保 持譜廣，絕大多數(shù)栽培品種可為其保持系，只在同質(zhì)野生稻中找到恢復(fù)系，并實(shí)現(xiàn)同質(zhì)野生 稻恢復(fù)系恢復(fù)基因的栽培稻轉(zhuǎn)育，最高恢復(fù)率達(dá)到85. 1%。因此，它的敗育特點(diǎn)、分子機(jī)理 和恢保關(guān)系與目前推廣的其他不育系完全不同，為一種新型孢子體不育類型，暫命名為D1 型敗育類型。該不育系的研宄及應(yīng)用推廣對(duì)于豐富雜交水稻類型，促進(jìn)雜交水稻的可持續(xù) 發(fā)展具有重要價(jià)值。
[0005] 植物線粒體基因組由于線粒體基因組重組導(dǎo)致植物線粒體基因組序列差異很大， 產(chǎn)生了特異的序列，線粒體特異序列可開(kāi)發(fā)出多態(tài)性標(biāo)記用于細(xì)胞質(zhì)、品種及純度的鑒定。 比較分析胡蘿卜線粒體基因結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)atp6-nad3-rpsl2序列為新型細(xì)胞質(zhì)雄性不 育系DCGMS特異序列區(qū)，該序列可開(kāi)發(fā)成標(biāo)記用于該不育系的鑒定（Lee et al.，2009)。 洋蔥中發(fā)現(xiàn)1個(gè)新嵌合基因〇rf725,利用該基因與coxl的序列特異性設(shè)計(jì)特異引物可將 CMS-T、CMS-C和Normal三種細(xì)胞質(zhì)類型型區(qū)分開(kāi)（Kim et al.，2009)。根據(jù)水稻線粒體 基因coxIII, cob, atp9, rps3and 18SrRNA的特異序列開(kāi)發(fā)的CAPS標(biāo)記可用于水稻雄性不 育系Pusa6A的種子純度鑒定（Umakanta et al.,2010)。通過(guò)比較水稻CW-CMS、LD-CMS、 WA-CMS、N和Nipponbare線粒體基因組獲得57個(gè)大小在102-5745bp的線粒體基因組特異 序列，這些特異序列占到水稻線粒體基因組14. 5%，通過(guò)比較分析獲得了 3個(gè)在所分析的 14個(gè)不育系中均能擴(kuò)出條帶的分子標(biāo)記，3個(gè)在所分析的7個(gè)配子體不育系均能擴(kuò)出條帶 的分子標(biāo)記，9個(gè)在所分析的7個(gè)孢子體不育系均能擴(kuò)出條帶的分子標(biāo)記，該類型的特異標(biāo) 記可用于孢子體不育系和配子體不育系的鑒定（xie et al.，2014)。
[0006] 雜交選育恢復(fù)系是目前恢復(fù)系選育的一種常用方法，一般是選擇兩個(gè)或多個(gè)都攜 帶恢復(fù)基因的材料雜交、回交、自交選育成新恢復(fù)系，或者選擇攜帶恢復(fù)基因的材料與沒(méi)有 恢復(fù)基因材料雜交、回交和自交，高代選單株測(cè)恢選擇恢復(fù)率強(qiáng)的單株獲得新強(qiáng)恢復(fù)系。前 者，不需要擔(dān)心恢復(fù)的問(wèn)題，獲得的雜交后代都能正常的恢復(fù)不育系，后者則需要通過(guò)測(cè)恢 鑒定雜交后代的恢復(fù)度。D1型細(xì)胞質(zhì)不育系為一種新型孢子體不育系，其敗育特點(diǎn)、分子 機(jī)理和恢保關(guān)系與目前推廣的其他不育系完全不一樣，本研宄團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)多年研宄表明，該 不育系存在多個(gè)主效恢復(fù)基因，同時(shí)還有幾個(gè)微效恢復(fù)基因起調(diào)控作用，由于恢復(fù)基因多， 恢復(fù)基因和不育基因的作用模式復(fù)雜，導(dǎo)致雜交組合F2的恢復(fù)度在0% -85. 1%之間，絕大 部分單株的育性低于70%，無(wú)法作恢復(fù)系用；另外，D1型不育只在同質(zhì)野生稻鑒定到恢復(fù) 源，恢復(fù)譜比較窄，絕大部分水稻品種對(duì)它都是保持系，特別是優(yōu)良的栽培品種都是其保持 系。因此，獲得優(yōu)良的D1型不育的新強(qiáng)恢復(fù)系必須通過(guò)攜帶恢復(fù)基因的材料與沒(méi)有恢復(fù)基 因優(yōu)良栽培材料雜交、回交和自交，但由于雜交導(dǎo)致的染色體重組，攜帶多個(gè)恢復(fù)基因的強(qiáng) 恢復(fù)系（恢復(fù)率大于80%)株系較少，如果選單株分別去測(cè)恢，工作量非常的大，而且效果 又不好，極難獲得育性高，綜合農(nóng)藝性狀又好的恢復(fù)系候選株系。
[0007] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種D1型細(xì)胞質(zhì)不育強(qiáng)恢復(fù)系的選育方法，該方法可靠 有效，極易獲得攜帶多個(gè)恢復(fù)基因的強(qiáng)恢復(fù)率的恢復(fù)系。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0010] 一種D1型細(xì)胞質(zhì)不育強(qiáng)恢復(fù)系的選育方法，包括以下步驟：
[0011] 以含D1型不育細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)系作為母本，與優(yōu)良恢復(fù)系為父本進(jìn)行雜交，得到F1 代；
[0012] 選擇性狀優(yōu)良的F1代與父本進(jìn)行回交，得到BC^代；
[0013] 選擇性狀優(yōu)良的BC^代與父本進(jìn)行回交，得到BC^代；
[0014] 這樣依次將性狀優(yōu)良的子代與父本進(jìn)行回交，得到BC/i代；
[0015] 選擇F1代以后的子代進(jìn)行連續(xù)自交，至得到穩(wěn)定的D1型細(xì)胞質(zhì)不育強(qiáng)恢復(fù)系。
[0016] 本發(fā)明提供的D1型細(xì)胞質(zhì)不育強(qiáng)恢復(fù)系的選育方法，以同質(zhì)恢復(fù)系作為強(qiáng)恢復(fù) 系的細(xì)胞質(zhì)供體，與優(yōu)良恢復(fù)系雜交，得到的F1代，將F1代與父本回交，再選擇具有育性 的、性狀優(yōu)良的子代與父本進(jìn)行回交，每個(gè)子代經(jīng)回交后，得到的株系只要育性正常，均是 D1型強(qiáng)恢復(fù)系選育的目標(biāo)單株，不需要測(cè)恢鑒定恢復(fù)率，只要考慮其他農(nóng)藝性狀；然后再 通過(guò)將回交得到的株系進(jìn)行自交，至得到穩(wěn)定的D1型細(xì)胞質(zhì)不育強(qiáng)恢復(fù)系。該方法可靠有 效，極易獲得攜帶多個(gè)恢復(fù)基因的強(qiáng)恢復(fù)率的恢復(fù)系。
[0017] 優(yōu)選地，所述含D1型不育細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)系為DR2、DR3、DR5中的任一種。DR2、DR3、 DR5具體見(jiàn)申請(qǐng)?zhí)?01410190251所述，這三種株系的可育花粉率、結(jié)實(shí)率均較高，利于獲得 強(qiáng)恢復(fù)系。
[0018] 更優(yōu)選地，所述含D1型不育細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)系為DR5。DR5的自然結(jié)實(shí)率達(dá)到85% 以上，是一種具有高恢復(fù)度的D1型細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)系。
[0019] 優(yōu)選地，所述父本為優(yōu)良恢復(fù)系9311或優(yōu)良恢復(fù)系華占。經(jīng)驗(yàn)證，父本為優(yōu)良恢 復(fù)系9311或優(yōu)良恢復(fù)系華占，與含D1型不育細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)系作為母本進(jìn)行雜交，易于積累 D1型細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)系的主效恢復(fù)基因，最終得到的D1型細(xì)胞質(zhì)不育強(qiáng)恢復(fù)系綜合農(nóng)藝性 狀更為優(yōu)良。
[0020] 進(jìn)一步地，所述性狀優(yōu)良為育性高，株型好的株系。通過(guò)挑選性狀優(yōu)良的株系進(jìn)行 回交，利于積累D1型細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)系的主效恢復(fù)基因，從而獲得D1型細(xì)胞質(zhì)不育強(qiáng)恢復(fù) 系。
[0021] 進(jìn)一步地，性狀優(yōu)良的株系還進(jìn)行了分子鑒定，選擇含D1型不育細(xì)胞質(zhì)的株系。 通過(guò)分子鑒定，進(jìn)一步確定用于回交或自交的株系含有D1型細(xì)胞質(zhì)，節(jié)約程序，并保證D1 型細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)系的主效恢復(fù)基因的積累，從而獲得D1型細(xì)胞質(zhì)不育強(qiáng)恢復(fù)系。
[0022] 優(yōu)選地，所述分子鑒定采用PCR進(jìn)行，所述PCR采用的引物為引物DM-1、引物 DM-2、引物DM-3中的任一種或多種；
[0023] 其中，所述引物DM-1為：
[0024] F:5' -GGAGTTGCTGTAGGGTCG-3'
[0025] R :5' -CAAGTTGGCTTTGCTGAT-3'；
[0026] 所述引物DM-2為：
[0027] F :5' -CTCGCTTTAGTAGTGGTG-3'
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