專利名稱：豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性克隆疫苗株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有感染性的高致病性豬繁殖與呼 吸綜合征病毒人工克隆弱毒疫苗株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
ItMMi^IiE (Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 是由PRRS病毒(PRRSV)引起的以妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙及各年齡 階段豬的呼吸道癥狀和高死亡率為主要特征的傳染病，俗稱“豬繁殖與呼吸綜合征”，是OIE 法定報(bào)告的七大豬病之一。從1996年首次發(fā)現(xiàn)以來，一直在我國流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成 巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2006年，一種“豬高熱綜合征”在我國豬群傳播迅速，發(fā)病率為50-100%， 死亡率為20-100 %，對(duì)各種年齡的豬均有發(fā)病死亡，后來證實(shí)此病是由一種變異的PRRSV 引起的，此病毒被稱為高致病性PRRSV。PRRSV是不分節(jié)段、單股、正鏈有囊膜的RNA病毒，基因組全長大約15kb左右，整個(gè) 基因組RNA具有感染性，含有9個(gè)開放閱讀框(ORF)，在5’端有帽子結(jié)構(gòu)，在3’端有poly㈧ 尾，根據(jù)遺傳學(xué)演化分析和血清學(xué)差異可以將PRRSV分為兩個(gè)血清型，分別是以LV株為代 表的歐洲型和以VR-2332為代表的美洲型。而我國的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒與 早期流行的經(jīng)典毒株CH-Ia株相比其核苷酸同源性在94. 9% -95. 4%左右，最具特征的是 在非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2基因區(qū)域存在不連續(xù)的30個(gè)氨基酸的缺失，同時(shí)在5’端與3’端非編碼 區(qū)各有一處核苷酸缺失。由于存在大量核苷酸變異以及堿基缺失等特征，在生物學(xué)特性上 與以往經(jīng)典毒株相比較，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒其細(xì)胞適應(yīng)能力顯著提高，抗 原性增強(qiáng)，在豬體內(nèi)增殖更快，病毒血癥出現(xiàn)的時(shí)間更早，致病性和致死能力明顯增強(qiáng)。目 前高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫情在我國仍然很嚴(yán)重，高致病性PRRSV毒株已經(jīng)成為我 國近年來流行的優(yōu)勢(shì)毒株，其毒力和致病性絲毫沒有減弱的趨勢(shì)。盡管世界各養(yǎng)豬大國對(duì)PRRS都給予了足夠的重視，從1987年P(guān)RRSV被發(fā)現(xiàn)以來， 人們圍繞PRRSV病原生物學(xué)特性、免疫學(xué)特性、致病機(jī)制和疫苗等進(jìn)行了不懈的探索，在對(duì) 病原基因組結(jié)構(gòu)、病毒編碼蛋白特性、與病毒相互作用的宿主細(xì)胞蛋白、抗病毒感染免疫等 方面的研究中也取得了一些較好的進(jìn)展，但是由于PRRSV易發(fā)生變異、能夠造成持續(xù)感染 和免疫抑制，而且具有抗體依賴性增強(qiáng)作用(ADE)等等特征都成為目前控制PRRS的主要障 礙。再加上我國目前存在的PRRSV毒株呈現(xiàn)多樣化并存的態(tài)勢(shì)，也就是既存在基因組無缺 失的經(jīng)典毒株，又存在NSP2基因編碼區(qū)核苷酸插入毒株，還存在NSP2基因編碼區(qū)核苷酸不 同數(shù)量缺失的變異毒株等等，使我國由PRRSV引起的疫情趨于復(fù)雜化，這樣不僅加重了防 控PRRS的難度，而且給PRRSV的研究也帶來了新的挑戰(zhàn)。目前對(duì)該病的控制手段主要依靠疫苗免疫，疫苗免疫可以有效的降低該病的傳 播，其中PRRS滅活疫苗具有安全、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是在滅活疫苗的制備過 程中容易造成病原體抗原性減弱，使疫苗的免疫效率降低，而且滅活疫苗的免疫劑量大，成 本高，對(duì)異源毒株免疫效果不理想。弱活疫苗免疫效果好，免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間長，但其安全性仍然令人擔(dān)憂，尤其是對(duì)于我國存在的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征目前尚無較好的疫 苗應(yīng)用于臨床，給我國防控高致病性豬繁殖與呼吸綜合征帶來很大的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決缺乏安全、高效的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的技術(shù)問題， 提供一種具有感染性的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的人工克隆弱毒疫苗株，該疫苗 免疫豬體后21天就可以對(duì)豬抵抗高致病性PRRSV提供完全的免疫保護(hù)，且安全可靠。此外，還需要提供一種上述人工克隆弱毒疫苗株的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種重組載體，包含高致病性豬繁殖與呼吸綜合征 病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的全長基因cDNA序列，該全長基因cDNA序列的5，端加設(shè)有轉(zhuǎn) 錄啟動(dòng)子，且該全長基因cDNA序列內(nèi)部引入標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述載體為pSK載體，該pSK載體內(nèi)部Xhol至NotI的多克隆位點(diǎn)經(jīng)過了 改造(圖1)，改造后的pSK載體具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述全長基因cDNA序列內(nèi)部引入標(biāo)記性的Mlul限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；所述 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子為SP6啟動(dòng)子。優(yōu)選的，所述全長基因cDNA序列的3’末端引入Swa I限制性酶切位點(diǎn)，可用于重 組載體的線性化。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種人工克隆弱毒疫苗株的制備方法，包括以下步 驟將上述重組載體線性化，并將線性化的全長cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成病毒RNA ；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和轉(zhuǎn)染試劑混合后，共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，完成病 毒的包裝；收獲轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，并將其接種病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，救獲感染性的人工克 隆弱毒疫苗株。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種人工克隆弱毒疫苗株，所述人工克隆弱毒疫 苗株是高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HUN4-F112的克隆毒株，在其結(jié)構(gòu)蛋 白基因序列中引入標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述人工克隆弱毒疫苗株具有SEQ ID NO. 2所示的全長基因序列。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述人工克隆弱毒疫苗株在制備預(yù)防或治療 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述人工克隆弱毒疫苗株在制備區(qū)分高致病 性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫毒株與自然感染毒株的產(chǎn)品中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種區(qū)分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的人工克 隆弱毒疫苗株與自然感染毒株的檢測(cè)方法，包括以下步驟針對(duì)引入的標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成特異性引物，通過RT-PCR及進(jìn) 一步的限制性酶切，區(qū)分出人工克隆弱毒疫苗株與自然感染毒株。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種區(qū)分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的人工克 隆弱毒疫苗株與自然感染毒株的檢測(cè)試劑盒，包含針對(duì)引入的標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性引物、標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明人工克隆弱毒疫苗株，不僅在免疫豬體后能對(duì)豬抵抗高致病性PRRSV提供 完全的安全免疫保護(hù)，而且能有效區(qū)分豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫豬與豬繁殖與呼吸綜 合征自然感染豬，滿足臨床上對(duì)高致病性PRRSV疫苗免疫毒株與自然感染毒株的鑒別診 斷，非常有利于高致病性PRRSV的預(yù)防和控制。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例1多克隆位點(diǎn)經(jīng)過改造的PG2SK載體MCS序列示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的PRRSV疫苗株HuM-Fl 12基因組全長cDNA連接策略示 意圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中HuM-Fl 12株各片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例1全長cDNA克隆pSK-HuM-Vac酶切鑒定結(jié)果圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例2克隆毒cHuM-Vac感染Marc_145細(xì)胞后的細(xì)胞病變圖；圖6是本發(fā)明實(shí)施例2利用針對(duì)PRRSV N蛋白單克隆抗體的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢 測(cè)救獲克隆毒的結(jié)果圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例2RT-PCR擴(kuò)增了含基因組標(biāo)記物的片段的酶切結(jié)果圖；圖8是本發(fā)明實(shí)施例2人工克隆毒cHuM-Vac與親本毒HuN4_F112株生長曲線比 較圖；圖9是本發(fā)明實(shí)施例3人工克隆疫苗毒cHuM-Vac免疫后ELISA檢測(cè)抗體水平變 化圖；圖10是本發(fā)明實(shí)施例3利用RT-PCR結(jié)合MluI酶切鑒別診斷免疫豬與自然強(qiáng)毒 感染豬的電泳圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍的譯.北京 科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。由于PRRS的滅活疫苗和減毒活疫苗均有缺點(diǎn)和不足，因此利用新的技術(shù)手段研 制PRRS新型疫苗勢(shì)在必行。本實(shí)驗(yàn)室?guī)啄昵胺蛛x到一株高致病性PRRSV毒株HuN4，與經(jīng)典 的美洲型毒株VR-2332序列相比在Nsp2基因的第483位和535 563位氨基酸發(fā)生缺失， 是一株典型的PRRSV強(qiáng)毒變異株。通過將高致病性PRRSV強(qiáng)毒HuM株體外傳代致弱獲得的 減毒活疫苗株HuN4-F112，由大量臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)所獲得的HuN4-F112弱毒疫苗株具有很好 的免疫保護(hù)力，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物可以抵抗致死性強(qiáng)毒攻擊而不出現(xiàn)高致病PRRS的臨床癥狀(專 利號(hào)為200810097546. 8的中國發(fā)明專利)。本發(fā)明正是在此基礎(chǔ)上，利用反向遺傳操作技 術(shù)，采用分段克隆逐一拼接的策略構(gòu)建了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4-F112疫 苗株基因組全長cDNA克隆pSK-HuM-Vac，并在細(xì)胞上拯救出攜帶特征性分子修飾的、具有 感染性的cHuM-Vac人工克隆疫苗毒株，成功構(gòu)建了高致病性PRRSV HuM-Fl 12疫苗株的 感染性克隆，并通過研究證實(shí)該感染性克隆毒株可以作為疫苗毒應(yīng)用于對(duì)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的防制。本發(fā)明所用的反向遺傳操作技術(shù)，其主要策略是將PRRSV基因組通過反轉(zhuǎn)錄得 到病毒cDNA，然后克隆到合適的載體中，將PRRSV基因組全長cDNA置于強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子之 下，如噬菌體T7、T3、SP6啟動(dòng)子。在體外應(yīng)用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成PRRSV病毒基因組 RNA，再用這些體外轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(BHK-21或Marc-145)，在宿主細(xì)胞內(nèi)包裝生成具 有感染性的PRRSV病毒粒子。利用反向遺傳操作技術(shù)，本發(fā)明成功構(gòu)建了 PRRSV弱毒疫苗株HUN4-F112全長 基因的pSK-HuM-Vac全基因cDNA克隆，并人工救獲了高致病性PRRSV-F112弱毒疫苗株 cHuM-Vac，其內(nèi)部基因骨架主要是來源于由我國高致病性PRRSV代表性毒株HuN4株在 體外連續(xù)傳代致弱獲得的弱毒疫苗株HuN4-F112，通過定點(diǎn)突變等人工基因修飾技術(shù)在克 隆病毒基因內(nèi)部引入了具有獨(dú)特特征的Mlu I酶切位點(diǎn)，該限制性酶切位點(diǎn)在自然流行毒 株的基因組中不存在，是本發(fā)明人工構(gòu)建的感染性克隆毒株特有的標(biāo)志，而且本發(fā)明的構(gòu) 建既不影響病毒復(fù)制和免疫保護(hù)效果，又可以用來區(qū)分疫苗免疫和自然感染人工克隆疫苗 株。本發(fā)明的人工克隆弱毒疫苗株，主要通過以下步驟制得
利用引入的酶切位點(diǎn)將包含HUN4-F112全長cDNA的質(zhì)粒線性化；以上述線性化的全長cDNA質(zhì)粒作為模板，與體外轉(zhuǎn)錄試劑混合，在37°C下進(jìn)行體 外轉(zhuǎn)錄合成病毒RNA ；將上述轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物和轉(zhuǎn)染試劑的混合物共轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，于37°C C02培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，完成病毒的包裝；經(jīng)過48小時(shí)后收獲病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)動(dòng)凍融后取上清，并將其接種病毒 體外增殖許可的宿主細(xì)胞，救獲經(jīng)過體外人工改造的具有遺傳標(biāo)記(Mlu I酶切位點(diǎn))的人 工克隆疫苗毒株，命名為cHuN4-Vac。本發(fā)明人工克隆弱毒疫苗株cHuM-Vac具有高度的細(xì)胞適應(yīng)特性，在細(xì)胞上接毒 后48小時(shí)病毒復(fù)制滴度就可達(dá)到高峰，病毒滴度為106_6TCID50,在連續(xù)20代的傳代過程中， 引入的突變標(biāo)志仍然穩(wěn)定存在。所獲得的人工克隆弱毒疫苗株cHuM-Vac具有良好的免疫 原性，在免疫后第7天就可以檢測(cè)到抗體，第14天抗體水平就達(dá)到最高峰，高水平抗體可以 持續(xù)3-4周，疫苗免疫后對(duì)致死性高致病性PRRSV強(qiáng)毒的攻擊能夠提供完全保護(hù)，免疫豬攻 毒后不發(fā)病，不死亡，不排毒，可達(dá)到與現(xiàn)有的商品化疫苗株同等的免疫保護(hù)效果。針對(duì)引入的突變位點(diǎn)人工合成一對(duì)特異性引物建立RT-PCR檢測(cè)方法，配合限制 性內(nèi)切酶Mlu I作為區(qū)分自然感染與疫苗免疫的鑒別診斷方法，結(jié)果表明從疫苗免疫后第 10天的血液中檢測(cè)到的RT-PCR產(chǎn)物可以被Mlu I切成約為200bp和400bp左右的目的片 段，而從人工感染野毒對(duì)照組血液中檢測(cè)到的RT-PCR產(chǎn)物則不能被其切割。實(shí)施例1豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗株HUN4-F112基因組全長cDNA克隆的構(gòu) 建1.材料與方法1. 1病毒、載體與試劑PRRSV疫苗株F112由本實(shí)驗(yàn)室傳代致弱并保存(童光志等2007 ；Tong GZ et al.， 2007 ；Zhou YJ et al. ,2008 ；Tian ZJ et al.，2009)，克隆載體 pBulescriptll SK (+)購自Fermentas ；RNeasy Plus Mini Kit試劑盒購自QIAGEN ；膠回收試劑盒購自上海華舜生 物科技有限公司；SupersciptIII逆轉(zhuǎn)錄酶和Platinum pfx DNA聚合酶購自Invitrogen ； RNase H, T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；DL-15000，DL-2000DNA Marker購自 TakaRa ；其它化學(xué)試劑均是進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。1.2 引物根據(jù)PRRSV HuM株(GenBank登錄號(hào):EF635006)全基因組序列，用Olio 6. 0軟 件設(shè)計(jì)了 6對(duì)涵蓋全基因組序列的引物(由上海英駿生物工程公司合成，序列見表1)，用 無核酸酶的水配置成使用濃度。其中引物F16(sp6)引入pacl酶切位點(diǎn)和RNA聚合酶sp6 啟動(dòng)子核心序列，下游引物R15313中還加入病毒原始序列中不存在的單酶切位點(diǎn)NotI (表 1)，利用引物R14670和F14668將14680位的A突變成G產(chǎn)生一個(gè)MluI酶切位點(diǎn)作為將來 鑒定拯救病毒的基因組標(biāo)記(genomic marker)。表1. PRRSV疫苗株HuN4_F112全基因組cDNA片段擴(kuò)增引物
權(quán)利要求
一種重組載體，其特征在于，包含高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HuN4 F112的全長基因cDNA序列，該全長基因cDNA序列的5’端加設(shè)有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，且該全長基因cDNA序列內(nèi)部引入標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述載體為PSK載體，具有SEQID NO. 1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述全長基因cDNA序列內(nèi)部引入標(biāo) 記性的Mlul限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
4.一種人工克隆弱毒疫苗株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟將權(quán)利要求1所述重組載體線性化，并將線性化的全長cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成病毒RNA ；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和轉(zhuǎn)染試劑混合后，共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，完成病毒的 包裝；收獲轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，并將其接種病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，救獲感染性的人工克隆弱 毒疫苗株。
5.一種人工克隆弱毒疫苗株，其特征在于，所述人工克隆弱毒疫苗株是高致病性豬繁 殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的克隆毒株，在其結(jié)構(gòu)蛋白基因序列中引入標(biāo) 記性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人工克隆弱毒疫苗株，其特征在于，所述人工克隆弱毒疫苗 株具有SEQ ID NO. 2所示的全長基因序列。
7.權(quán)利要求5或6所述的人工克隆弱毒疫苗株在制備預(yù)防或治療高致病性豬繁殖與呼 吸綜合征的疫苗中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求5或6所述的人工克隆弱毒疫苗株在制備區(qū)分高致病性豬繁殖與呼吸綜合 征疫苗免疫毒株與自然感染毒株的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.一種區(qū)分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的人工克隆弱毒疫苗株與自然感染毒株的 檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟針對(duì)引入的標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成特異性引物，通過RT-PCR及進(jìn)一步 的限制性酶切，區(qū)分出人工克隆弱毒疫苗株與自然感染毒株。
10.一種區(qū)分高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的人工克隆弱毒疫苗株與自然感染毒株 的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包含針對(duì)引入的標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性引 物、標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶。
全文摘要
本發(fā)明公開一種人工克隆弱毒疫苗株，該疫苗株是高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的克隆毒株，在其結(jié)構(gòu)蛋白基因序列中引入標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。本發(fā)明還公開了一種重組載體，包含高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的全長基因cDNA序列，該全長基因cDNA序列的5’端加設(shè)有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，且該全長基因cDNA序列內(nèi)部引入標(biāo)記性的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。本發(fā)明的人工克隆弱毒疫苗株，不僅在免疫豬體后能對(duì)豬抵抗高致病性PRRSV提供完全的安全免疫保護(hù)，而且能有效區(qū)分豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫豬與豬繁殖與呼吸綜合征自然感染豬，有利于高致病性PRRSV的預(yù)防和控制。
文檔編號(hào)A61P31/14GK101984061SQ20101055900
公開日2011年3月9日 申請(qǐng)日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
發(fā)明者于海, 周艷君, 姜一峰, 張善瑞, 李國新, 童光志 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所