一種對于鼠具有感染性的人腸道病毒71型病毒突變株的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于病毒學領域；更具體地，本發(fā)明涉及一種對于鼠具有感染性的人腸道病毒71型病毒突變株。
【背景技術】
[0002]手足口病(Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD)是5歲以下兒童常見的病毒性疫病，患病兒童表現(xiàn)為發(fā)熱、口腔潰瘍、手部足部等處皮膚紅疹，嚴重患兒有呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和神經系統(tǒng)等的病變甚至死亡，人腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CA16)是HFMD的兩個主要致病原[I]。人腸道病毒71型(EV71)是引起我國手足口病的最主要病原體。
[0003]中國最近爆發(fā)的手足口病主要與CA16和EV71有關，其中EV71是導致患者嚴重癥狀和重大死亡的主要病原，目前仍無可用的疫苗和特異的藥物，EV71的單價滅活疫苗雖已經完成三期的臨床試驗[2-4]，但仍存在很多問題，而其他類型的疫苗仍在研發(fā)階段[5]，其中基于病毒樣顆粒的新型疫苗是最有潛力的候選疫苗[5，6]，但面臨動物模型缺乏的問題。目前尚無針對性的預防性疫苗或治療性藥物，也缺乏用于評價疫苗和藥物保護效果的小鼠模型。
[0004]小鼠感染模型為研究病毒的致病機制和宿主的免疫反應提供了可行性手段[7-11]，小鼠感染模型也方便評價疫苗有效性和篩選抗病毒藥物。然而，EV71病毒不能有效感染成年小鼠[I]。因此，缺乏適宜的小動物感染模型大大限制了候選疫苗有效性的評價，本領域亟待盡快解決這一瓶頸問題。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種對于鼠具有感染性的人腸道病毒71型病毒突變株。
[0006]在本發(fā)明的第一方面，提供一種人腸道病毒71型的鼠適應株，所述適應株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號是CCTCC V201343。
[0007]在一個優(yōu)選例中，所述的人腸道病毒71型的鼠適應株對于鼠的致病力強。
[0008]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的人腸道病毒71型的鼠適應株的用途，用于制備試劑，所述的試劑用于制備感染人腸道病毒71型的鼠。
[0009]在一個優(yōu)選例中，所述的感染人腸道病毒71型的鼠用于作為動物模型，評價抗病毒藥物的治療效果。
[0010]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備感染人腸道病毒71型的鼠的組合物，所述的組合物含有所述的人腸道病毒71型的鼠適應株；以及生理學可接受的載體。
[0011]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的組合物的用途，用于制備感染人腸道病毒71型的鼠的試劑盒。
[0012]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備感染人腸道病毒71型的鼠的試劑盒，其中包括所述的人腸道病毒71型的鼠適應株或所述的組合物。
[0013]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【附圖說明】
[0014]圖1、EV71對ICR乳鼠的致病性，2.5X107TCID50的G082腹腔感染I日齡ICR小鼠(n=14)和1.0 X 106TCID50的鼠適應株MAV-W腹腔感染7日齡ICR小鼠(n=7)，感染后觀察小鼠的存亡情況和臨床病征14天。小鼠在感染EV71后的存亡曲線(A)和臨床癥狀分級情況(B)。臨床病征分級如下:0級，健康；1級，反應遲緩；2級，平衡失調，肌無力；3級，癱瘓；4級，死亡。
[0015]圖2、鼠適應株MAV-W腹腔注射，感染2周齡及較小的ICR小鼠，
[0016]不同劑量的鼠適應株MAV-W腹腔注射7日齡和14日齡的ICR小鼠后的存亡曲線
(A)和臨床癥狀分級(B)。臨床病征分級如下:0級，健康；1級，反應遲緩；2級，平衡失調，肌無力；3級，癱瘓；4級，死亡。
[0017]圖3.G08-MAV感染c57小鼠，2.5X107TCID50的G082腹腔注射感染I日齡c57小鼠(n=6)，鼠適應株MAV-W腹腔注射感染7日齡c57小鼠(n=ll)后的死亡曲線㈧和臨床癥狀分級(B)。臨床病征分級如下:0級，健康；I級，反應遲緩；2級，平衡失調，肌無力；3級，癱瘓；4級，死亡。
[0018]圖4、利用MAV-W評價EV71單抗D5的抗病毒保護效果。三組7日齡ICR乳鼠腹腔注射鼠適應株獻￥-1(5父1051'(:1050)，2411后三組分別腹腔注射？83、對照抗體(10 μ g/g)和EV71特異單抗D5 (10 μ g/g)。之后連續(xù)14天每天記錄各組的臨床癥狀評分(A)和死亡率
(B)。臨床病癥分級如下:0級，健康；1級，反應遲緩；2級，平衡失調，肌無力；3級，癱瘓；4級，死亡。其中對照抗體為HBsAg特異的單抗。
【具體實施方式】
[0019]本發(fā)明人通過在小鼠體內連續(xù)傳代人腸道病毒71型(EV71)G082分離株，獲得一個鼠適應性的突變株，命名為MAV-W，并在已建立的小鼠感染模型中評價了 EV71單抗對病毒攻擊小鼠的有效保護作用。本發(fā)明的毒株為評價候選疫苗和藥物的有效性以及研究EV71的致病機制提供了有效途徑。
[0020]與親本株G082相比，本發(fā)明獲得的MAV-W病毒對小鼠的致病性增強，MAV-W腹腔接種7日齡和14日齡ICR小鼠后引起共濟失調、癱瘓等典型神經癥狀和較高死亡率，MAV-W腹腔感染7日齡c57小鼠，也出現(xiàn)嚴重癱瘓和死亡。因此，本發(fā)明的MAV-W病毒非常適合用于制備動物EV71感染模型，應用于科學研究。
[0021]應用本發(fā)明的MAV-W病毒制備的動物感染模型，其病情變化顯著、利于觀察和評估。適合應用于對一些潛在治療病毒感染的藥物進行療效評估。在本發(fā)明的實施例中，利用基于MAV-W的EV71小鼠感染模型，發(fā)現(xiàn)EV71中和性抗體能夠有效保護被病毒攻擊的小鼠。
[0022]本發(fā)明還提供了一種組合物，含有有效量所述的人腸道病毒71型的鼠適應株以及生理學可接受的載體。所述“有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述“生理學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質等。
[0023]本發(fā)明還提供了一種用于制備感染人腸道病毒71型的鼠的試劑盒或藥盒，其中含有所述的組合物，或所述的重組載體。
[0024]此外，為了方便給藥，所述的藥盒中還可含有注射用的針，和/或藥學上可接受的載體，和/或使用說明書。
[0025]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0026]1、材料與方法
[0027]細胞和實驗動物
[0028]RD細胞(購自中國科學院細胞庫)和Vero細胞(購自中國科學院細胞庫)用含有10%血清和100U/ml青霉素、ΙΟΟμ g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。ICR和c57孕鼠購于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于上海巴斯德研究所的ABSL2+動物房。
[0029]EV71鼠適應株的建立
[0030]EV71 病毒G082 株(即 Ku Z, Shi J, Liu Q, and Huang Z*.Development of murinemonoclonal antibodies with potent neutralizat1n effects on enterovirus71.J.Virol.Methodsl86 (2012) 193-197 中的 EV71/G082 病毒株)在 RD 細胞上擴增，按照Reed-Muench法在RD細胞上測定病毒滴度TCID50為5.0X 108/ml，該分離株病毒通過腹腔感染一日齡的ICR小鼠，取一只出現(xiàn)明顯癱瘓的小鼠腦組織，加入Iml冷的無菌PBS溶液后碾磨勻衆(zhòng)，反復凍融三次后，4000rpm/min在4°C離心30min,0.45 μ m濾器過濾,取上清液，在Veix)細胞上傳代一次，腹腔注射I日齡的ICR小鼠，取一只病死的小鼠腦組織，同上處理后在Vero細胞上傳代,如此反復進行在小鼠體內和Vero細胞上進行四個循環(huán),最終篩選獲得一株鼠適應的EV71病毒，命名為EV71-G082-Mouse Adapted Virus-W(MAV-W)，分裝后_80°C保存，并在Vero細胞測定其TCID50值為1.0X 108/ml。
[0031]病毒感染小鼠實驗
[0032]特定日齡的ICR或c57小鼠腹腔注射適當劑量的野生毒株G082或鼠適應株MAV-W,以后每日觀察小鼠的臨床病癥和存亡情況。臨床病癥分級如下:0級，健康；1級，反應遲緩；2級，平衡失調，肌無力；3級，癱瘓；4級，死亡。
[0033]利用MAV-W評價EV71單抗對病毒攻擊小鼠的保護效果
[0034]三組7日齡的ICR小鼠先通過腹腔注射感染MAV-W(5.0X105TCID50)，24h后三組ICR小鼠分別通過腹腔注射PBS、對照抗體(即Ku Z，Shi J，Liu Q，and HuangZ*.Development of murine monoclonal antibodies with potent neutralizat1neffects on enterovirus71.J.Virol.Methodsl86 (2012) 193 - 197 中的對照抗體)(10 μ g/g)和 EV71 的單抗 D5(即 Ku Z，Shi J，Liu Q，and Huang Z*.Development of murinemonoclonal antibodies with potent neutralizat1n effects on enterovirus71.T.Virol.Methodsl86 (2012) 193 - 197 中的 D5) (10 μ g/g)，之后連續(xù) 14 天每天記錄各組的臨床癥狀評分和死亡率。臨床病癥分級如下:0級，健康；1級，反應遲緩；2級，平衡失調，肌無力；3級，癱瘓；4級，死亡。
[0035]I1、實施例
[0036]實施例1、MAV-W對小鼠的致病力顯著增強
[0037]為比較G082和MAV-W對小鼠的致病力，將2.5 X 107TCID50的G082腹腔感染I日齡ICR小鼠，1.0X 106TCID50的鼠適應株MAV-W腹腔感染7日齡ICR小鼠，小鼠的死亡率分別為0%和85.7%(圖1A)，G082感染的I日齡小鼠約64%(9/14)出現(xiàn)運動失調，僅7%(1/14)的小鼠出現(xiàn)癱瘓。而7日齡的小鼠在感染1.0X106TCID50的MAV-W后表現(xiàn)出反應遲緩、共濟失調、腿無力繼而發(fā)生癱瘓甚至死亡的臨床病癥(圖1B)，感染后第5天開始出現(xiàn)癱瘓，約85.7%(6/7)的小鼠出現(xiàn)癱瘓