專利名稱：腸道病毒71型cDNA感染性克隆、其構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及RNA病毒拯救技術(shù)，具體地說，涉及腸道病毒71型cDNA感染性克隆、 其構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道病毒(Enterovirus) 71型(EV71)屬于小核糖核酸病毒科,腸道病毒屬?；蚪M為單股正鏈RNA。EV71主要感染5歲以下的兒童，通過糞-口途徑或飛沫進行傳播，其感染主要弓I起手足口病(HFMD)，在臨床上與柯薩奇病毒A16感染所引起的手足口病難以區(qū)別。嚴重的EV71感染還能引起無菌性腦炎、腦膜腦炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹以及心肌炎和肺水腫等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，導致重癥甚至死亡病例的發(fā)生。EV71自1969 年首次由Schmidt等從加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標本中分離出來后， 已在世界范圍內(nèi)引起十多次的爆發(fā)和流行。近年來，EV71的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢， 令人關(guān)注的是該地區(qū)的EV71感染引起越來越嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。2008年和2009年以EV71感染為主的手足口病在中國大陸多個省市流行，共導致479名兒童死亡。目前尚無治療EV71感染的特效藥物，主要通過對癥治療控制病情的發(fā)展。應(yīng)用反向遺傳學技術(shù)構(gòu)建RNA病毒的感染性克隆，比傳統(tǒng)的細胞傳代方法制備病毒的安全性高，并且可以避免病毒在傳代過程中引入的突變。此外通過基因工程的技術(shù)手段可以容易地實現(xiàn)對病毒基因組的改造，如定點突變、重組、缺失和嵌合等，為闡明病毒的致病機制，研發(fā)新的抗病毒藥物及獲得新的疫苗候選株奠定重要的基礎(chǔ)。Racaniello VR和Baltimore D于1981年首次利用反向遺傳學技術(shù)構(gòu)建了脊髓灰質(zhì)炎病毒的cDNA感染性克隆，提供了在DNA水平上研究RNA病毒的可能。2005年，Arita 等構(gòu)建了 EV71標準株BrCr的一系列變異體的感染性克隆，研究了在猴子模型中，決定溫度敏感性的突變位點對病毒神經(jīng)毒力的影響。近年來，中國大陸時有EV71的流行爆發(fā)，迫切需要構(gòu)建出能夠代表我國EV71流行株特點的感染性克隆，為研究EV71的致病機理和抗病毒藥物提供技術(shù)支持。缺乏我國EV71流行株的感染性克隆以及EV71的快速變異，使得利用傳代病毒進行藥效評價的結(jié)果可靠性差，成為影響抗EV71藥物研發(fā)的主要技術(shù)瓶頸。因此構(gòu)建我國EV71流行株的感染性克隆，將填補我國EV71標準株的空白，并為抗EV71病毒藥物的研發(fā)及EV71疫苗的研發(fā)奠定重要基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供腸道病毒71型流行株的cDNA感染性克隆、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其是通過反向遺傳操作技術(shù)獲得的腸道病毒71型SZ98 pro株的cDNA感染性克隆。所述腸道病毒71 型SZ98 pro株是中國深圳98的實驗室傳代株(SZ98 pro)。前述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所
3示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，將第215位Ρι·ο替換為His，或?qū)⒌?62位Glu替換為Gly，均不會影響其功能。前述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。本發(fā)明還提供一種構(gòu)建上述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的方法，其是以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，通過RT-PCR得到全長cDNA克隆。本發(fā)明還提供含有上述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的載體。優(yōu)選地，出發(fā)載體為 pBR322。本發(fā)明還提供含有上述載體的宿主細胞,其為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) SZ98 pro/pBR322/DH5 α，已于2011年12月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為 CGMCC No. 5659。本發(fā)明還提供制備腸道病毒71型SZ98 pro株的拯救病毒的方法，首先對腸道病毒71型SZ98 pro株進行了全基因組測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計用于構(gòu)建cDNA克隆的引物和酶切位點，通過引物在基因組cDNA的5’端引入T7啟動子，在其3’端引入polyA尾，然后以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，進行RT-PCR反應(yīng)，得到全長cDNA克隆，酶切線性化后利用T7聚合酶系統(tǒng)進行體外轉(zhuǎn)錄，用體外轉(zhuǎn)錄出的RNA轉(zhuǎn)染vero細胞，獲得拯救病毒。本發(fā)明進一步提供上述腸道病毒71型cDNA感染性克隆在制備抗EV71病毒藥物及疫苗中的應(yīng)用，并通過對感染性克隆進行基因工程改造，以更好地闡明病毒的致病機制， 研究抗病毒的策略。本發(fā)明構(gòu)建的我國EV71流行株的感染性克隆，填補了我國EV71標準株的空白，為抗EV71病毒藥物的研發(fā)及EV71疫苗的研發(fā)奠定重要基礎(chǔ)。通過對感染性克隆的基因工程改造，可以更好地闡明病毒的致病機制，研究抗病毒的策略。


圖I為SZ98與SZ98 pro序列對比結(jié)果。圖2為通過比對24株EV71的結(jié)構(gòu)蛋白VPl的基因序列繪制的系統(tǒng)進化樹。圖3為用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外轉(zhuǎn)錄得到的EV71病毒基因組的RNA到vero細胞24h后， 觀察到的CPE結(jié)果。圖4為接種SZ98 pro株拯救病毒的vero細胞經(jīng)裂解后,離心所得上清的western blotting.結(jié)果。圖5為用SZ98 pro株拯救病毒接種vero細胞后的病毒增殖曲線。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例I腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組測序與序列分析根據(jù)EV71基因組的保守序列設(shè)計了 9對通用引物對腸道病毒71型中國深圳98的實驗室傳代株，即SZ98 pro株進行基因組測序。使用DNAStar軟件對SZ98株與其實驗室傳代株的基因組序列包括5’ -NTR區(qū)、3’ -NTR區(qū)和蛋白編碼區(qū)的序列以及由其編碼的蛋白氨基酸序列進行分析和比對，SZ98與SZ98 pro序列對比結(jié)果如圖I所示。從GenBank提取 EV71其他株的基因組序列進彳丁對比。SZ98株與其實驗室傳代株的基因組序列一致為96%, 其中5’-UTR區(qū)的一致性為98%，3’-UTR區(qū)的一致性為93 %。兩者編碼的多聚蛋白氨基酸序列的一致性為97%。通過比對24株EV71的結(jié)構(gòu)蛋白VPl的基因序列，應(yīng)用MeGa3. I軟件繪制系統(tǒng)進化樹(圖2)。實施例2腸道病毒71型SZ98 pro株的全長cDNA克隆的構(gòu)建根據(jù)測序結(jié)果和選擇的酶切位點設(shè)計了 2對引物，5’端上游引物Sal-T7_EV71+ 引入T7啟動子序列及Sal I酶切位點，3’端下游引物Hind-End-引入37個Poly(T)及 HindIII酶切位點。由Sangon公司合成。用Trizol提取病毒基因組RNA。用長片段逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV Reverse Transcriptase (貨號M1705,購自 Promega 公司)以病毒基因組 RNA 為模板，以3’端下游引物Hind-End-為反轉(zhuǎn)錄引物，42°C反應(yīng)2h反轉(zhuǎn)錄全長cDNA，然后用 DNA聚合酶PrimeSTAR(貨號DR010S，購自TaKaRa公司)分兩段進行基因組全長擴增。反應(yīng)產(chǎn)物進行I %瓊脂糖電泳檢測。RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，雙酶切依次連入PBR322 載體，用Sal I和HindIII酶切鑒定是否插入了目的片段，并對陽性克隆進行全長的基因組測序，排除克隆構(gòu)建過程中突變的引入。腸道病毒71型SZ98 pro株的全長cDNA克隆， 其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，由其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。用構(gòu)建好的含有腸道病毒71型SZ98 pro株全長cDNA克隆的pBR322載體轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DH5 α，得到 SZ98pro/pBR322/DH5 α，保藏號 CGMCC No.5659。實施例3體外轉(zhuǎn)錄與細胞轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)待vero細胞(非洲綠猴腎細胞)生長為單層，用PBS清洗細胞面3次。 用O. 25%的胰酶消化細胞，待細胞變圓時終止消化，將胰酶吸出，立即加入含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打瓶底，使細胞完全脫離瓶底并分散為單細胞懸液。血球計數(shù)板計數(shù)后，用培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為2 X IO5個/ml，六孔板每孔接種2ml，置37 °C，5 % CO2孵箱培養(yǎng)。24h后(細胞豐度為80% )用于RNA轉(zhuǎn)染。體外轉(zhuǎn)錄與細胞轉(zhuǎn)染用HindIII對病毒cDNA克隆的3’端進行酶切，得到線性化的DNA模板,酹-氯仿抽提純化后用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MEGA script High Yield Transcription Kit (貨號AM1334,購自 Ambion 公司)在體外轉(zhuǎn)錄出 RNA,用 Trizol 進行提取和純化。vero細胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，接種六孔板24h后，換成不含血清的DMEM培養(yǎng)基，用Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染，每孔轉(zhuǎn)染2 μ g RNA。轉(zhuǎn)染后每天觀察細胞，可見典型的CPE，部分細胞圓縮、脫落(圖3，A為病毒轉(zhuǎn)染后的細胞形態(tài)，B 為細胞對照)。待CPE達75%以上或觀察5d后，收獲細胞及培養(yǎng)液進行鑒定與傳代。實施例4RT-PCR鑒定拯救病毒的特異序列應(yīng)用通用引物2F(1094) (5，-GCAGTGGATAAACCAACGC-3’)和 2R(2116) (5’-ATAGGCTATGAGCATCTTGC-3’)擴增病毒基因組第1094位至2116位核苷酸，通過測序分
析對病毒進行鑒定。實施例5免疫印跡(Western blotting)檢測當六孔板中vero細胞的CPE達到50%時，用Iml預冷的PBS收集細胞并加入細胞裂解液RIPA(購自Promega公司)，冰浴半小時裂解細胞，離心收集上清液，即為細胞與病毒的總蛋白樣品。進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，抗體孵育及ECL顯色。其中一抗為抗EV71鼠單克隆抗體(貨號ab36367,購自abeam公司)，二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgG(貨號SC2031，購自Santa Cruz公司)。免疫印跡結(jié)果(圖4)顯示有EV71的特異結(jié)構(gòu)蛋白VPl和VP2兩條帶。條帶位置與EV71標準株BrCr-TR和BrCr-TS —致。實施例6微量滴定法測定病毒的滴度(TCID5tl)將vero細胞接種至96孔板，按IX IO4個/孔進行接種。2d后細胞長成致密單層。 取待滴定的EV71病毒液進行10倍梯度稀釋，即ICT1 10Λ傾掉96孔板中的生長液，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗2遍。每個稀釋度設(shè)4孔，每孔加100 μ I病毒稀釋液。另設(shè)病毒對照，每孔加病毒原液100 μ I ;細胞對照，每孔加DMEM培養(yǎng)基100 μ I。置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每日觀察細胞的CPE變化并記錄結(jié)果，一般需要觀察5 7天。按Reed-Muench 法或Karber法計算結(jié)果得，收獲的SZ98 pro株拯救病毒液的滴度為7. 51gTCID5(l。實施例7繪制病毒增殖曲線待六孔板vero長至單層，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗細胞面2次，SZ98 pro 株拯救病毒按Μ. O. I = I接種細胞，37°C吸附30min，吸棄病毒接種液。然后六孔板每孔補加2ml含2% FBS的維持液，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在接種病毒后的0h、2h、4h、8h、 12h、24h、36h、48h和72h分別收集病毒培養(yǎng)上清和病毒感染的細胞至EP管中。將病毒液在常溫和_80°C反復凍融3次，使病毒顆粒充分釋放出來。4°C 3000rpm離心15min，去除細胞碎片，上清即為收獲的病毒液。用微量滴定法測定各個時間點收獲的病毒液的滴度，繪制病毒的增殖曲線(圖5)。實施例8利用感染性克隆獲得的拯救病毒篩選抗病毒藥物Vero細胞接種96孔板2d后長至單層，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗細胞面2 次。拯救病毒液用含2% FBS的維持液稀釋至100 μ 1，病毒稀釋液中病毒量為100TCID5Q。 將發(fā)酵液或待測化合物用維持液進行10倍梯度稀釋，然后進行抗EV71活性測定。每個樣品設(shè)有藥效孔和毒性孔。藥效孔加入loo μ I病毒稀釋液和loo μ I藥物稀釋液；毒性孔加 Λ 100 μ I藥物稀釋液和100 μ I維持液。另外設(shè)細胞對照孔(加入200 μ I維持液)和病毒對照孔(加入100 μ I病毒稀釋液和100 μ I維持液)。置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察記錄細胞的病變效應(yīng)(CPE)，分析藥物抗EV71的活性。培養(yǎng)3d后，細胞對照孔無CPE出現(xiàn)，病毒對照孔達100% CPE,以CPE低于50%且無藥物毒性的化合物為初篩陽性結(jié)果，通過后續(xù)的復篩進一步確定其抗EV71的活性。以利巴韋林和干擾素作為陽性藥物對照，結(jié)果表明濃度為10μ g/ml的利巴韋林和10μ g/ml的干擾素對拯救病毒增殖的抑制率均達75%以上。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒71型CDNA感染性克隆，其是通過反向遺傳操作獲得的腸道病毒71型 SZ98 pro株的cDNA感染性克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任一項所述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的方法，其是以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，通過RT-PCR得到全長cDNA克隆。
5.含有權(quán)利要求1-3任一項所述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，出發(fā)載體為PBR322。
7.含有權(quán)利要求6所述載體的宿主細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其為SZ98pro/pBR322/DH5a，保藏號CGMCC No.5659。
9.制備腸道病毒71型SZ98pro株的拯救病毒的方法，其特征在于，首先對腸道病毒 71型SZ98 pro株進行了全基因組測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計用于構(gòu)建cDNA克隆的引物和酶切位點，通過引物在基因組cDNA的5’端引入T7啟動子，在其3’端引入polyA尾，然后以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，進行RT-PCR反應(yīng)，得到全長cDNA克隆，酶切線性化后進行體外轉(zhuǎn)錄，用體外轉(zhuǎn)錄出的RNA轉(zhuǎn)染vero細胞，獲得拯救病毒。
10.權(quán)利要求1-3任一項所述腸道病毒71型cDNA感染性克隆在制備抗EV71病毒藥物及疫苗中的應(yīng)用。全文摘要
本發(fā)明提供了一種腸道病毒71型cDNA感染性克隆、其構(gòu)建方法及應(yīng)用，其是通過反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建的我國EV71流行株的感染性克隆，填補了我國EV71標準株的空白，為抗EV71病毒藥物的研發(fā)及EV71疫苗的研發(fā)奠定重要基礎(chǔ)。通過對感染性克隆的基因工程改造，可以更好地闡明病毒的致病機制，研究抗病毒的策略。
文檔編號C07K14/085GK102604969SQ20121002890
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者岑山, 張永欣, 金奇 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所