專利名稱：豬視黃醇結(jié)合蛋白基因(rbp4)真核表達載體的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真核表達載體的構(gòu)建，具體的說是構(gòu)建了豬視黃醇結(jié)合蛋白基因
的真核表達載體。
背景技術(shù)：
視黃醇結(jié)合蛋白(retinol bindingprotein， RBP)是體內(nèi)將維生素A從肝中轉(zhuǎn)運 至靶組織的特異的運載蛋白。自從1968年Knnai等人首次發(fā)現(xiàn)步并分離出視黃醇結(jié)合蛋 白后，RBP的臨床應(yīng)用就受到廣泛的關(guān)注。它是研究維生素A代謝機制的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子， 也是研究疏水小分子結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)的模型分子。由于RBP半哀期短，生物特異性高，血漿中 RBP含量與多種疾病相關(guān)。維生素A的攝入不足以及由肝病，腎病，多器官功能衰竭或一些 應(yīng)激狀態(tài)引起的復(fù)雜生理和病理變化，都會引起血漿RBP和視黃醇水平的變化。所以在臨 床應(yīng)用上RBP就成為評價營養(yǎng)不良、甲狀腺功能亢進、維生素A缺乏、肝臟疾病和腎功能障 礙的輔助指標。為了得到RBP，目前有兩種方法，一種是從血漿中分離純化，但需樣品量大， 步驟繁瑣，成本昂貴；另一種方法是利用基因工程的方法。其中的酵母基因工程方法具有如 下優(yōu)點1)屬于真核生物，大多具有較高的安全性。2)繁殖速度快，能高密度培養(yǎng)，大規(guī)模 生產(chǎn)，降低基因工程產(chǎn)品成本的潛力。3)采用高表達的啟動子，高效表達目的基因，可誘導 調(diào)控。4)作為真核生物，提供了翻譯后加工和分泌的環(huán)境，使得產(chǎn)物與天然蛋白一樣或類 似。5)酵母菌可在分泌過程中對表達的蛋白進行糖基化修飾。6)不會形成不溶性的重組 蛋白包涵體，易于分離提純。7)能移去起始甲硫氨酸。 豬不僅是我們?nèi)粘Ｉ钪兴M的紅肉的主要來源，更是一種模式動物，可為人
類疾病治療以及新藥開發(fā)等提供試驗素材。通過構(gòu)建豬的視黃醇結(jié)合蛋白基因的真核表達 載體，可以為下一步誘導表達、蛋白純化以及蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述存在的問題，本發(fā)明的目的是利用已有的畢赤酵母真核表達載體，通過
基因工程的方法，構(gòu)建豬的視黃醇結(jié)合蛋白基因的真核表達載體。 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是 首先，對畢赤酵母的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進行了研究。Pichia. pastoris作為一種轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對 外源基因具有一些結(jié)構(gòu)上的限制。第一，在目的蛋白中不能含有PEST(Pro-Glu-Ser-Thr) 這樣的序列，因為這一序列是鈣離子激活的蛋白水解酶的作用底物。第二，在目的蛋白中不 能含有XFXRQ (X-Phe-X-Arg-Gin)和QRXFX (Gln-Arg-X-Phe-X)這樣的序列(其中X為任何 氨基酸)，因為這一序列極易受到溶酶體的切割。為得到分泌型轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，我們選擇含a因 子信號肽序列的pPICZaC作為轉(zhuǎn)錄載體。這要求目的蛋白不能含有a因子信號肽酶切割 序列Glu-Lys-Arg*Glu-Ala*Glu-Ala。氨基酸序列分析證實RBP4中不存在這樣的結(jié)構(gòu)。 在結(jié)構(gòu)上符合Pichia. pastori系統(tǒng)的要求。 其次，對RBP4基因的自身的序列情況進行分析。RBP4基因全長606bp， l_54bp編碼信號肽，55-603bp編碼成熟肽，終止密碼子是TAG,后跟248bp的3' UTR。本試驗在去掉
信號肽后剩下的CDS區(qū)設(shè)計了一對引物，用重組PCR法擴增出目的基因，使其兩端分別帶上
Cla I和Xba I的酶切位點，電泳圖上顯示出一條單一明亮的DNA條帶。 再次，目的基因和載體雙酶切后用T4DNA連接酶連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌
JM109。在LB-Amp+平板上生長。 最后，分別采用了 PCR法，雙酶切法和測序法三種方法進行篩選和鑒定陽性菌落。首先，用自行設(shè)計的引物進行PCR擴增快速篩選陽性菌落，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，菌落能擴增出與目的基因大小相符的基因片段，再用質(zhì)粒pPICZaC上的特征引物(5' AOX引物和3' A0X引物)進行PCR擴增，結(jié)果獲得的片段大小與預(yù)計的相符，大小基本等于載體上AOX基因的大小+插入的外源基因大小。其次，用Cla I和XbaI對從陽性菌落中提取的質(zhì)粒進行雙酶切，得到了兩個片段， 一個是3kb左右的載體和一個600bp左右的外源基因片段。最后，測序結(jié)果也顯示重組質(zhì)粒序列與GenBank中目的片段的序列是一致的。以上這些實驗結(jié)果聯(lián)合證明了目的基因已插入pPICZ a C載體，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。


圖1為表達載體構(gòu)建流程圖。 圖2為RT-PCR擴增RBP4基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中第1，2泳道為PCR產(chǎn)物；C為陰性對照；M為DL2000Marker
圖3為PMD18-T-RBP4雙酶切鑒定結(jié)果。 圖4pPICZa C-RBP4的PCR檢測結(jié)果。圖中M為DL2000 ;第1泳道為P3、 P4引物擴增結(jié)果；第2泳道為P1、P2引物擴增結(jié)果
圖5pPICZ a C-RBP4的雙酶切鑒定結(jié)果。
具體實施例方式
—、實驗材料 1.實驗動物 大白豬1頭，屠宰后取肝臟組織，立即放于液氮中保存。 2.菌株 大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司。 T0P10F'菌株購自Invitrogen公司。 3.分子克隆主要相關(guān)試劑 (l)BamHI、 EcoRI、 HindiII等限制性內(nèi)切酶、rTaq酶、dNTP、 DL2000Marker、
pMD-18T載體連接試劑盒，均購自大連寶生物工程有限公司。 (2) EasySelect 畢赤酵母表達試劑盒購自Invitrogen公司。 (2)酵母基因組提取試劑盒、山梨糖醇購自上海華舜生物工程有限公司。 (3)細菌培養(yǎng)用胰蛋白胨利酵母提取物均購自O(shè)xid公司。 (4)瓊脂糖、溴化乙錠、Tris等購自Sigma公司。 (5)其他試劑均為分析純的國產(chǎn)生化試劑。 (6)E卯endorf管和移液器槍尖等塑料耗材均購自哈爾濱伊事達生物技術(shù)有限公司。 二、實驗方法
( — ) RNA的提取 1.研磨組織樣取100mg組織樣于裝有液氮的研缽中，充分研磨，研磨后加入裝有l(wèi)ml Trizol的EP管中，充分振蕩。 2.分相15-3(TC溫育2-5min以完全解離核蛋白復(fù)合體，2-8 °C 12000rpm離心10min，上清移至新EP管，加0. 2ml氯仿用力搖動15sec， 15_30°C放置2_3min， 12000rpm2-8。C離心15min。 3. RNA沉淀移水相于 一 新EP管，加0. 8ml異丙醇混勻，室溫放置10_15min，2-8°C 12000rpm離心lOmin。4.洗滌RNA沉淀棄上清，加lml 75%乙醇洗滌RNA， 2-8°C 7500rpm離心5min。
5.RNA重溶棄乙醇，離心機甩下液滴并小心吸棄液滴，空氣中干燥或真空干燥5-10min，加適量0. 1% DEPC處理水溶解總RNA。
(二)引物的設(shè)計與合成
1.克隆用引物 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的豬的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP4)的mRNA序列(GenBank登錄號M68860)，用DNAMAN和Primer5. 0軟件在其完整的閱讀框架內(nèi)，去掉信號肽后的核苷酸序列上自行設(shè)計了 1對上、下游引物，同時在上游引入Cla I酶切位點，下游引入XbaI酶切位點
上游引物(Pl)30bp :5'
GAAGCATCG GAGCGCGACTGCCGAGTGAGC—3'
下游引物(P2) 34bp : 5'打TTCTAGAAl CTACAAAATGTTTCTTTCCGATTTG-3'
注引物中加框的堿基為引入的酶切位點序列2.鑒定重組菌用引物
上游引物(P3)21bp :5—-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3—下游引物(P4)27bp :5—-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3—(三)RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
2XBca 1st Buffer 10. 0 ii 1
25,1/L MgS04 4. Oil 1
d證Mixture 1. Oil 1
RNAse Inhibitor (40U/ul) 0. 5 ii 1
BcaBEST Polymerase (22U/ ii 1) 1. 0 ii 1Oligo dT Primer 1. Oil 1
RNA Sample 1. Oil g
RNAse Free dH90 1. 5ii 1
Total
2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件
65 °C lmin
20. Oil 1
4
30°C 5minI15-30min內(nèi)勻速升溫65 °C 25min
98 °C 5min
5°C 5min
(四)RBP4基因成熟肽的cDNA序列克隆和測序1. PCR反應(yīng)體系10XPCR Bufferd證Mixturer-Taq(5U/ii 1)Forward Primer(1Opmo1 /Reverse Primer(1Opmo1,RT—Products
y 1)y 1)
Water
2. 5ii 12. Oil 1
0. 2ii 1
1. Oil 11. Oil 11. Oil 117. 3ii 1
25. Oil 1
7min
30sec
30sec
50sec
lOmin
to 2 25循環(huán)
Total
2. 反應(yīng)條件預(yù)變性94°C
變性94°C退火58°C延伸72°C孵育72°C
4°C
3. PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測及鑒定
反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 ill上樣于1 %瓊脂糖凝膠，同時在一點樣孔中加3. 0 illDNA DL2000Maker作對照，電泳20 30min，在計算機凝膠成像系統(tǒng)上觀察，如果PCR產(chǎn)物無其它雜帶，且擴增片段大小與設(shè)計相符，就可以用于回收、測序。
4. PCR擴增片段的純化 (1)將含目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1. 5ml的離心管中。 (2)按每lOOmg瓊脂糖加入300-600 y 1的比例加入SI液，置55。C水浴10min，使
瓊脂糖塊完全溶化，每2min顛倒混勻一次。 (3)加入1/3S1體積的異丙醇，混勻，55"溫育lmin。 (4)將溶化后的瓊脂糖液移入吸附柱，離心lmin。倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個收集管中。 (5)在吸附柱中加入450iU Wl液，靜置lmin后，離心15sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。
(6)在吸附柱中加入450 ill Wl液，離心15sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱
放入同一個收集管。 (7)離心lmin。 (8)將吸附柱放入一個干凈的1. 5ml的離心管中，在吸附柱的中央加30 Tl液，靜置lmin后，離心lmin。將1. 5離心管中的DNA貯存于-20。C中。
5.PCR回收產(chǎn)物與T載體連接反應(yīng)
:0097] 連接體系如下
:0098] pMD 18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul
:0099] DNA 20_40ng
:0100] Solution 1 5ul
:0101] 加去離子水至 10ul 將上述反應(yīng)液在16t:反應(yīng)30min或14。C過夜。 6.感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法) (1)挑取DH5 a大腸桿菌原種，在LB瓊脂板上劃線培養(yǎng)。 (2)挑取新鮮的單菌落，接種到3ml LB培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)過夜。 (3)取lml培養(yǎng)好的菌液，接種到100ml LB培養(yǎng)基中，37。C 300rpm強烈振蕩培養(yǎng)
2h，使細胞濃度達到5X 107個細胞/ml，此時，細菌的0D6。。 一般在0. 5 0. 6之間，為對數(shù)
生長期。 (4)將培養(yǎng)物在冰上放置10min，轉(zhuǎn)移到2個50ml預(yù)冷的離心管中，4000rpm4t:離
心5min。去上清，倒置離心管，使殘液流盡，回收細菌沉淀。 (5)加入20ml冰預(yù)冷的0. 1M CaCl2懸浮細菌沉淀，然后冰浴30min。 (6)4000rpm，4t:離心10min，去上清，倒置離心管，回收細菌沉淀。 (7)加入4ml 0. lmol/L CaCl2溶液重懸細菌沉淀，這時的細胞可直接用于轉(zhuǎn)化實驗。 (8)加甘油至終濃度為15% 20%，混勻，分裝成200111/份，凍存于-801:。 7.轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞內(nèi) (1)從-7(TC冰箱中取出一管感受態(tài)細胞(200iU感受態(tài)細胞)，在冰上放置10min助溶。 (2)將lOiU連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰上放置30min。 (3)將管放到預(yù)加溫到42t:的水浴鍋中，熱激90sec。 (4)快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻1 2min。 (5)加入400iULB培養(yǎng)基，37t:溫和振蕩(100 150rpm)培養(yǎng)45min，使細菌復(fù)蘇。 (6)取lOOiil菌液鋪于含AMP(100iil/ml)培養(yǎng)基上，37"倒置培養(yǎng)12 16h。 8.陽性菌落的鑒定與培養(yǎng) (1)用記號筆標記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取單菌落。 (2)以單菌落作為模板，加入PCR反應(yīng)液(不含模板)中，用獲得該片段的PCR條
件進行擴增。
(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒別T載體上是否含有目的片段。 (4)若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應(yīng)的單菌落，放入40mlLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中預(yù)先加入O. 1% (V/V)的Amp(100mg/ml)，37t:過夜振蕩培養(yǎng)，用于質(zhì)粒回收。 9.質(zhì)粒DNA的小規(guī)模提取 (1)接種一單菌落于3ml含50ug/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，以37°C 220rpm培養(yǎng)過夜。 (2)取1. 5ml菌液于離心管中，4， OOOrpm離心5min，棄去上清液，收集菌體。
(3)在細菌沉淀中加入250 ill PI液，震蕩至徹底懸浮。 (4)加入250 1 P2液，立即溫和顛倒離心管5_10次以混勻管中液體，室溫靜止4min。 (5)加入350 ii 1 P3液，立即溫和顛倒離心管5_10次以混勻管中液體。 (6) 12， OOOrpm離心10min，將上清液小心移入吸附柱，離心15sec。倒掉收集管中
的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。 (7)向吸附柱中加入500iU Bl液，離心15sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。 (8)向吸附柱中加入500iU Wl液，離心15sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。 (9)向吸附柱中加入500ii1 Wl液，靜止lmin后，離心15sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中，再離心lmin。 (10)將吸附柱放入一個干凈的1. 5ml離心管中，在吸附膜中央加入50iU Tl液，
室溫靜止lmin，離心lmin。將1. 5ml離心管(DNA溶液)-20中。C保存。 10.雙酶切鑒定質(zhì)粒 (1)雙酶切反應(yīng)體系 HindIII 0. 80 ii 1 BamHI 0. 80 ii 1 10 XK Buffer 2. 00 ii 1 H20 13. 4 ill Plasmid 3. 00 ii 1 _ Total 20.0 ill (2)反應(yīng)條件37°C 2 3h。
(3)酶切產(chǎn)物的電泳檢測 制備1 %的瓊脂糖凝膠，把酶切產(chǎn)物20 ii 1全部加到點樣孔中，120V電泳30min，檢測到大小相符的目的基因片段后，將重組質(zhì)粒PMD18-T-RBP4寄往測序公司測序。
(五)RBP4基因真核表達載體的構(gòu)建
1. RBP4基因轉(zhuǎn)錄片段的獲得 以PMD18-T-RBP4質(zhì)粒為模板，進行Clal和Xbal的雙酶切。
(1)雙酶切反應(yīng)體系
Clal 0.80 ill Xbal 0.80 ill 10 XK Buffer2. 00 ii 1 H20 13. 4 ill Plasmid 3. 00 ii 1 _ Total 20.0 ill (2)反應(yīng)條件37。C 2 3h。 (3)濃度測定 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，回收酶切產(chǎn)物，用分光光度計測0D26。的值，并根據(jù)
DNA的濃度=0D26。X稀釋倍數(shù)X50(ng/iU)測出濃度。 2. pPICZ a C載體質(zhì)粒DNA的處理 將載體pPICZ a C用Clal和Xbal酶切。 (1)雙酶切反應(yīng)體系 Clal 0.80 ill Xbal 0.80 ill 10XK Buffer2. 00 ii 1 H20 14. 4 ill Plasmid 2. 00 ii 1 Total 20.0 ill (2)反應(yīng)條件37°C 2 3h。 (3)濃度測定 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，回收酶切產(chǎn)物，用分光光度計測0D26。的值，并根據(jù) DNA的濃度=0D26。X稀釋倍數(shù)X50(ng/iU)測出濃度。 3.構(gòu)建轉(zhuǎn)錄載體pPICZ a C-RBP4 將回收的RBP4基因的PCR產(chǎn)物與pPICZaC載體按3 : l比例混合，作連接反應(yīng)。 (l)連接反應(yīng)體系
:0176] RBP4 1 ii 1
:0177] pPICZ a C Vector 0. 5 ii 1
:0178] 5 X Buffer 3. 0 ii 1
:0179] T41ignase 1.5ul
:0180] H20 14. Oil 1
:0181] _
:0182] total 20.0ul (2)反應(yīng)條件16。C 3 4h。
4.轉(zhuǎn)化和測序 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入T0P10F'菌株，培養(yǎng)基為25 y g/ml的Zeocin 低鹽LB培養(yǎng)基，
挑選陽性克隆雙酶切鑒定。 (1)雙酶切反應(yīng)體系











Cla I 0. 8ii 1
Xbal 0. 8 ii 1
10 XK Buffer 2. 0 ii 1
H20 15. 4 ill
plasmid of pPICZ a C—RBP4 1. 0 ii 1
20. Oil 1
total
(2)反應(yīng)條件37。C 3 4h。
將正確的重組質(zhì)粒pPICZ a C-RBP4送往上海生工測序，檢測插入是否正確。 三、實驗結(jié)果與分析 1.RBP4基因片段的獲得
以肝臟組織總RNA為模板進行RT-PCR，擴增出一條大約550bp的特異性目的條帶， 與預(yù)期條帶551bp大小相符，初步確認為RBP4基因。取陽性重組質(zhì)粒PMD18-T-RBP4分別 用Hindlll和BamHI (載體上的酶切位點)進行雙酶切鑒定，獲得兩個片段，分別為約3kb 的PMD18-T載體和600bp左右的目的片段。測序結(jié)果表明，所擴增的序列與GenBank上公 布的豬RBP4基因序列完全相符，證明所得序列無誤。
2.重組質(zhì)粒pPICZ a C-RBP4的鑒定 以重組質(zhì)粒pPICZ aC-RBP4為模板，用引物Pl、P2和P3、P4進行PCR鑒定，擴增 出一條約1. lkb左右的條帶和一條約550bp左右的條帶。取陽性重組質(zhì)粒分別用Clal和 Xbal (載體上的酶切位點)進行雙酶切鑒定，獲得兩個片段，分別為約3. 6kb的pPICZ a C載 體片段和約550bp的RBP4基因?？寺y序結(jié)果也顯示RBP4基因已經(jīng)插入到正確位置。說 明豬RBP4基因的真核表達載體構(gòu)建成功。
豬的RBP4基因成熟肽氨基酸序列 1 21 41 61 81 101 121 141 161 181
GluArgAspCysArgValSerSerPheArgValLysGluAsnPheAspLysAlaArgPhe SerGlyThrTrpTyrAlaMETAlaLysLysAspProGluGlyLeuPheLeuGlnAspAsn IleValAlaGluPheSerValAspGluAsnGlyHisMETSerAlaThrAlaLysGlyArg ValArgLeuLeuAsnAsnTrpAspValCysAlaAspMETValGlyThrPheThrAspThr
AsnAspAspHisTrpIlelleAspThrAspTyrAspThrTyrAlaAlaGlnTyrSerCys ArgLeuGlnAsnLeuAspGlyThrCysAlaAspSerTyrSerPheValPheAlaArgAsp ProHisGlyPheSerProGluValGlnLysIleValArgGlnArgGlnGluGluLeuCys LeuAlaArgGlnTyrArgLeuIleThrHisAsnGlyTyrCysAspGlyLysSerGluArg AsnlleLeu
權(quán)利要求
一種豬成熟肽RBP4基因真核表達載體，其特征在于豬RBP4基因的重組載體pPICZαC-RBP4，是通過以下方法構(gòu)建獲得的(1)豬RBP4基因全長cDNA的克隆測序取豬的肝臟組織，用Trizol試劑提取總RNA，用BcaBEST試劑盒合成cDNA，連入pMD18-T載體，BamH I和HindIII雙酶切鑒定后，寄往測序公司測序。(2)RBP4基因轉(zhuǎn)錄片段的獲得以PMD18-T-RBP4質(zhì)粒為模板，進行ClaI和XbaI的雙酶切，將酶切下來的片段用膠回收試劑盒回收，用于和pPICZαC的連接反應(yīng)。(3)pPICZαC質(zhì)粒的提取、酶切提取pPICZαC質(zhì)粒后，進行Cla I和XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，用回收試劑盒進行大片段的回收，-20℃?zhèn)溆谩?4)連接RBP4基因片段和pPICZαC載體片段按3∶1摩爾比例，在T4 DNA連接酶的作用下，4℃16小時進行連接反應(yīng)。(5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TOP10F’菌株，培養(yǎng)基為25μg/ml的ZeocinTM低鹽LB培養(yǎng)基，挑選陽性克隆雙酶切鑒定。將正確的重組質(zhì)粒pPICZαC-RBP4送往測序公司測序，檢測插入是否正確。
全文摘要
本發(fā)明涉及豬視黃醇結(jié)合蛋白基因(RBP4)真核表達載體的構(gòu)建，從大白豬的肝臟組織的cDNA中，PCR擴增出豬RBP4成熟蛋白編碼核苷酸序列，產(chǎn)物全長549bp，即為豬RBP4成熟蛋白183個氨基酸序列。構(gòu)建了大白豬RBP4成熟蛋白編碼序列的真核表達載體pPICZαC-RBP4，經(jīng)PCR、酶切和測序檢測分析，片段大小與理論相符，證明構(gòu)建成功。可為進一步表達具有生物活性的豬視黃醇結(jié)合蛋白奠定基礎(chǔ)，也可為深入研究RBP4基因的生物學特性和功能提供一個方便有效的基本材料。
文檔編號C12N15/81GK101724648SQ200810172949
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日 公開號200810172949.發(fā)明者劉娣 申請人:劉娣;張冬杰