葉綠體dna的snp標(biāo)記鑒定大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)方法
【專利摘要】發(fā)明提供了一種葉綠體DNA的SNP標(biāo)記鑒定大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)方法，該方法也可應(yīng)用于區(qū)分大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和含有正常細(xì)胞質(zhì)的保持系。該方法包括如下步驟，提取大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和其配套的保持系種子基因組DNA作為擴(kuò)增模板，選用4對(duì)葉綠體DNA的SNPs標(biāo)記，在4對(duì)SNPs的側(cè)翼序列分別設(shè)計(jì)1對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶酶切，通過不育系和保持系酶切產(chǎn)物長(zhǎng)度不同進(jìn)行鑒定。上述方法可以快速、準(zhǔn)確地鑒定大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育細(xì)胞質(zhì)和正常可育細(xì)胞質(zhì)；也可用于檢測(cè)不育系（含有不育細(xì)胞質(zhì)）繁殖過程中，混雜的保持系（含有可育細(xì)胞質(zhì)），為保證大豆不育系種子生產(chǎn)過程中純度要求提供保障。
【專利說明】葉綠體DNA的SNP標(biāo)記鑒定大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了一種葉綠體DNA的SNP標(biāo)記鑒定大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)方法，用于鑒定大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)和正?？捎?xì)胞質(zhì)，也可應(yīng)用于區(qū)分大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系制種過程中不育系(含有不育細(xì)胞質(zhì))里混入的父本保持系(含有可育細(xì)胞質(zhì))，屬于分子標(biāo)記檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS) “三系”由不育系、保持系和恢復(fù)系組成，雄性不育細(xì)胞質(zhì)的載體是不育系，而雄性可育細(xì)胞質(zhì)的載體是保持系。吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院首先育成了大豆CMS “三系”。CMS被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物雜種優(yōu)勢(shì)利用，其最大的優(yōu)點(diǎn)是可以在制種時(shí)母本行獲得100%不育株，雄性不育系可以免除人工去雄，節(jié)約人力，降低種子成本，還可保證種子的純度。
[0003]盡管雜交大豆能大幅度提高產(chǎn)量，但是大豆雜交制種技術(shù)還沒有大范圍推廣，除種子的繁殖量受限外，還存在些其他問題。其中需要拓寬配套的不育和可育的種質(zhì)資源，但是找到和不育細(xì)胞質(zhì)配套的保持系可育細(xì)胞質(zhì)需要較長(zhǎng)時(shí)間。此外在大豆雜交種創(chuàng)制過程中，除以不育系作母本同恢復(fù)系為父本進(jìn)行雜交可獲得雜交種外，制種還需要繁殖CMS “三系”。其中保持系和恢復(fù)系由于自身可育，種子可由自交繁殖獲得；而不育系自身不育，種子只能通過其作為母本與同型保持系父本雜交獲得，而不育系與同型保持系除育性外，其他農(nóng)藝性狀完全相同，在繁殖的過程中常常由于田間種植、收獲脫粒等環(huán)節(jié)造成不育系中混雜保持系，制種者利用不純的不育系種子與恢復(fù)系雜交生產(chǎn)雜交種時(shí)，必然導(dǎo)致混入的保持系給不育系授粉，使不育系上結(jié)出的種子仍然為不育系而非雜交種。這樣的種子在生產(chǎn)上種植,必將導(dǎo)致生產(chǎn)田中出現(xiàn)不育株而減產(chǎn)。
[0004]目前鑒定大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)的分子標(biāo)記方法是基于堿基缺失(indel)的PCR擴(kuò)增片段大小差異區(qū)分大豆RN型細(xì)胞質(zhì)不育系和保持系，而其擴(kuò)增的片段在不育系中和保持系中的大小差異只有12bp，必須通過高濃度的3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行區(qū)分，實(shí)際操作中可能不易分辨，而且單一的標(biāo)記，可能會(huì)影響大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)和正?？捎?xì)胞質(zhì)的鑒定的準(zhǔn)確性，繼而影響大豆CMS商業(yè)化育種工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種葉綠體DNA的SNP標(biāo)記鑒定大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)方法，利用葉綠體DNA的SNP標(biāo)記來區(qū)別雄性不育細(xì)胞質(zhì)和可育細(xì)胞質(zhì)，更可以區(qū)分不育系(含有不育細(xì)胞質(zhì))和保持系(含有可育細(xì)胞質(zhì))，將為拓寬大豆CMS種質(zhì)資源和應(yīng)用于區(qū)分大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系制種過程中混入的父本保持系提供一種快速，準(zhǔn)確和可靠的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)和手段。
[0006]本發(fā)明提供的一種葉綠體DNA的SNP標(biāo)記鑒定大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)方法，解決方案如下:I)提取含有雄性不育細(xì)胞質(zhì)的大豆不育系和其配套的含有可育細(xì)胞質(zhì)的保持系種子基因組DNA，選用兩者間的4對(duì)葉綠體DNA的SNPs為標(biāo)記，SNPs名稱代號(hào)分別為SNP1、SNP2、SNP3 和 SNP4。
[0007]其中SNPl對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為:
ACGGTAGTATTAGGAGCTAC [C/T]([不育細(xì)胞質(zhì) / 可育細(xì)胞質(zhì)])TTAGCTATTGCTCAACAAGA ； 其中SNP2對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為:
AGATAGATATCTATAGTTAT [A/C]([不育細(xì)胞質(zhì) / 可育細(xì)胞質(zhì)])AATTTTTGTTTGTTGTCCCC ； 其中SNP3對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為:
ACAATTAGATTAGACAATTA [T/G]([不育細(xì)胞質(zhì) / 可育細(xì)胞質(zhì)])AAAAAAATATTGAGACAATT ； 其中SNP4對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為:
TAAATTTCTATATTAGAATT [C/A]([不育細(xì)胞質(zhì) / 可育細(xì)胞質(zhì)])TATTTTTTTTAGAAAGCCTC。
[0008]在4對(duì)SNPs的側(cè)翼序列分別設(shè)計(jì)I對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下:
其中SNPl對(duì)應(yīng)的上游引物序列為:
5’ -TTGTGGCTCAGTCGCTAAATC-3’，
下游引物序列為 5’ -TGTTAAACCGCCCATAAGAAC-3’ ；
其中SNP2對(duì)應(yīng)的上游引物序列為:
5’ -TCTTTATCCTTGGGCAATGAGTT-3’，
下游引物序列為 5’ -ATATTTAGGTTCGGGCATTTGT-3’ ；
其中SNP3對(duì)應(yīng)的上游引物序列為:
5’ -AGTACGGTTCTAAGGAAAGGA-3’，
下游引物序列為 5’ -TTGTGCAGCCTAATCTAATGT-3’ ；
其中SNP4對(duì)應(yīng)的上游引物序列為:
5’ -GGGGATCCTTTATTAAATTAA-3’，
下游引物序列為 5’ - AATATGAAAATAAGAGCCTCC-3’。
[0009]2)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物在不育細(xì)胞質(zhì)和可育細(xì)胞質(zhì)中長(zhǎng)度是一致的，利用限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，不育系和保持系通過獲得不同長(zhǎng)度大小的條帶進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。4對(duì)葉綠體DNA的SNPs位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增的引物大小、相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶和酶切后的片段大小等特征如下所述:
其中SNPl對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為463bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶極^70 /酶切，可育細(xì)胞質(zhì)(保持系)的酶切片段長(zhǎng)度為463bp，不育細(xì)胞質(zhì)(不育系)的酶切片段為兩個(gè)，長(zhǎng)度分別為255bp和208bp ；
其中SNP2對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為489bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/zsi /酶切，可育細(xì)胞質(zhì)(保持系)的酶切片段長(zhǎng)度為489bp，不育細(xì)胞質(zhì)(不育系)的酶切片段為兩個(gè)，長(zhǎng)度分別為323bp和166bp ；
其中SNP3對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為490bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/zsi /酶切，可育細(xì)胞質(zhì)(保持系)的酶切片段長(zhǎng)度為490bp，不育細(xì)胞質(zhì)(不育系)的酶切片段為兩個(gè)，長(zhǎng)度分別為288bp和192bp ；
其中SNP 4對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為399bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/酶切，可育細(xì)胞質(zhì)(保持系)的酶切片段長(zhǎng)度為399bp，不育細(xì)胞質(zhì)(不育系)的酶切片段為兩個(gè)，長(zhǎng)度分別為247bp和152bp。
[0010]利用發(fā)明所述的方法也可應(yīng)用于區(qū)分大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系制種過程中不育系混入的父本保持系。
[0011]本發(fā)明提供的葉綠體DNA分子標(biāo)記鑒定大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)和正?？捎?xì)胞質(zhì)的方法包括以下步驟:
提取雄性不育細(xì)胞質(zhì)的大豆不育系和其配套的保持系種子的基因組DNA作為擴(kuò)增模板，選用兩者間的4對(duì)葉綠體DNA的SNPs標(biāo)記，在跨4對(duì)SNPs的側(cè)翼序列分別設(shè)計(jì)I對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物因?yàn)殚L(zhǎng)度相同，利用限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，不育系和保持系通過獲得不同長(zhǎng)度大小的條帶進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。
[0012]大豆材料的DNA提取過程如下:利用CTAB法提取大豆基因組DNA，此DNA作為擴(kuò)增模板。
[0013]PCR擴(kuò)增反應(yīng):利用跨4對(duì)SNPs的側(cè)翼序列分別設(shè)計(jì)I對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0014]酶切過程:擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶酶切，37°C孵育lh。
[0015]瓊脂糖凝膠電泳過程:酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后，成像記錄，觀察細(xì)胞質(zhì)不育材料(不育系)和細(xì)胞質(zhì)可育材料(保持系)的酶切片段大小。
[0016]本發(fā)明與傳統(tǒng)的鑒定細(xì)胞質(zhì)育性及區(qū)分不育系和保持系的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
由于細(xì)胞質(zhì)雄性不育是通過細(xì)胞質(zhì)遺傳的，而葉綠體DNA屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳，本發(fā)明中的葉綠體DNA的SNP標(biāo)記穩(wěn)定，一個(gè)或者多個(gè)SNP可以分別或者同時(shí)使用，增加可靠性，含有SNP的PCR產(chǎn)物在酶切后產(chǎn)生的片段不育系中和保持系中的大小差異至少在152bp以上，通過低濃度1%的瓊脂糖電泳就可以明顯區(qū)分出來。
[0017]大豆種子隨時(shí)可以提取DNA進(jìn)行檢測(cè)，避免了傳統(tǒng)方法需要進(jìn)行田間種植在開花期再檢測(cè)花粉育性所浪費(fèi)的時(shí)間。
[0018]檢測(cè)快速耗時(shí)少，從提取DNA到酶切電泳，I個(gè)工作日可以完成。
[0019]檢測(cè)準(zhǔn)確，因?yàn)槊盖袟l帶區(qū)分明顯，利用低濃度的瓊脂糖凝膠電泳即可在紫外燈或者藍(lán)光燈下觀察鑒別。
[0020]檢測(cè)所用的儀器和藥品為常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室具備。
[0021]檢測(cè)過程沒有復(fù)雜的操作技術(shù)，普通的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員即可完成。
[0022]本發(fā)明的積極效果在于:
利用葉綠體DNA的SNP標(biāo)記來區(qū)別雄性不育細(xì)胞質(zhì)和可育細(xì)胞質(zhì),更可以區(qū)分不育系和保持系，將為拓寬大豆CMS種質(zhì)資源和區(qū)分不育系中的保持系提供方便快捷的途徑。從不育系和保持系中發(fā)現(xiàn)存在的4對(duì)差異SNPs，在跨SNPs的區(qū)域側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物片段大小通過限制性內(nèi)切酶酶切可以將不育系和保持系區(qū)分出來，條帶清晰，重復(fù)性好，可靠性強(qiáng)，這種應(yīng)用基于SNPs和內(nèi)切酶結(jié)合的標(biāo)記可以鑒定出育種過程中繁育不育系(含有不育細(xì)胞質(zhì))時(shí)的混雜的父本保持系(含有可育細(xì)胞質(zhì))，為種子生產(chǎn)過程中純度要求提供保障。
[0023]本發(fā)明中的葉綠體DNA的SNP標(biāo)記穩(wěn)定，一個(gè)或者多個(gè)SNP可以分別或者同時(shí)使用，增加可靠性，含有SNP的PCR產(chǎn)物在酶切后產(chǎn)生的片段不育系中和保持系中的大小差異至少在152bp以上，通過低濃度1%的瓊脂糖電泳就可以明顯區(qū)分出來。【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為利用4對(duì)跨SNPs側(cè)翼序列的弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；
圖2為利用限制性內(nèi)切酶酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。
[0025]【具體實(shí)施方式】:
下面通過基于PCR結(jié)合限制性內(nèi)切酶酶切分析SNPs區(qū)域的分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步舉例說明實(shí)施例1
選用的4對(duì)葉綠體DNA的SNPs標(biāo)記，名稱代號(hào)分別為SNP1、SNP2、SNP3和SNP4。
[0026]其中SNPl對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為:
ACGGTAGTATTAGGAGCTAC [C/T]([不育細(xì)胞質(zhì) / 可育細(xì)胞質(zhì)])TTAGCTATTGCTCAACAAGA ； 其中SNP2對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為:
AGATAGATATCTATAGTTAT [A/C]([不育細(xì)胞質(zhì) / 可育細(xì)胞質(zhì)])AATTTTTGTTTGTTGTCCCC ； 其中SNP3對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為:
ACAATTAGATTAGACAATTA [T/G]([不育細(xì)胞質(zhì) / 可育細(xì)胞質(zhì)])AAAAAAATATTGAGACAATT ； 其中SNP4對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為:
TAAATTTCTATATTAGAATT [C/A]([不育細(xì)胞質(zhì) / 可育細(xì)胞質(zhì)])TATTTTTTTTAGAAAGCCTC。
[0027]鑒定材料為大豆細(xì)胞質(zhì)的雄性不育系(含有雄性不育細(xì)胞質(zhì))和其配套的保持系(含有雄性可育細(xì)胞質(zhì))(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆所提供并保存)，見表1。
[0028]表1:鑒定材料為RN型大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)的大豆不育系和其配套的保持系材料
【權(quán)利要求】
1.一種葉綠體DNA的SNP標(biāo)記鑒定大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)的方法，包括以下步驟: 提取含有雄性不育細(xì)胞質(zhì)的大豆不育系和含有可育細(xì)胞質(zhì)的保持系種子基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板；選用4對(duì)葉綠體DNA的SNPs標(biāo)記，SNPs名稱代號(hào)分別為SNP1、SNP2、SNP3和SNP4 ;在4對(duì)SNPs的側(cè)翼序列分別設(shè)計(jì)I對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的引物如下:其中SNPl對(duì)應(yīng)的上游引物序列為5’ -TTGTGGCTCAGTCGCTAAATC-3’， 下游引物序列為 5’ -TGTTAAACCGCCCATAAGAAC-3’ ； 其中SNP2對(duì)應(yīng)的上游引物序列為5’ -TCTTTATCCTTGGGCAATGAGTT-3’， 下游引物序列為 5’ -ATATTTAGGTTCGGGCATTTGT-3’ ； 其中SNP3對(duì)應(yīng)的上游引物序列為5’ -AGTACGGTTCTAAGGAAAGGA-3’， 下游引物序列為 5’ -TTGTGCAGCCTAATCTAATGT-3’ ； 其中SNP4對(duì)應(yīng)的上游引物序列為5’ -GGGGATCCTTTATTAAATTAA-3’， 下游引物序列為 5’ - AATATGAAAATAAGAGCCTCC-3’ ； 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切片段長(zhǎng)度鑒定是否為大豆雄性不育細(xì)胞質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的一種葉綠體DNA的SNPs標(biāo)記鑒定大豆雄性細(xì)胞質(zhì)的方法，其特征在于:4對(duì)葉綠體DNA的SNPs標(biāo)記 對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)、對(duì)應(yīng)的側(cè)翼序列的位置、PCR擴(kuò)增的引物大小、相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶和酶切后的片段大小等如下所述: 其中SNPl對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為ACGGTAGTATTAGGAGCTAC[C/T]([不育細(xì)胞質(zhì)可育細(xì)胞質(zhì)])TTAGCTATTGCTCAACAAGA ;利用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為463bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶極^70 /酶切，可育細(xì)胞質(zhì)(保持系)的酶切片段長(zhǎng)度為463bp，不育細(xì)胞質(zhì)(不育系)的酶切片段為兩個(gè)，長(zhǎng)度分別為255bp和208bp ； 其中SNP2對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為AGATAGATATCTATAGTTAT[A/C]([不育細(xì)胞質(zhì)/可育細(xì)胞質(zhì)])AATTTTTGTTTGTTGTCCCC ;利用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為489bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/zsi /酶切，可育細(xì)胞質(zhì)(保持系)的酶切片段長(zhǎng)度為489bp，不育細(xì)胞質(zhì)(不育系)的酶切片段為兩個(gè)，長(zhǎng)度分別為323bp和166bp ； 其中SNP3對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為ACAATTAGATTAGACAATTA[T/G]([不育細(xì)胞質(zhì)/可育細(xì)胞質(zhì)])AAAAAAATATTGAGACAATT ;利用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為490bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/zsi /酶切，可育細(xì)胞質(zhì)(保持系)的酶切片段長(zhǎng)度為490bp，不育細(xì)胞質(zhì)(不育系)的酶切片段為兩個(gè)，長(zhǎng)度分別為288bp和192bp ； 其中SNP4對(duì)應(yīng)的部分側(cè)翼序列為TAAATTTCTATATTAGAATT[C/A]([不育細(xì)胞質(zhì)/可育細(xì)胞質(zhì)])TATTTTTTTTAGAAAGCCTC ;利用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為399bp，PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶/酶切，可育細(xì)胞質(zhì)(保持系)的酶切片段長(zhǎng)度為399bp，不育細(xì)胞質(zhì)(不育系)的酶切片段為兩個(gè)，長(zhǎng)度分別為247bp和152bp。
3.利用權(quán)利要求1所述的方法應(yīng)用于區(qū)分大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(含有不育細(xì)胞質(zhì))制種過程中不育系混入的父本保持系(含有可育細(xì)胞質(zhì))。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104004853SQ201410270938
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】林春晶, 張春寶, 董英山, 趙麗梅, 彭寶, 趙洪錕 申請(qǐng)人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院