專利名稱：：豬圓環(huán)病毒1型感染性克隆及其所拯救的病毒和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種病毒的感染性克隆，尤其涉及豬圓環(huán)病毒1型感染性克隆以及由該感染性克隆拯救得到的重組豬圓環(huán)病毒1型病毒，本發(fā)明還涉及該感染性克隆的構(gòu)建方法以及其用該感染性克隆拯救的病毒在診斷技術(shù)中的應(yīng)用，屬于病毒分子生物學(xué)及獸醫(yī)免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：根據(jù)豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus,PCV)的致病性、抗原性及核苷酸序列，可以將其分為兩個(gè)基因型，即PCV1和PCV2。PCVl由德國(guó)學(xué)者Tischer等(1974)首次從污染的豬腎傳代細(xì)胞系(PK-15)分離獲得，通過(guò)人工感染豬試驗(yàn)證實(shí)，該病毒沒(méi)有引起顯著臨床癥狀和病理變(TischerI,GelderblomH,VetteermannW,etal.Averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNA[J].Nature,1982，295:64-66;TischerI,MieldsW,WolffD,etal.Studiesonepidemiologyandpathogenicityofporcinecircovirus[J].ArchVirol,1986，91:271-276.)。PCV2從斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)患豬分離獲得，證實(shí)對(duì)豬具有致病性(AllanG,MeehanB,ToddD,etal.Novelporcinecircovirusesfrompigswithwastingdiseasesyndromes[J].VetRecord,1998,142:467-468.)。豬圓環(huán)病毒是一種圓形小顆粒病毒，直徑17nm，呈二十面體對(duì)稱，無(wú)囊膜，基因組由單股負(fù)鏈閉合環(huán)狀DNA組成，PCVl含有1759bp，PCV2含有1767或1768bp。病毒基因組包括兩個(gè)大的開放閱讀框架(0RFs)，0RF1基因編碼病毒復(fù)制酶相關(guān)蛋白(R印)，0RF2基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白(Cap)(CheungAK.Transcriptionalanalysisofporcinecircovirustype2[J].Virology,2003,305:168-180.)。PCV1和PCV2全基因組序列的同源性為67%，在0RF1區(qū)段同源性為86X，而0RF2區(qū)段同源性僅為51%(MeehanBM,CreelanJL，McNultyMS,etal.SequenceofporcinecircovirusDNA:affinitieswithplantcircoviruses[J].JGeneralVirol,1997,78:221-227.)。兩種病毒在0RF1所編碼的蛋白抗原存在交叉，而0RF2所編碼的蛋白抗原不存在交叉(Mah6D,BlanchardP,TruongC，etal.DifferentialrecognitionofORF2proteinfromtype1andtype2porcinecircovirusesandidentificationofimmunorelevantepitopes[J].JGeneralVirol,2000,81:1815-1824.)。因此，PCVl與PCV2之間存在有一定親緣關(guān)系，但也發(fā)生了較大的遺傳變異。由于PCV2感染豬會(huì)導(dǎo)致P麗S或其它癥候群成為研究熱點(diǎn)，而PCV1的研究報(bào)道較少。為深入了解PCV1與PCV2遺傳變異，探討PCV1與其它病原混合感染的致病性，調(diào)查我國(guó)獸用疫苗中PCV1污染情況，需要開展該病毒的研究。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用不同方式構(gòu)建了PCV2的感染性克隆，但拯救的毒株均無(wú)分子耙標(biāo)設(shè)計(jì)，其獲得的毒株也無(wú)法與親本病毒相鑒別(FenauxM，OpriessingT,HalburPG，etal.Achimericporcinecircovirus(PCV)withtheimmunogenicPCVtype2(PCV2)clonedintothegenomicbackboneofthenonpathogenicPCVlinducesprotectiveimmunityagainstPCV2infectioninpigs[J].JVirol,2004,78:6297-6303.)。PCV1來(lái)源于PK-15細(xì)胞污染物，由于該病毒不能夠引起細(xì)胞病變，分離或克隆該病毒十分困難，給研究工作帶來(lái)一定影響。迄今為止，對(duì)PCVl研究報(bào)道相對(duì)較少，原因可能與該病毒對(duì)豬無(wú)致病性有關(guān)，沒(méi)有能夠引起研究者關(guān)注。然而，PCVl作為PK-15細(xì)胞源污染病毒存在，對(duì)該病毒的起源與演化，分子遺傳變異機(jī)制等問(wèn)題所知甚少；PCVl在疫苗生物制品中污染情況，以及在臨床病例中由多種病原混合感染的條件下的致病性如何尚不清楚。通過(guò)構(gòu)建PCV1感染性克隆技術(shù)，獲得帶有分子靶標(biāo)的克隆毒株，為深入開展該病毒基礎(chǔ)研究將具有重要推動(dòng)作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種PCVl感染性克?。槐景l(fā)明的目的之二是提供一種構(gòu)建上述PCVl感染性克隆的方法；本發(fā)明的目的之三是提供一種由上述PCVl感染性克隆拯救得到PCVl重組毒株；本發(fā)明的目的之四是提供一種用所拯救的重組病毒株用于制備檢測(cè)豬圓環(huán)病毒血清抗體的試劑。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種PCV1感染性克隆，該感染性克隆的一個(gè)載體上順式連接兩個(gè)PCV1病毒基因組，構(gòu)成順式基因功能區(qū)；該序列中含有SWI酶切位點(diǎn)。一種構(gòu)建上述PCV1感染性克隆的方法，包括(1)提取PCVl病毒基因組；以所提取的PCV1病毒基因組為模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)SdI酶切處理及凝膠電泳純化，插入到相同處理的質(zhì)粒載體pUC19SaiI酶切位點(diǎn)，得到含PCV1全長(zhǎng)基因組質(zhì)粒；(3)將含PCVl全長(zhǎng)基因組質(zhì)粒先行ScaI完全酶切，再進(jìn)行Sa』I部分酶切，純化含病毒全長(zhǎng)基因組與載體長(zhǎng)臂和短臂的兩條泳帶，用T4連接酶連接，即得。本研究沿用了構(gòu)建PCV2感染性克隆的技術(shù)路線，首先將PCV1單基因組線性化克隆，再進(jìn)行雙基因組順式連接，在重組質(zhì)粒上形成一個(gè)完整的病毒基因組調(diào)控單元，經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得感染性病毒。在構(gòu)建病毒感染性克隆時(shí)，引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。設(shè)計(jì)原則一般應(yīng)避開病毒基因轉(zhuǎn)錄區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)和蛋白翻譯起始密碼子等重要調(diào)控元件，盡量不改變基因編碼閱讀框架和氨基酸編碼序列，從而保證了克隆病毒復(fù)制酶的功能和對(duì)細(xì)胞的感染性。本發(fā)明在PCV1基因組0RF1編碼區(qū)末端區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件程序分析，在引物序列中替換兩個(gè)堿基，形成一個(gè)SaiI酶切位點(diǎn)，目的是利用PCR-RFLP法將克隆毒株與親本野生型病毒相鑒別，證明所獲得的克隆病毒的真實(shí)性和可靠性。用本發(fā)明所構(gòu)建的感染性克隆成功地拯救出重組病毒，該重組病毒命名為PCV1/G株，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNO.2658;分類命名是豬圓環(huán)病毒l型(Porc化ecir，i潔加ei);保藏時(shí)間是2008年8月29日;保藏單位是中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。用本發(fā)明PCV1/G株同步接種PK-15細(xì)胞后連續(xù)帶毒傳代試驗(yàn)證明，該毒株能夠感染細(xì)胞，但不產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變(CPE);病毒增殖性能穩(wěn)定，分子耙標(biāo)能夠穩(wěn)定遺傳；第10代病毒培養(yǎng)物病毒測(cè)定為10"TCID5。/mL，基本與親本病毒相似。通過(guò)免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)在病毒感染細(xì)胞中檢出病毒抗原，其抗原性僅與PCV1/Cap蛋白單價(jià)特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，而與抗PCV2/Cap蛋白抗體無(wú)交叉本發(fā)明克隆毒株帶有SWI酶切位點(diǎn)；而野生型親本病毒不含Sa]I位點(diǎn)。用PCR結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)可以將本發(fā)明克隆的PCV1/G株與親本病毒相鑒別從病毒形態(tài)學(xué)、抗原性、細(xì)胞感染性等方面進(jìn)行分析表明，本發(fā)明所構(gòu)建的PCV1克隆毒株與其親本病毒相似，通過(guò)細(xì)胞連續(xù)傳代，分子靶標(biāo)能夠穩(wěn)定遺傳，且病毒適應(yīng)性增強(qiáng)，病毒繁殖能力穩(wěn)定，為今后探討該病毒的致病性、遺傳變異規(guī)律、分子診斷等方面奠定了重要的基礎(chǔ)。采用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)方法，本發(fā)明拯救的重組PCV1/G株可應(yīng)用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)血清抗體。本發(fā)明對(duì)IPMA抗原反應(yīng)板的制備、被檢血清稀釋倍數(shù)、酶標(biāo)抗體及底物顯色液等進(jìn)行了系統(tǒng)試驗(yàn)。用IPMA法對(duì)已知PCV1和PCV2參考陽(yáng)性血清進(jìn)行試驗(yàn)表明，血清稀釋倍數(shù)21:100可消除兩種病毒間存在的低水平交叉反應(yīng)。該方法與用昆蟲桿狀病毒表達(dá)的PCVl-Cap重組蛋白抗原建立的間接ELISA檢測(cè)符合率為88.9。/。,與其它幾種豬病毒參考陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)來(lái)自黑龍江、吉林、河北、上海、遼寧等地豬場(chǎng)送檢的257份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，PCV1和PCV2血清抗體陽(yáng)性檢出率分別為19.1%、80.5%。PCV1抗體陽(yáng)性豬中有95.9。/。為PCV2陽(yáng)性，表明我國(guó)豬群已存在PCV1感染，在臨床上PCV1與PCV2多以混合感染形式存在。本發(fā)明建立的PCV1-IPMA方法具有操作簡(jiǎn)便、特異和敏感等特點(diǎn)，可為PCV1流行病學(xué)調(diào)查及血清抗體檢測(cè)提供了一種技術(shù)手段。圖1重組質(zhì)粒SamHI與ffi;idIII酶切反應(yīng)鑒定1:單基因組加載體；2:雙基因組加載體；3:空載體；M:DNAmarkers。圖2PCV1/G株病毒抗原檢測(cè)與血清學(xué)交叉反應(yīng)；A:PCV1/G株加anti-PCVl/Cap血清；B:PCV2加anti-PCVl/Cap血清；C:陰性對(duì)照；D:PCV1/G株加anti-PCV2/Cap血清；E:PCV2加anti-PCV2/Cap血清；F:陰性對(duì)照。圖3PCR-RFLP法鑒別PCV1/G克隆毒株與PCV1親本病毒；1:克隆病毒的PCR產(chǎn)物的SaJI酶切結(jié)果；2:親本病毒的PCR產(chǎn)物的SdI酶切結(jié)果。圖4PCV1/G株免疫電鏡形態(tài)學(xué)觀察。圖5PCV1和PCV2毒種的PCR鑒定結(jié)果。圖6用IPMA方法檢測(cè)豬血清中PCV1抗體試驗(yàn)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1感染性克隆的構(gòu)建、重組病毒的拯救、傳代與測(cè)定1材料和方法1.1病毒、細(xì)胞、抗體、菌株及載體從污染的豬腎傳代細(xì)胞系(PK-15)獲得PCV1病毒基因組；基因克隆所用的大腸桿菌菌株(Top10)、載體(pUC19)及限制性內(nèi)切酶類為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和RPMI1640培養(yǎng)液為Gibco產(chǎn)品；PCV1-free豬腎傳代細(xì)胞系(PK-15)由國(guó)外引進(jìn)。兔抗PCV1/Cap和PCV2/Cap重組蛋白單因子血清自制。1.2引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank提供的PCV1序列NC001792設(shè)計(jì)引物PCV1-F907:5'-GTCGACGGAAGTACCCGAAGGCCGATTTGA-3，(SEQIDNO.1)，對(duì)應(yīng)序列為907936;PCV1-R912:5，-GTCGACTGTTCTCCAGCAGTCTTCCA-3，(SEQIDNO.2)，對(duì)應(yīng)序列為887912。下劃線斜體字母表示替換的堿基，構(gòu)成SaJI酶切位點(diǎn)。病毒DNA按文獻(xiàn)(LiuC，WeiY，ZhangC,etal.Constructionandcharacterizationofporcinecircovirustype2carryingageneticmarkerstrain[J].VirusResearch,2007,127:95-99.)方法提取，TaKaRaExTaqPCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，條件為預(yù)變性94。C2min，35個(gè)循環(huán)[94。C30s，60°C30s，72°C1.5min]，延伸反應(yīng)72。C7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1.3病毒基因組克隆與測(cè)序PCR產(chǎn)物經(jīng)SaI酶切處理及凝膠電泳純化，插入到相同處理的質(zhì)粒載體pUC19Sa』I酶切位點(diǎn)，操作程序按文獻(xiàn)(LiuC,WeiY,ZhangC,etal.Constructionandcharacterizationofporcinecircovirustype2carryingageneticmarkerstrain[J].VirusResearch,2007，127:95-99.)。采用373A型DNA序列儀測(cè)序(Perkin-Elmer試劑盒)，DNAsis軟件進(jìn)行序列分析。1.4感染性分子克隆構(gòu)建及鑒定含PCV1全長(zhǎng)基因組質(zhì)粒先行SeaI完全酶切(pU19載體上單酶切位點(diǎn))，再進(jìn)行SWI部分酶切(插入基因組兩側(cè)酶切位點(diǎn))。凝膠純化含病毒全長(zhǎng)基因組與載體長(zhǎng)臂和短臂的兩條泳帶，用T4連接酶連接獲得一個(gè)載體上順式連接的兩個(gè)病毒基因組，構(gòu)成順式基因功能區(qū)，獲得PCV1感染性克隆。用插入位點(diǎn)兩側(cè)的Ba/HHI與//kefIII進(jìn)行酶切反應(yīng)鑒定。1.5重組質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染用6孔培養(yǎng)板接種1.5X105個(gè)細(xì)胞/孔，置37°C5%0)2培養(yǎng)在24h達(dá)到6080%單層時(shí)用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。用無(wú)血清0ptiMEM培養(yǎng)液(GibcoBRL)洗滌細(xì)胞1次，將1.2l^g純化的感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置37°C5%0)2條件下培養(yǎng)至72h，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物上清。1.6病毒拯救與傳代按5%接種量將收獲的上清液同步加入到新消化的細(xì)胞懸液中，混合后置37°C5%0)2條件下靜置培養(yǎng)24h形成單層，按文獻(xiàn)(TischerI,PetersD,RaschR，etal.Replicationofporcinecircovirus:inductionbyglucosamineandcellcycledependence[J].ArchVirol，1987,96:39-57.)方法進(jìn)行D-氨基葡萄糖處理。培養(yǎng)72h后收取病毒培養(yǎng)物，經(jīng)3次凍融后同步接種細(xì)胞進(jìn)行傳代。1.7病毒抗原性及含量測(cè)定用兔抗PCV1/Cap單因子血清進(jìn)行免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)(LiuC,IharaT，NunoyaT，etal.DevelopmentofanELISAbasedonthebaculovirus-expressedcapsidproteinofporcinecircovirustype2asantigen[J].JVetMedSci，2004，66:237-242.)測(cè)定病毒的抗原反應(yīng)活性。將病毒液作10倍系列稀釋測(cè)定病毒含量，取各稀釋度分別接種96孔板，每個(gè)稀釋度設(shè)4L(100"L/孔)，同步加入新消化的PK-15細(xì)胞(100uL/孔)，置37。C5%(:02培養(yǎng)72h，甩掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS(pH7.4)浸洗一次，固定細(xì)胞后進(jìn)行IPMA測(cè)定。用IPMA法對(duì)幾種豬病毒參考血清進(jìn)行抗原交叉反應(yīng)試驗(yàn)。1.8病毒形態(tài)學(xué)觀察取病毒感染后72h細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3次，預(yù)留0.5mLPBS凍融3次，12000r/min離心20min取上清，加入終濃度為1%的PCV1陽(yáng)性血清混合，4。C感作過(guò)夜，12000r/min離心20min，沉淀用0.lmLPBS溶解，2%磷鎢酸液(pH6.8)負(fù)染制樣，進(jìn)行免疫電鏡觀察。1.9克隆毒株與親本病毒鑒別根據(jù)GenBank提供的PCV1序列NC001792設(shè)計(jì)引物。PCV1-F42:5，-TGMMTGCCAAGCAAGMAAGCGG-3，(SEQIDNO.3)對(duì)應(yīng)序列為4771;PCV1-R1102:5，-ACAGCCCAMATTATGTGGTAAGGC-3，(SEQIDN0.4)對(duì)應(yīng)序列為10771102。擴(kuò)增目的基因片斷長(zhǎng)為1061bp，PCR反應(yīng)條件同1.2項(xiàng)，獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sa]I酶切鑒別克隆毒株與親本病毒。2試驗(yàn)結(jié)果2.1基因克隆與序列分析PCV1基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約1.7kb，經(jīng)SdI酶切消化，克隆到pUC19載體(2686bp)。取3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果一致，未發(fā)現(xiàn)堿基錯(cuò)配和缺失。PCV1基因組全長(zhǎng)1759bp，含0RF1和0RF2編碼區(qū)，測(cè)序結(jié)果與GenBank登錄的PCV1序列AF071879，NC001792和Y09921進(jìn)行比較，核苷酸序列同源性大于99.9%。2.2感染性克隆的構(gòu)建對(duì)含PCV1單基因組重組質(zhì)粒進(jìn)行SeaI完全酶切消化，然后用SaiI進(jìn)行部分酶切消化，凝膠電泳回收含單基因組的長(zhǎng)臂(基因組1759bp+部分載體1747bp)和另一含單基因組短臂(基因組1759bp+部分載體939bp),將兩者連接后獲得含雙基因組順式排列的重組質(zhì)粒(雙基因組3518bp+載體2686bp)，獲得的重組質(zhì)粒命名為pUC/PCVl。2.3重組質(zhì)粒酶切鑒定對(duì)純化的含PCV1雙基因組重組質(zhì)粒進(jìn)行Sa/nHI和//i;^III酶切鑒定。如圖1所示，泳道1為含單基因組重組質(zhì)粒酶切反應(yīng)，獲得單基因組與載體兩條帶，分別為1759bp和2686bp;泳道2為含雙基因組重組質(zhì)粒酶切反應(yīng)，獲得雙基因組與載體兩條帶，分別為3518bp和2686bp;泳道3為空質(zhì)粒對(duì)照。2.4克隆病毒檢測(cè)與血清學(xué)交叉反應(yīng)用兔抗PCVl/Cap抗體進(jìn)行IPMA法檢測(cè)拯救病毒，如圖2所示，克隆的病毒感染細(xì)胞呈棕紅色(圖2A)，對(duì)照細(xì)胞無(wú)著色(圖2C);病毒感染的陽(yáng)性細(xì)胞呈點(diǎn)式分布，抗原主要聚中在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)。結(jié)果表明，用構(gòu)建的感染性克隆成功地拯救出重組病毒，命名為PCV1/G株。用兔抗PCV2/Cap單因子血清與PCV1/G株進(jìn)行抗原交叉試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種病毒無(wú)血清學(xué)交叉反應(yīng)(圖2B、2E);同時(shí)與其它幾種豬病毒參考血清(PRRSV、PPV、PRV、CSFV)也無(wú)交叉反應(yīng)。2.5克隆毒株與親本病毒鑒別從PCV1/G株第10代培養(yǎng)物提取DNA為模板，連同與親本病毒基因組一起，用PCV1-F42和PCV1-R1102引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物預(yù)測(cè)為1061bp。由于克隆毒株帶有SWI酶切位點(diǎn)，用SdI酶切其PCR產(chǎn)物，獲得195bp和866bp兩個(gè)片段；而野生型親本病毒不含Sa〗I位點(diǎn)，酶切后片段不變。用PCR結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)將克隆的PCV1/G株與親本病毒相鑒別(圖3)。2.6克隆毒株形態(tài)學(xué)觀察免疫電鏡形態(tài)學(xué)觀察顯示，克隆病毒粒子與特異性抗體結(jié)合后，形成了巨大的免疫復(fù)合物(圖4)，其中單個(gè)病毒呈圓形顆粒，直徑約17nm，與文獻(xiàn)(TischerI,GelderblomH,VetteermannW，etal.Averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandedDNA[J].Nature,1982,295:64-66.)報(bào)道的PCVl形態(tài)一致，未發(fā)現(xiàn)有其它外源病毒污染。2.7克隆病毒細(xì)胞感染特性用PCV1/G株同步接種PK-15細(xì)胞后連續(xù)帶毒傳代試驗(yàn)證明，該毒株能夠感染細(xì)胞，但不產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變(CPE);病毒增殖性能穩(wěn)定，分子靶標(biāo)能夠穩(wěn)定遺傳；第IO代病毒培養(yǎng)物病毒測(cè)定為1048TCID5。/mL，基本與親本病毒相似。試驗(yàn)例11材料和方法1.1病毒、抗體、細(xì)胞PCV1/G株為本發(fā)明實(shí)施例1所構(gòu)建。PCV1和PCV2陽(yáng)性血清及陰性血清由本方面人實(shí)驗(yàn)室提供；幾種豬病毒參考陽(yáng)性血清由申請(qǐng)人相關(guān)課題組提供。PK-15細(xì)胞系由國(guó)外引進(jìn)，經(jīng)PCR檢測(cè)無(wú)PCV1污染，用于病毒增殖，細(xì)胞培養(yǎng)液為RPMI1640，添加10%犢牛血清(FCS)和青霉素、鏈霉素；辣根過(guò)氧化物酶-葡萄球菌A蛋白標(biāo)記物(服P-SPA)為Zymed產(chǎn)品；3_氨基-9-乙基咪唑(AEC)為Sigma產(chǎn)品；其它化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.2PCR鑒別試驗(yàn)根據(jù)GenBank發(fā)表的PCV1序列(NC001792)和PCV2序列(AF201311)設(shè)計(jì)引物。PCV1-F:5，-TTGCTGAGCCTAGCGACACC-3，；PCV1-R:5，-TCCACCTGCTTTCAMTCGGCC-3，用于擴(kuò)增PCV1片段為349bp。PCV2-F:5，-TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT-3,和PCV2-R:5，-CCGCACCTTCGGATATACTG-3，用于擴(kuò)增PCV2片段為263bp。按常規(guī)方法提取病毒DNA，TaKaRaExTaqPCR試劑盒進(jìn)行基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C2min，35個(gè)循環(huán)[94。C30s，60°C30s，72°C1.5min]，延伸反應(yīng)72°C7min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，用于PCV1和PCV2種毒的鑒別。1.3病毒增殖與毒價(jià)測(cè)定用PCV1/G株第18代作為毒種，按10%同步接種于新消化的PK-15細(xì)胞懸液(2X10VmL)，病毒維持液為含2%FCSRPMI1640,病毒培養(yǎng)物于37'C培養(yǎng)120h，經(jīng)三凍融后收獲，經(jīng)3000r/min離心10min，取上清小量分裝于-8(TC保存，用IPMA方法測(cè)定毒價(jià)，達(dá)到lX105TCID5。/mL以上用于制備IPMA反應(yīng)板。1.4IPMA反應(yīng)板的制備按5%、10%和15X種毒劑量同步接種PK-15細(xì)胞懸液，以100叱/孔分注于96孔板中，同時(shí)設(shè)未接種病毒細(xì)胞對(duì)照。置37'C5%0)2條件下培養(yǎng)形成單層，用丙酮-PBS固定，干燥后置-2(TC保存?zhèn)溆谩?.5IPMA操作程序取IP區(qū)反應(yīng)板置室溫預(yù)熱，用PBS浸洗一次，用PBS將待檢血清按1:25起進(jìn)行2倍系列稀釋，同時(shí)作陽(yáng)性血清、陰性血清和未接毒細(xì)胞對(duì)照，加樣量為100叱/孔。置37。C濕盒孵育lh。PBS洗3次，加入l:3000稀釋的HRP-SPA(100叱/孔)，置37。C濕盒孵育lh，PBS洗3次，加入AEC底物液顯色30min，用光學(xué)顯微鏡觀察判定結(jié)果。1.6PCV1與PCV2血清學(xué)交叉反應(yīng)測(cè)定將已知PCV1和PCV2陽(yáng)性參考血清分別做l:251:12800系列稀釋，分別進(jìn)行兩種病毒的IPMA交叉反應(yīng)試驗(yàn)，同設(shè)未接毒細(xì)胞對(duì)照。1.7PCV1-IPMA特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)用己知豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)參考血清進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)。將PCV1陽(yáng)性血清進(jìn)行1:1001:12800系列稀釋，進(jìn)行IPMA敏感性試驗(yàn)。制備三批IPMA反應(yīng)板，選用陽(yáng)性和陰性血清各5份，用相同批次和不同批次三個(gè)IPMA反應(yīng)板進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。1.8PCV1-IPMA與ELISA符合試驗(yàn)用IPMA與昆蟲桿狀病毒表達(dá)的PCV1-Cap重組蛋白作抗原建立的間接ELISA方法，進(jìn)行符合試驗(yàn)。1.9臨床血清樣品的檢測(cè)對(duì)來(lái)自黑龍江、吉林、河北、上海、遼寧等地豬場(chǎng)送檢的257份血清樣品進(jìn)行PCV1-IPMA和PCV2-IPMA檢測(cè)。2試驗(yàn)結(jié)果2.1PCV1和PCV2毒種鑒定對(duì)試驗(yàn)使用的PCV1和PCV2毒種及PK-15細(xì)胞系進(jìn)行了PCR交叉反應(yīng)鑒定。如圖5所示，泳道13為PCV1特異性引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)；泳道46為PCV2特異性引物進(jìn)行的PCR。第2、5泳道為PCV1提取的核酸，PCV1-PCR擴(kuò)增出349bp片段(2泳道)；第3、4泳道為PCV2提取的核酸，PCV2-PCR擴(kuò)增出263bp片段(4泳道)；第1、6泳道為PK-15細(xì)胞系對(duì)照。PCR鑒定結(jié)果證明，用感染性分子克隆分別構(gòu)建的PCV1/G株與PCV2株制備的種毒純凈，無(wú)交叉污染；所用的PK-15細(xì)胞系也無(wú)這兩種病毒污染。因此，上述2個(gè)毒株和細(xì)胞系可用于IPMA反應(yīng)板的制備。2.2PCV1-IPMA反應(yīng)條件的測(cè)定用PCV1/G株培養(yǎng)物病毒含量為1.3X105TCID5。/mL制備IPMA反應(yīng)板。按10%接種量同步接種PK-15細(xì)胞，培養(yǎng)至72h固定；被檢血清樣品以1:25起進(jìn)行2倍系列稀釋；HRP-SPA的工作濃度為1:3000稀釋；AEC底物液顯色30min。PCV1陽(yáng)性血清與病毒感染細(xì)胞染色呈棕紅色(圖6A)，與對(duì)照健康細(xì)胞染色無(wú)著色(圖6B)，作為IPMA陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)；PCV1陰性血清與病毒感染細(xì)胞和健康細(xì)胞對(duì)照孔染色均無(wú)著色反應(yīng)判為陰性。2.3PCV1與和PCV2血清抗體交叉反應(yīng)測(cè)定以己知PCV1和PCV2標(biāo)準(zhǔn)毒株制備IPMA反應(yīng)板，分別與系列稀釋的PCV1和PCV2參考陽(yáng)性和陰性血清進(jìn)行交叉反應(yīng)，結(jié)果見表1。IPMA檢測(cè)結(jié)果表明，在血清稀釋倍數(shù)為1:25和1:50，兩種病毒存在低水平的血清抗體交叉反應(yīng);但血清稀釋度大于l:100以上，完全消除了這種低水平的抗體交叉。因此，用PCV1和PCV2建立的IPMA方法均可用于檢測(cè)各自病毒產(chǎn)生的特異性抗體。表1用IPMA法檢測(cè)PCV1與PCV2血清抗體交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果IPMA檢測(cè)255010020040080016003200640012800PCV1陽(yáng)性血清+++++++++—PCV1抗原PCV2陽(yáng)性血清+陰性血清PCV1陽(yáng)性血清+±PCV2抗原PCV2陽(yáng)性血清++++++++++陰性血清2.4PCV1-IPMA特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)幾種豬病毒參考血清(PPV、PRV、TGEV、PEDV、CSFV和PRRSV)進(jìn)行的IPMA交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，除PCV1陽(yáng)性血清呈陽(yáng)性反應(yīng)外，其他幾種豬病毒參考血清均呈陰性反應(yīng)，證明對(duì)這幾種病毒無(wú)血清學(xué)交叉反應(yīng)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)PCV1陽(yáng)性血清稀釋至1:6400，還能檢測(cè)到陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果，證明該方法敏感性較高。用同批次和不同批次進(jìn)行的PCV1-IPMA試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法獲得的結(jié)果重復(fù)性良好。2.5IPMA與ELISA符合試驗(yàn)用PCVl-IPMA與用昆蟲桿狀病毒表達(dá)的PCVl-Cap重組蛋白抗原包被ELISA方法，對(duì)54份臨床血清樣品進(jìn)行了平行檢測(cè)試驗(yàn)。結(jié)果表明，PCV1-Cap/ELISA13檢測(cè)樣品中有35份陽(yáng)性和19份陰性，而IPMA法檢測(cè)有40份陽(yáng)性和14份陰性。這兩種方法總符合率為88.9%，其中陽(yáng)性符合率為97.1%，陰性符合率為73.7%。2.6對(duì)臨床樣品檢測(cè)結(jié)果用PCV1-IPMA和PCV2-IPMA對(duì)來(lái)自黑龍江、吉林、河北、上海、遼寧等地9個(gè)豬場(chǎng)送檢的257份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)(表2)。結(jié)果表明，PCV1-IPMA血清抗體陽(yáng)性檢測(cè)率為19.1%，其中已知備母豬血清樣品陽(yáng)性檢出率為35.9%(28/78),仔豬血清樣品陽(yáng)性檢出率為9.8%(10/102)。PCV2-IPMA抗體陽(yáng)性檢測(cè)率為80.5%，顯著高于前者，其中PCVl抗體陽(yáng)性豬中有95.9y。(47/49)為PCV2抗體陽(yáng)性。試驗(yàn)結(jié)果表明，我國(guó)豬群已存在PCV1感染，且PCV1和PCV2在臨床上多以混合感染形式存在。表2用IPMA法對(duì)現(xiàn)地臨床送檢血潔中:PCV1和K:V2抗體檢測(cè)結(jié)果豬場(chǎng)別血清樣本PCV1-IPMAPCV2-IPMA陽(yáng)性數(shù)陰性數(shù)檢出率(％)陽(yáng)性數(shù)陰性數(shù)檢出率(％)TN3092130.029196.7DZ2962320.722775.9SFH2361726.119482.6TY20101050.019195.0JMS101910.06460.0AC3260.03260.0見3843416.3191950.0WJ4363714.035881.4HB594556.855493.2總計(jì)2574920819.12075080.5序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>豬圓環(huán)病毒l型感染性克隆及其所拯救的病毒和應(yīng)用<130>KLPI0788<160>4<170〉Patentlnversion3.1<210〉<211〉<212><213〉30Porcinecircovirus<咖>1gtcgacggaagtacccgaaggccgatttga<210〉2〈211〉26<212>DNA<213〉Porcinecircovirus<400>2gtcgactgttctccagcagtcttcca<210〉3<211>25<212>腿<213〉Porcinecircovirus3026<400>3tgaaaatgccaagcaagaaaagcgg<210>4<211>25<212>DNA<213>Porcinecircovirus25<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1、一種豬圓環(huán)病毒1型的(Porcinecircovirus1)感染性克隆，其特征在于該感染性克隆的一個(gè)載體上順式連接兩個(gè)PCV1病毒基因組，構(gòu)成順式基因功能區(qū)。2、按照權(quán)利要求l所述的感染性克隆，其特征在于PCV1感染性克隆中含有Sa〗I酶切位點(diǎn)。3、按照權(quán)利要求l所述的感染性克隆，其特征在于所述載體是pUC19質(zhì)粒載體。4、一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述感染性克隆的方法，包括(1)提取PCVl病毒基因組；以所提取的PCV1病毒基因組為模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)SdI酶切處理及純化，插入到相同處理的質(zhì)粒載體pUC19Sa_ZI酶切位點(diǎn)，得到含PCV1全長(zhǎng)基因組的質(zhì)粒；(3)將含PCVl全長(zhǎng)基因組的質(zhì)粒先行ScaI完全酶切，再進(jìn)行Sa〗I部分酶切，純化含病毒全長(zhǎng)基因組的產(chǎn)物以及載體長(zhǎng)臂和短臂的產(chǎn)物，用l連接酶連接獲得。5、由權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述感染性克隆拯救獲得的重組豬圓環(huán)病毒1型毒株。6、按照權(quán)利要求5所述的重組豬圓環(huán)病毒1型毒株，其特征在于所述重組豬圓環(huán)病毒1型毒株的基因組帶有-一個(gè)SaH內(nèi)切酶位點(diǎn)。7、按照權(quán)利要求6所述的重組豬圓環(huán)病毒1型毒株，其特征在于其微生物保藏號(hào)是CGMCCNO.2658。8、權(quán)利要求5所述的重組豬圓環(huán)病毒1型毒株在制備檢測(cè)豬圓環(huán)病毒抗體的試劑或藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開豬圓環(huán)病毒1型感染性克隆及其所拯救的病毒和應(yīng)用。本發(fā)明將豬圓環(huán)病毒1型2個(gè)基因組順式連接插入到載體中構(gòu)建得到感染性分子克隆。該感染性分子克隆中插入SalI酶切位點(diǎn)作為分子靶標(biāo)，所拯救出的重組病毒(PCV1/G株)帶有分子標(biāo)記，其保藏號(hào)是CGMCCNO.2658。本發(fā)明重組病毒的抗原性僅與PCV1/Cap蛋白單價(jià)特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，而與抗PCV2/Cap蛋白抗體無(wú)交叉?？捎肞CR結(jié)合RFLP將其與親本病毒相鑒別。本發(fā)明毒株體外培養(yǎng)增殖性能穩(wěn)定，病毒滴度高，所拯救的毒株可用于檢測(cè)該病毒抗體。本發(fā)明為今后開展豬圓環(huán)病毒的起源與演化、遺傳變異規(guī)律、分子鑒別診斷等研究奠定了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12N7/01GK101423836SQ20081017365公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2008年11月5日優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日發(fā)明者劉長(zhǎng)明,危艷武,張朝霞,婧袁,陸月華,黃立平申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所